Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Gli autori sono grati a DRS. Craig Duvall e Rebecca Cook per l'accesso a dati e risorse di laboratorio per lo svolgimento di questa ricerca. Gli autori sono grati al Vanderbilt Institute for nanoscala Science and Engineering (VINSE) per l'accesso agli strumenti DLS e TEM (NSF EPS 1004083). Gli autori sono grati alla National Science Foundation per aver sostenuto il programma di borse di ricerca graduate (NSF # 1445197). Gli autori sono grati agli istituti nazionali di sanità per il sostegno finanziario (NIH R01 EB019409). Gli autori sono grati al dipartimento di difesa Congressionalmente diretto programma di ricerca medica per il sostegno finanziario (DOD CDMRP OR130302).

1. preparazione e caratterizzazione di si-NPs
<ol><li>preparazione si-NP<ol>
<li>Sciogliere il polimero in tampone di acido citrico da 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. Il polimero può prima essere sciolto con una concentrazione di 10 volte in etanolo per garantire la dissoluzione. Nota: il polimero può essere disciolto a concentrazioni inferiori, ma l'uso a concentrazioni superiori a 3,33 mg/mL può impedire la formazione di NP omogenee.</li>
		<li>Aggiungere siRNA (50 μM in diH2O) per determinare N+<...

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

I si-NPs qui descritti sono formati da un'associazione elettrostatica di siRNA anionica e polimeri cationici in complessi poliioni (polyplexes). La complessazione elettrostatica di siRNA e il blocco DB cationico dei polimeri PEG-DB sono facilitati dalla miscelazione a basso pH (4,0). A pH 4,0, DMAEMA è altamente protonated, e di conseguenza il blocco DB è altamente carico. Questo assicura che i polimeri si dissolvano come unimers in soluzione al contrario di formare micelle e che i complessi DB in modo efficiente con s...

