Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

著者たちは、クレイグ・デュヴァルとレベッカ・クックに感謝し、この研究を行うためのデータとラボ・リソースへのアクセスを担当している。著者たちは、ヴァンダービルト研究所 (VINSE) に DL および TEM (NSF EPS 1004083) 装置へのアクセスを感謝している。著者は、大学院研究フェローシッププログラム (NSF # 1445197) を支援するための全米科学財団に感謝しています。著者は、財政支援のための国立衛生研究所 (NIH R01 EB019409) に感謝しています。著者たちは、Congressionally の金融支援研究プログラム (DOD CDMRP OR130302) の国防総省に感謝しています。

1. si-NPs の準備と特性評価
<ol><li>si-NP 準備<ol>
<li>10 mM クエン酸緩衝液 (pH 4.0) で 3.33 mg/mL でポリマーを溶解させます。ポリマーは、まず溶解を確実にするためにエタノール中の10倍濃度で溶解することができる。 注: ポリマーは、より低い濃度で溶解することができますが、3.33 mg/mL 以上の濃度で使用すると、均質な NP 形成を防ぐことができます。</li>
		<li>SiRNA (diH の50μ m) を加えて?...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. 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R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

ここで説明する si NPs は、アニオン性 siRNA とカチオン化ポリマーの静電的な関連によってポリイオン複合体 (polyplexes) に形成される。SiRNA の静電錯化、および PEG − DB ポリマーのカチオン DB ブロックは、低 pH (4.0) で混合することにより促進される。PH 4.0 では、DMAEMA は高度にプロトン化されており、その結果、DB ブロックが高充電されます。これにより、ポリマーが unimers として溶解し、ミ?...

Sirna は、mRNA 配列からのタンパク質の翻訳を阻害するので、理論的にはすべての既知の病理1、2、3、4、5に薬物を使用することができます。しかし、薬における sirna の使用は、sirna 分子6、7の包括的に貧弱な薬物動態学的プロファイルによって制限される。静脈内に注射すると、sirna は腎臓を通して急速に取り除かれ、ヌクレアーゼ8,9によって劣化します。大きいサイズおよび否定的な充満が原因で、siRNA は細胞質10、11、12に常駐する RNA 誘発性サイレンシング複合体 (RISC) にアクセスするためにセルに入るか、または endolysosomal 経路を逃れることができません。 13.したがって、広範な努力は、siRNA 送達戦略14の設計および実施に焦点を当ててきた。この取り組みは、siRNA をパッケージングする脂質およびポリマーベースのナノ粒子の開発に主に焦点を当てており、それをインビボでのクリアランスおよび分解から保護し、ionizable、カチオンアミン基を介して細胞取り込みおよびエンドソームエスケープを開始する。多くの臨床上の成功が報告されており、最近では、遺伝性 transthyretin 媒介性 (hATTR) アミロイドーシス15を治療するためのナノ粒子系肝 siRNA 送達について最初の臨床的成功が報告されている。
従来の薬理学 (すなわち、低分子薬) によって現在「undruggable」されている多くの癌原因遺伝子があり、癌16を治療するために高分子 siRNA ナノ粒子 (Si-NPs) の設計を動機付ける。ただし、非肝性 siRNA 送達について考慮しなければならない設計パラメータの別個のセットがあります。送達システムは、体循環17、18、19内に凝集を引き起こすポリプレックスのカチオン電荷を遮蔽しなければならない。腫瘍送達のために、具体的には、si − NP 安定性は、長期循環を見識するために不可欠であり、したがって、増強された透過性および保持 (EPR) 効果を介して腫瘍内で蓄積を増加する作用20、21。さらに、si-NP サイズに対する制御は、約20〜 200 nm の直径のサイズをレバレッジ EPR22、およびより小さい Si-NPs (〜 20-50 nm の直径) より大きいサイズのナノ粒子上の腫瘍の浸透を改善し、微粒子23。
静脈内投与後の siRNA の全身性腫瘍送達のためのこれらの追加的な設計制約に対処するために、中立的、pH 応答性 si − NPs が開発されている (図 1)24。これらの si NPs は、ペグ化、または最も最近では、Zwitterionated25、中性表面電荷および循環におけるタンパク質吸着および opsonization に対する耐性のためです。細胞内送達を駆動するためにカチオン性の特性だけに頼ることができないため、強力な遺伝子サイレンシングを達成するためには非常に効率の良いエンドソームエスケープが不可欠です。したがって、これらの si NPs のコアは、細胞外 pH (7.4) で不活性である高 endosomolytic コアで構成されていますが、endolysosomal 経路の酸性化条件でスイッチ状にトリガされます [pH 6.8 (初期エンドソーム)-5.0 (リソソーム)]。最後に、si-NPs のコア内のカチオンと疎水性の含有量の混合物は、静電とファンデルワールスの両安定化力を提供し、単なるカチオン系と比較して、血液中の si-NPs の安定性を改善します。
比較的単純な設計への多くの機能の統合は、可逆的な追加-フラグメンテーション連鎖伝達 (ラフト) 制御された重合を使用して、複合建築と精密組成でポリマーを生成することが可能である。中性表面電荷、pH 応答性、および NP 安定性を備えた si-NPs を生成するために、筏は、ポリ (エチレングリコール-b-[2-(dimethylamino) エチルメタクリレート-共ブチルメタクリレート]) (PEG-DB を合成するために使用されます。図 1a)。PEG-DB は siRNA と複合化された静電的で、PEG 化コロナと DB/siRNA コアを有する si-NPs を形成します (図 1b)。PEG は、si-NP コロナ上に不活性で中立的に帯電した親水性層を形成します。DB ブロックは、2-(dimethylamino) エチルメタクリレート (DMAEMA) およびブチルメタクリレート (BMA) の50:50 モル比で構成されています。カチオン性 DMAEMA 静電的複合体負荷電 siRNA。BMA はファンデルワールス相互作用によって NP コア内で自己アソシエートし、NP 安定性を増加させます。共に、DMAEMA および BMA は DB ポリマーブロックに pH 依存性脂質二重膜溶菌挙動を付与する。細胞外 pH では、DB ブロックは si-NP コアに隔離され、脂質りんに対して不活性です。Endolysosomal 経路内のもののような酸性条件下では、DB ブロック内の ionizable DMAEMA はプロトンスポンジ効果を促進し、そこでエンドソームバッファリングは浸透圧膨潤および破裂26につながる。さらに、DB ブロック内の疎水性の BMA 部分は、溶解脂質りんに積極的に統合し、強力な endosomolysis をもたらす。したがって、siRNA は PEG-DB と複合化され、細胞外 pH では中立的で非常に安定であり、酸性 pH でりん脂質を破壊し、siRNA ペイロードの質細胞送達を確実にします。
ここでは、PEG-DB から si-NPs を製造するための実験的手順について説明する。Si-NPs の物理化学的パラメーターと生理活性を特徴付ける方法を紹介し、議論します。Si-NP 生理活性を迅速に評価するため、ノックダウン研究のためのモデル遺伝子としてルシフェラーゼを使用しています。ホタルルシフェラーゼは、ホタル27の「輝き」の原因となるタンパク質です。したがって、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入した哺乳動物細胞は、ルミノメーターを用いて捕捉できる生物発光「グロー」を生成し、ルシフェラーゼ発現のレベルを定量化することができます。ここではルシフェラーゼを用いてルシフェラーゼの生理活性を評価し、それに対して、スクランブル siRNA を受ける細胞と比較して、ルシフェラーゼ発現細胞における生物発光の減少を定量化しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

対象となる分子薬としての siRNA の成功は、病理組織内の細胞へのその効率的なセルゾル送達に依存する。SiRNA を用いて以前に「undruggable」肝疾患を治療するための臨床的成功が達成された。しかしながら、効率的な腫瘍 siRNA 送達には、長い循環時間、クリアランス器官 (例えば、肝臓および腎臓) の回避、および腫瘍の浸透および保持を含むさらなる薬物動態学的設計の考慮が必要性がある。ここでは、効率的な siRNA 送達、特に腫瘍などの非肝組織に対して設計されたポリマーナノ粒子の調製およびインビトロ物理化学/生物学的特性評価について説明する。SiRNA ナノ粒子は、siRNA の静電ビスホスホンとジブロック共重合体ポリ (エチレングリコール-b-[2-(dimethylamino) エチルメタクリレート-共ブチルメタクリレート]) (PEG-DB) によって調製され、ポリイオン錯体を形成します (polyplexes) は、siRNA がポリプレックスコア内に隔離されており、PEG は親水性の中立的を帯びたコロナを形成します。さらに、DB ブロックは、endolysosomal 経路酸性化 (< pH 6.8) の小胞として膜溶菌となり、siRNA のエンドソームのエスケープおよび細胞質送達をトリガする。サイズ、表面電荷、粒子形態、および siRNA ローディングなどの siRNA ナノ粒子の物理化学的特性を特徴付ける方法について説明する。SiRNA ナノ粒子の生理活性は、迅速かつハイスループットな遺伝子サイレンシングアッセイにおけるモデル遺伝子としてのルシフェラーゼを用いて測定される。これらの初期試験 (PEG − DB ベースの polyplexes など) を通過する設計は、腫瘍または他の病理部位への siRNA の送達を評価する前臨床動物研究への翻訳に適していると考えられる。