Poiché i siRNA inibiscono la traduzione delle proteine dalle sequenze di mRNA, possono teoricamente essere usati per la droga tutte le patologie conosciute1,2,3,4,5. Tuttavia, l'uso di siRNA in medicina è limitato dal profilo farmacocinetico globalmente scarso delle molecole di siRNA6,7. Quando iniettato per via endovenosa, i siRNA vengono rapidamente cancellati attraverso i reni e/o degradati dalle nucleasi8,9. A causa delle sue grandi dimensioni e della carica negativa, siRNA non può entrare nelle cellule o sfuggire alla via endolysosomiale per accedere al complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) che risiede nel citosol10,11,12, 13. la Così, ampio sforzo si è concentrato sulla progettazione e l'attuazione delle strategie di consegna siRNA14. Questo sforzo si è concentrato principalmente sullo sviluppo di nanoparticelle a base lipidica e polimerica che confezionano siRNA, la proteggono dalla clearance e dalla degradazione in vivo, e avviano l'assorbimento cellulare e la fuga endosomiale attraverso gruppi ionizzabili di ammina cationica. Molti successi pre-clinici sono stati segnalati e, più recentemente, è stato riportato il primo successo clinico per la somministrazione di siRNA epatica basata su nanoparticelle per il trattamento dell'amiloidosi ereditaria da transthyretina (hATTR)15.
Ci sono molti geni che causano il cancro che sono attualmente "ondulabili" dalla farmacologia convenzionale (cioè farmaci di piccole molecole), motivando la progettazione di nanoparticelle polimerica siRNA (si-NPs) per il trattamento del cancro16. Tuttavia, ci sono un insieme separato di parametri di progettazione che devono essere considerati per la consegna non epatica siRNA. Il sistema di erogazione deve proteggere la carica cationica del Polyplex che provoca l'agglutinazione all'interno della circolazione sistemica17,18,19. Per la somministrazione del tumore, in particolare, la stabilità si-NP è essenziale per dotare la lunga circolazione e quindi un aumento dell'accumulo all'interno dei tumori tramite l'effetto di permeabilità e ritenzione potenziata (EPR)20,21. Inoltre, il controllo sulle dimensioni si-NP è essenziale poiché solo le nanoparticelle di circa 20 – 200 Nm di diametro in dimensioni sfruttano EPR22, e più piccoli si-NPS (~ 20 – 50 Nm di diametro) mostrano una migliore penetrazione del tumore su nanoparticelle di dimensioni maggiori e microparticelle23.
Per ovviare a questi vincoli di progettazione aggiuntivi per la somministrazione di tumore sistemico di siRNA dopo somministrazioni endovenose, sono stati sviluppati (Figura 1)24il pH-NPS reattivo. Questi si-NP sono pegilati, o più recentemente, Zwitterionated25, per la carica superficiale neutrale e la resistenza all'adsorbimento proteico e opsonizzazione in circolazione. Poiché non possono affidarsi esclusivamente al carattere cationico per guidare la consegna intracellulare, la fuga endosomiale estremamente efficiente è indispensabile per ottenere un potente silenziamento genico. Di conseguenza, il nucleo di questi si-NPs è composto da un nucleo altamente endosomolitico che è inerte a pH extracellulare (7,4), ma che viene innescato in modo simile a un interruttore nelle condizioni acidificate della via endolysosomiale [pH 6,8 (primi endosomi) – 5,0 ( lisosomi)]. Infine, una miscela di contenuto cationico e idrofobico all'interno del nucleo di si-NPs fornisce sia le forze di stabilizzazione elettrostatiche e Van der Waals, migliorando la stabilità del si-NP nel sangue rispetto ai sistemi semplicemente cationici.
L'integrazione di molte funzioni in un design relativamente semplice è possibile utilizzando la polimerizzazione controllata di trasferimento della catena di addizione reversibile (RAFT) per produrre polimeri con un'architettura complessa e una composizione precisa. Per produrre si-NPs con carica superficiale neutra, pH-reattività, e stabilità NP, zattera è usato per sintetizzare poli (etilene glicole-b-[2-(dimetilammonio) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). PEG-DB è elettrostaticamente complessato con siRNA, formando si-NPs con una corona PEG e DB/siRNA nucleo (Figura 1B). PEG forma uno strato idrofilo inerte e neutralmente caricato sulla corona si-NP. Il blocco DB è costituito da un rapporto molare 50:50 di 2-(dimethylamino) etil metacrilato (DMAEMA) e butile metacrilato (BMA). Cationic DMAEMA elettrostaticamente complessi siRNA caricato negativamente. BMA self-Associates all'interno del nucleo NP da Van der Waals interazioni, aumentando la stabilità NP. Insieme, DMAEMA e BMA impartiscono il comportamento lipidico-lisico del pH-dipendente al blocco polimerico DB. A pH extracellulare, il blocco DB viene sequestrato al nucleo si-NP ed è inerte ai bilayer lipidici. In condizioni acide, come quelle all'interno della via endolysosomiale, la DMAEMA ionizzabile all'interno del blocco DB facilita l'effetto della spugna protonica, dove il buffering endosomiale conduce al gonfiore osmotico e alla rottura26. Inoltre, le frazioni di BMA idrofobica all'interno del blocco DB si integrano attivamente e Lisano i bilayer lipidici, con conseguente potente endosomolisi. Pertanto, siRNA è complessato con PEG-DB per formare si-NPs che sono neutralmente caricati e altamente stabili a pH extracellulare ma che interrompono i bilayer lipidici a pH acido, assicurando la consegna citosolica del payload siRNA.
Qui sono descritte le procedure sperimentali per produrre si-NPs da PEG-DB. I metodi per caratterizzare i parametri fisico-chimici e la bioattività di si-NPs sono presentati e discussi. Al fine di valutare rapidamente la bioattività si-NP, la luciferasi viene utilizzata come gene modello per gli studi di knockdown. Firefly luciferase è la proteina responsabile del ' bagliore ' delle lucciole27. Di conseguenza, le cellule di mammiferi trasfusate con il gene lucciola luciferasi producono un "bagliore" bioluminescente che può essere catturato utilizzando un luminometro per quantificare i livelli di espressione di luciferasi. Qui, usiamo luciferase per valutare la bioattività di si-NP fornendo siRNA contro luciferase e quantificando la corrispondente riduzione della bioluminescenza nelle cellule che esprimono luciferasi rispetto alle cellule che ricevono un siRNA criptato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