インビボ siRNA 送達に対する有効な si-NPs のいくつかの本質的特徴は、適切なサイズ (〜20〜 200 nm の直径)、siRNA パッケージング、および生物活性の遺伝子サイレンシングである。これは完全なリストではありませんが (議論で説明されているように)、これらの基本的な特性は、製剤のさらなるテストを検討する前に確認する必要があります。
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Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

中立的の物理化学的性質および生理活性を調製および特徴付ける方法は、pH 応答性 siRNA ナノ粒子が提示される。サイズ、形態、表面電荷、siRNA ローディング、および遺伝子サイレンシングなどの siRNA 品を正常に行うための基準が議論されています。

細胞質 siRNA 送達のための、中立的充電された pH 応答性高分子ナノ粒子の調製

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

現在のプロトコルは、研究者がsiRNAを搭載したナノ粒子を産生し、これらのナノ粒子を適切に特徴付け、その後の研究の前に動物に投与するための適合性を確保することができるため、重要である。このアプローチの利点は、siRNAのバイオアベイラビリティを高めるナノ粒子を生成し、中立的に荷電され、全身投与に適したナノ粒子を生成することである。この技術は、siRNAナノ粒子が癌、心血管疾患、自己免疫疾患などの全身投与を必要とする無数の疾患を治療するために適用することができるので、インパクトがあります。まず、ポリマーを1ミリリットル当たり33.3ミリグラムの濃度でエタノールに溶解し、溶解を確実にするために攪拌する。その後、ピペットを使用してポリマー溶液を10ミリモルクエン酸バッファーに移し、1ミリリットル当たり3.33ミリグラムの濃度に達します。蒸留水を小さな干渉RNAを含むチューブに加え、50マイクロモル濃度を達成します。ポリマーと小さな干渉RNA溶液をチューブに完全に混ぜ合わせ、上下にピペット加工して窒素対リン酸比10を達成します。チューブを周囲温度で30分間置きます。次に、pH 8で10ミリモルリン酸緩衝液1ミリリットルをチューブに加えて、1ミリリットル当たり0.28ミリグラムの濃度を達成し、チューブをピペットまたは反転させることで穏やかに混ぜます。最終的なpHが中性であることを確認するために、7.2〜7.5の周りに、pH試験ストリップ上に小さな干渉RNAナノ粒子溶液のピペット10マイクロリットル。まず、0.45マイクロメートルの細孔サイズシリンジフィルターを通して、1ミリリットル当たり0.28ミリグラムの濃度で小さな干渉RNAナノ粒子の1ミリリットルを正方形のクォーツまたはポリスチレンキュベットに濾過して、動的光散乱サンプルを調製します。その後、メーカーの仕様に従って動的光散乱計を使用して、サイズと表面電荷の測定を記録します。透過型電子顕微鏡を用いた小さな干渉RNAナノ粒子の大きさと形態を確認するために、まず、各TEMグリッドに1ミリリットル当たり0.28ミリグラムで濾過された小さな干渉RNAナノ粒子溶液の5マイクロリットルを各TEMグリッドに加える。周囲温度で60秒間グリッドを配置します。フィルターペーパーで3秒間乾燥させます。次に、3%のウラニル酢酸溶液を5マイクロリットルずつ各グリッドに加え、20秒間インキュベートします。ブロットは3秒間乾燥します。次に、透過型電子顕微鏡の下でイメージングする前に、一晩乾燥するためにデシケータにグリッドを置きます。アガロースゲル遅滞を行うために、まず2グラムの電気泳動グレードのアガロース粉末をビーカー中のpH 8で1Xトリス酢酸-EDTAバッファーの100ミリリットルに2グラム加え、2%アガロースゲルを生成する。アガロースを中断するためにかき混ぜます。電子レンジで覆われたビーカーを置き、すべてのアガロースが溶解するまで1〜3分間加熱します。冷却したら、1ミリリットル当たり10ミリグラムの濃度で臭化エチジウムを5マイクロリットル加えてビーカーによく混ぜます。その後、アガロースをゲルトレイに注ぎ、櫛を置いて井戸を作ります。ゲルを30分間乾燥させます。慎重に負荷ウェルの後ろに残すために櫛を取り外し、最大充填ラインに充填するためにゲルトレイに1Xトリス酢酸-EDTAバッファーを注ぎます。次に、異なる窒素対リン酸比で各小さな干渉RNAナノ粒子製剤に対して、SDSを伴う負荷染料または還元剤をパラフィンフィルムに2マイクロリットルのアリコートを配置する。ピペットは、パラフィンフィルム上の負荷染料と小さな干渉RNAナノ粒子溶液の10マイクロリットルを混合する。アガロースゲルウェルに混合物を追加します。