Il successo di siRNA come medicina molecolare mirata dipende dalla sua efficace somministrazione citosolica alle cellule all'interno del tessuto della patologia. È stato raggiunto il successo clinico per il trattamento degli obiettivi di malattia epatica precedentemente "non ondulabili" con siRNA. Tuttavia, efficace somministrazione di siRNA tumorale richiede ulteriori considerazioni di progettazione farmacocinetica, tra cui lungo tempo di circolazione, l'evasione degli organi di clearance (ad esempio, fegato e reni), e la penetrazione del tumore e ritenzione. Qui descriviamo la preparazione e la caratterizzazione fisico-chimica/biologica in vitro di nanoparticelle polimeriche progettate per una consegna efficiente del siRNA, in particolare per i tessuti non epatici come i tumori. Le nanoparticelle di siRNA sono preparate con la complessazione elettrostatica di siRNA e il diblock Copolimero Poly (etilene glicole-b-[2-(dimethylamino) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB) per formare complessi poliionici ( polyplexes) dove siRNA è sequestrato all'interno del nucleo Polyplex e PEG forma una corona idrofila, neutralmente caricata. Inoltre, il blocco DB diventa membrana-Lisica come vescicole della via endolysosomiale acidificante (< pH 6,8), innescando la fuga endosomiale e la somministrazione citosolica di siRNA. Sono descritti i metodi per caratterizzare le caratteristiche fisico-chimiche delle nanoparticelle di siRNA, come la dimensione, la carica superficiale, la morfologia delle particelle e il caricamento del siRNA. La bioattività delle nanoparticelle di siRNA viene misurata utilizzando la luciferasi come gene modello in un saggio di silenziamento genico rapido e ad alto rendimento. I disegni che superano questi test iniziali (come i poliplexi basati su PEG-DB) sono considerati appropriati per la traduzione in studi preclinici sugli animali che valutano la somministrazione di siRNA a tumori o altri siti di patologia.

Alcune caratteristiche essenziali di efficace si-NPs per la consegna in vivo siRNA sono la dimensione corretta (~ 20 – 200 Nm di diametro), siRNA imballaggio, e la bioattività di silenziamento genico. Anche se questo non è un elenco esaustivo (come affrontato nella discussione), queste caratteristiche di base devono essere confermate prima di considerare ulteriori test di una formulazione.
La Figura 2</s...

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Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Sono presentati metodi per preparare e caratterizzare le proprietà fisico-chimiche e la bioattività delle nanoparticelle siRNA reattive al pH neutralmente caricate. Sono discussi i criteri per le nanomedicine siRNA di successo come le dimensioni, la morfologia, la carica superficiale, il carico di siRNA e il silenziamento genico.

Preparazione di nanoparticelle polimeriche neutralmente cariche e sensibili al pH per la consegna del siRNA citosolico

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

L'attuale protocollo è significativo perché consente ai ricercatori di produrre nanoparticelle cariche di siRNA e di caratterizzare adeguatamente queste nanoparticelle per garantire la loro idoneità alla somministrazione agli animali prima di studi successivi. Il vantaggio di questo approccio è quello di produrre nanoparticelle che aumentano la biodisponibilità del siRNA e di produrre nanoparticelle che sono cariche in modo neutro e quindi adatte alla somministrazione sistemica. Questa tecnica ha un impatto perché le nanoparticelle di siRNA possono essere applicate per trattare una miriade di malattie che richiedono una somministrazione sistemica tra cui cancro, malattie cardiovascolari e disturbi autoimmuni, tra gli altri.Per iniziare, sciogliere il polimero in etanolo a una concentrazione di 33,3 milligrammi per millilitro e mescolare per garantire la dissoluzione. Quindi utilizzare una pipetta per trasferire la soluzione polimerica in tampone di acido citrico millimolare da 10 millimolare per raggiungere una concentrazione di 3,33 milligrammi per millilitro. Aggiungere acqua distillata in un tubo contenente un piccolo RNA interferente per ottenere una concentrazione di 50 micromolari.Mescolare accuratamente il polimero e le piccole soluzioni di RNA interferente in un tubo tubazione su e giù per ottenere un rapporto azoto-fosfato di 10. Posizionare il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di tampone di fosfato millimolare a pH otto al tubo per ottenere una concentrazione di 0,28 milligrammi per millilitro e mescolare delicatamente pipettando o invertendo il tubo.Per confermare che il pH finale è neutro, intorno a 7,2 a 7,5, pipetta 10 microlitri della piccola soluzione di nanoparticelle di RNA interferenti sulle strisce di prova del pH. In primo luogo, preparare un campione dinamico di dispersione della luce filtrando un millilitro di piccole nanoparticelle di RNA interferenti alla concentrazione di 0,28 milligrammi per millilitro attraverso filtri a siringa di dimensioni dei pori di 0,45 micrometri in una cuvetta quadrata di quarzo o polistirolo. Quindi registrare le misure di dimensione e carica superficiale utilizzando uno strumento di dispersione dinamica della luce secondo le specifiche del produttore.Per confermare le dimensioni e la morfologia delle piccole nanoparticelle di RNA interferenti usando la microscopia elettronica a trasmissione, aggiungere prima cinque microlitri di piccola soluzione di nanoparticelle di RNA interferente filtrata a 0,28 milligrammi per millilitro ad ogni griglia TEM. Posizionare le griglie a temperatura ambiente per 60 secondi. Asciugare con carta da filtro per tre secondi.Aggiungere quindi cinque microlitri di soluzione di acetato di 3%uranil a ciascuna griglia e incubare per 20 secondi. Asciugare per tre secondi. Quindi posizionare le griglie in un essiccatore per asciugare durante la notte prima dell'imaging sotto microscopia elettronica a trasmissione.Per eseguire il ritardo del gel di agarosio, aggiungere prima due grammi di polvere di agarosio di grado elettroforesi a 100 millilitri di tampone 1X Tris-acetato-EDTA a pH otto in un bicchiere per produrre gel di agarosio al 2%. Mescolare per sospendere l'agarosio. Posizionare il becher scoperto in un forno a microonde per riscaldare per uno o tre minuti fino a quando tutto l'agarosio non viene sciolto.Una volta raffreddato, aggiungere cinque microlitri di bromuro di etidio alla concentrazione di 10 milligrammi per millilitro nel becher e mescolare bene. Quindi versare l'agarosio in un vassoio di gel e posizionare il pettine per produrre pozzi. Lasciare asciugare il gel per 30 minuti.Rimuovere con cura il pettine per lasciare i pozzatti di carico e versare 1X Tris-acetato-EDTA tampone nel vassoio gel per riempire alla linea di riempimento massima. Quindi posizionare due aliquote microliter di colorante di carico senza SDS o agenti riducenti su pellicola di paraffina per ogni piccola formulazione di nanoparticelle di RNA interferente a diversi rapporti azoto-fosfato. Pipetta per mescolare 10 microlitri di piccola soluzione di nanoparticelle di RNA interferente con colorante di carico su pellicola di paraffina.Aggiungere la miscela ai pozzi di gel di agarosio. Collegare il sistema di elettroforesi a un alimentatore ed eseguire la sorgente di tensione a 100 volt per 35 minuti o fino a quando i campioni non hanno attraversato l'80% della lunghezza del gel. Trasferire il gel dal vassoio a un transilluminatore UV e visualizzare le piccole bande di RNA interferenti sul