電気泳動システムを電源に差し込み、電圧源を100ボルトで35分間、またはサンプルがゲル長の80%を通過するまで実行します。トレイからUVトランイルミネータにゲルを移し、メーカーの仕様に従ってUVトランイルミネーターの小さな干渉RNAバンドを視覚化します。ゲルの底部にある小さな干渉RNAバンドの消失に基づいて、最適な窒素対リン酸比を決定します。モデル遺伝子ルシメラーゼをノックダウンするために、最初の種子ルシファーゼ発現細胞は、1ウェルあたり2,000細胞の密度で10%FBSのDMEMを有する96ウェル黒壁プレートに含まれる。プレートをインキュベーターに一晩入れ、細胞が付着できるようにします。朝、培地を取り除き、100ナノモルの最終的な小さな干渉RNA濃度のために完全な血清媒体に希釈された小さな干渉RNAナノ粒子のウェルあたり10マイクロリットルを加えます。ウェルをインキュベーターに24時間戻し、細胞を小さな干渉RNAナノ粒子で処理します。翌日、1ミリリットルのD-ルシフェリンあたり150マイクログラムを含む完全な血清培地にメディアを交換してください。プレートリーダーで発光を測定する前に、室温で5分間細胞をインキュベートします。その後、D-ルシフェリンを含まない新鮮なフル血清培地でメディアリフレッシュを2回繰り返し、続いて24時間インキュベーションを行います。1ミリリットルのD-ルシフェリンあたり150ミリグラムを含む完全な血清培地でメディアを交換し、室温で5分間インキュベートします。48時間の時点で発光を測定します。縦方向の研究のために、生体安全キャビネットの外側にウェルプレートの上に蓋をして、無菌状態で細胞を維持し、ルシフェリン含有培地を新鮮な完全培地に置き換えた後もインキュベーションを継続します。動的光散乱測定は、小さな干渉RNAナノ粒子1が平均直径35ナノメートルであることを示している。狭いピーク幅を持つ単一のピークの存在は、単一の分布と低い多分散性を示します。TEM測定は、動的光散乱からのサイズ測定を確認し、小さな干渉RNAナノ粒子の均一な集団の存在を示唆し、小さな干渉RNAナノ粒子の球形形態を明らかにした。調製工程におけるポリマーの濃度が高すぎると、200ナノメートルを超える望ましくない直径の小さな干渉RNAナノ粒子2、マルチモーダルおよび多分散集団、および溶液中の凝集体が明確な粒子形態を形成しない結果となった。小さな干渉RNAナノ粒子1と2の両方のディスプレイ中性表面電荷は、ほぼゼロ平均ゼータ電位値で示される。アガロースゲル位相引きアッセイは、ゲル底部における小さな干渉RNAバンドの消失を示しており、ポリマーへの微小干渉RNAの錯体を示す。ポリマー複合体小さな干渉RNAはゲルを通って移動することができず、したがってローディングウェルの近くのゲルの上部で視覚化されます。窒素対リン酸比が増加するにつれて、ゲル底部の小さな干渉RNAバンドの強度低下によって示されるように、微小な干渉RNA錯体が増加する。生物活性ルシメラーゼは、小さな干渉RNAナノ粒子1は、スクランブル制御と比較して、ルシメラーゼ活性を有意に低下させる。これに対し、ルシメラーゼは小さな干渉RNAナノ粒子2は生理活性とはみなされない。所望の物理化学的特性を有する一貫したsiRNAナノ粒子を製造するためには、適切な濃度のポリマー溶液を使用し、プロトコルの各ステップで緩衝液のpHを検証する必要があります。我々の研究では、これらの方法を用いて、これまで薬物を飲み込めていなかった癌を引き起こす遺伝子に対するsiRNAナノ粒子ベースの治療法を製造し、乳癌の前臨床モデルにおけるこれらの治療法の有効性をテストすることができました。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

あらかじめ設計されたサイズと形状を用いるポリマー繊維およびバイオハイブリッド繊維のマイクロ流体製造

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

回生研究ハーモニックナノ粒子

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

siRNAの治療を送達するための多孔質シリコンマイクロ粒子

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

フォトリソグラフィ法により高分子マイクロニードルアレイの作製

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

バイオメディカル応用のための超疎水性高分子材料を製造します

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

カチオン性およびアニオン性リポソームを用いてCNSへの治療用のsiRNAの送達

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...