transilluminatore UV secondo le specifiche del produttore.Determinare il rapporto ottimale azoto/fosfato in base alla scomparsa di piccole bande di RNA interferenti sul fondo del gel. Per abbattere il modello gene luciferasi, le prime cellule che esprimono luciferasi di semi in una piastra con pareti nere a 96 pozzi con DMEM nel 10%FBS ad una densità di 2.000 cellule per pozzo. Posizionare la piastra in un'incubatrice durante la notte per consentire alle cellule di aderire.Al mattino rimuovere i mezzi e aggiungere 10 microlitri per pozzo di piccole nanoparticelle di RNA interferenti diluite in mezzi sieri completi per una piccola concentrazione finale di RNA interferente di 100 nanomolari. Restituire i pozzi all'incubatrice per 24 ore per trattare le cellule con piccole nanoparticelle di RNA interferenti. Il giorno successivo, sostituire i supporti con mezzi sieri completi contenenti 150 microgrammi per millilitro D-luciferina.Incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti prima di misurare la luminescenza su un lettore di piastre. Quindi ripetere il ristoro multimediale due volte con mezzi di siero freschi e pieni senza D-luciferina, seguiti da incubazione per 24 ore. Sostituire il supporto con mezzi sieri completi contenenti 150 milligrammi per millilitro D-luciferina e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Misurare la luminescenza al punto di 48 ore. Per studi longitudinali, lasciare il coperchio sopra la piastra del pozzo quando si è all'esterno dell'armadio di biosicurezza per mantenere le cellule in condizioni sterili e continuare l'incubazione dopo aver sostituito i mezzi contenenti luciferina con mezzi freschi e pieni. Le misurazioni dinamiche dello scattering della luce mostrano che una piccola nanoparticella di RNA interferente ha un diametro medio di 35 nanometri.La presenza di un singolo picco con larghezza di picco stretta indica distribuzione unimodale e bassa polidispersità. Le misurazioni TEM confermano che la misurazione delle dimensioni dallo scattering dinamico della luce suggerisce la presenza di una popolazione uniforme di piccole nanoparticelle di RNA interferenti e rivelano la morfologia sferica delle piccole nanoparticelle di RNA interferenti. Una concentrazione troppo elevata di polimero nella fase di preparazione ha portato a piccole nanoparticelle di RNA interferenti due con diametro indesiderato superiore a 200 nanometri, una popolazione multimodale e polidispersa e aggregati in soluzione che non formano morfologia distinta delle particelle.Entrambe le piccole nanoparticelle di RNA interferenti una e due mostrano una carica superficiale neutra indicata da valori potenziali zeta medi vicini allo zero. Il test di ritardo del gel di agarosio mostra la scomparsa di piccole bande di RNA interferenti sul fondo del gel che indica la complessità di piccoli RNA interferenti in polimero. Il piccolo RNA interferente complesso polimerico non è in grado di migrare attraverso il gel e viene quindi visualizzato nella parte superiore del gel vicino ai pozzi di carico.Man mano che il rapporto azoto/fosfato aumenta la piccola complessità dell'RNA interferente aumenta come indicato dalla diminuzione dell'intensità della piccola banda di RNA interferente sul fondo del gel. La piccola nanoparticella di RNA interferente bioattiva mostra un'attività della luciferasi significativamente diminuita rispetto al controllo strapazzato. Al contrario, la piccola nanoparticella di RNA interferente luciferasi due non è considerata bioattiva.Per produrre nanoparticelle di siRNA coerenti con le proprietà fisicochimiche desiderate, si dovrebbero utilizzare soluzioni polimeriche con concentrazioni appropriate e convalidare il pH delle soluzioni tampone in ogni fase del protocollo. Usando questi metodi nella nostra ricerca siamo stati in grado di produrre terapie basate su nanoparticelle di siRNA per geni precedentemente indisciplinabili che causano il cancro e testare l'efficacia di queste terapie in modelli preclitici di cancro al seno.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulazione di nanoparticelle polimeriche diblock attraverso Tecnica Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Ricerca

Bioingegneria

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poroso Silicon microparticelle per consegna di siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polimerici Microneedle Array Fabrication per Fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Realizzazione superidrofobiche Materiali Polimerici per applicazioni biomediche

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...