Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Forfatterne er takknemlige for DRS. Craig Duvall og Rebecca Cook for tilgang til data og laboratorie ressurser for å gjennomføre denne forskningen. Forfatterne er takknemlige for Vanderbilt Institute for nanoskala Science and Engineering (VINSE) for tilgang til DLS og TEM (NSF EPS 1004083) instrumenter. Forfatterne er takknemlige for National Science Foundation for å støtte Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). Forfatterne er takknemlige for National Institutes of Health for økonomisk støtte (NIH R01 EB019409). Forfatterne er takknemlige for Department of Defense Congressionally regissert Medical Research program for økonomisk støtte (DOD CDMRP OR130302).

1. klargjøring og karakterisering av si-NPs
<ol><li>si-NP Forberedelse<ol>
<li>Oppløse polymer i 10 mM sitronsyre buffer (pH 4,0) ved 3,33 mg/mL. Polymer kan først oppløses ved 10x konsentrasjon i etanol for å sikre oppløsning. Merk: polymer kan oppløses ved lavere konsentrasjoner, men bruk ved konsentrasjoner over 3,33 mg/mL kan forhindre homogen NP-dannelse.</li>
		<li>Legg til siRNA (50 μM i di2O) for å resultere i N+:P- forhold på 10. Bland polymer og siRNA løsninger g...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li><li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+down+the+barriers:+siRNA+delivery+and+endosome+escape.">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle&#8211;mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle&#8211;mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicine:+progress,+challenges+and+opportunities.">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect.">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li><li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawning+era+of+polymer+therapeutics.">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine.">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape,+Stability,+Blood+Circulation+Time,+and+Bioactivity+in+vivo.">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li><li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol.">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li><li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis.">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li><li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+gene:+structure+and+expression+in+mammalian+cells.">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li><li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution,+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy.">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery.">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).</li><li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

Si-NPs beskrevet her er dannet av elektrostatisk sammenslutning av anioniske siRNA og kationiske polymerer i polyion komplekser (polyplexes). Elektrostatisk kompleks av siRNA og kationiske DB blokk av PEG-DB polymerer er tilrettelagt ved å blande ved lav pH (4,0). Ved pH 4,0, er DMAEMA svært protonerte, og følgelig DB blokken er svært ladet. Dette sikrer at polymerer oppløses som unimers i løsning i motsetning til forming miceller og at DB komplekser effektivt med siRNA. Deretter justeres pH-verdien til nøytral (p...

Fordi siRNAs hemme oversettelsen av proteiner fra mRNA sekvenser, kan de teoretisk brukes til narkotika alle kjente patologi1,2,3,4,5. Bruken av siRNA i medisin er imidlertid begrenset av den omfattende, fattige farmakokinetiske profilen til siRNA molekyler6,7. Når injisert intravenøst, siRNAs er raskt tømmes gjennom nyrene og/eller degradert av nukleaser8,9. På grunn av sin store størrelse og negative ladning, kan siRNA ikke gå inn i celler eller unnslippe endolysosomal veien for å få tilgang til RNA-indusert demping kompleks (RISC) som ligger i stoffer10,11,12, 13 i år. Dermed har omfattende innsats fokusert på design og implementering av siRNA leveranse strategier14. Dette arbeidet har i stor grad fokusert på utvikling av lipid-og polymer-baserte nanopartikler som pakke siRNA, beskytte den fra klarering og degradering in vivo, og initiere cellulær opptak og endosomal flykte gjennom ionebyttermembraner, kationiske Amin grupper. Mange pre-klinisk suksesser har blitt rapportert og sist, den første kliniske suksessen er rapportert for nanopartikkel-baserte hepatic siRNA levering til behandling arvelig transthyretin-mediert (hATTR) amyloidose15.
Det er mange kreftfremkallende gener som for tiden er "undruggable" av konvensjonelle farmakologi (dvs. små molekyl narkotika), motiverende utformingen av polymer siRNA nanopartikler (si-NPs) for å behandle kreft16. Det finnes imidlertid et eget sett med utformings parametere som må vurderes for ikke-hepatic siRNA-levering. Leveringssystemet må skjerme kationiske ladning av polyplex som forårsaker Agglutinasjon innenfor systemisk sirkulasjon17,18,19. For tumor levering, spesielt, si-np stabilitet er viktig å gi gave lang sirkulasjon og dermed økt akkumulering innen svulster via forbedret permeabilitet og oppbevaring (EPR) effekt20,21. Videre er kontroll over si-NP størrelse viktig siden bare nanopartikler ca 20-200 NM diameter i størrelse utnytte EPR22, og mindre si-NPs (~ 20-50 NM diameter) utstillingen forbedret tumor penetrasjon over større størrelser nanopartikler og mikropartikler23.
For å håndtere disse ekstra design begrensningene for systemisk tumor levering av siRNA etter intravenøs administrering, er det utviklet nøytralt pH-responsiv si-NPs (figur 1)24. Disse si-NPs er pegylert, eller sist, Zwitterionated25, for nøytral overflate ladning og resistens mot absorpsjon av protein og opsonization i sirkulasjon. Siden de ikke kan stole utelukkende på kationiske karakter for å kjøre intracellulære levering, er ekstremt effektiv endosomal å unnslippe avgjørende for å oppnå potent gen-deaktivering. Følgelig er kjernen i disse si-NPs består av en svært endosomolytic kjerne som er inert på ekstracellulære pH (7,4), men som utløses i en Switch-lignende måte i de surgjort forholdene i endolysosomal veien [pH 6,8 (tidlig endosomes)-5,0 ( lysosomer)]. Endelig, en blanding av kationiske og hydrofobe innhold i kjernen av si-NPs gir både elektrostatisk og Van der Waals stabilisering styrker, forbedre stabiliteten i si-NPs i blodet i forhold til bare kationiske systemer.
Integreringen av mange funksjoner i en relativt enkel design er mulig ved hjelp av reversibel tillegg-fragmentering kjeden Transfer (RAFT) kontrollerte polymerisering å produsere polymerer med kompleks arkitektur og presis sammensetning. Å produsere si-NPs med nøytral overflate ladning, pH-respons, og NP stabilitet, er FLÅTEN som brukes til å syntetisere Poly (etylen glykol-b-[2-(dimetylamino) etanol akrylat-co-butyl AKRYLAT]) (PEG-DB; Figur 1a). PEG-DB er elektrostatisk complexed med siRNA, forming si-NPs med en PEG Corona og DB/siRNA kjerne (figur 1B). PEG danner et inert, nøytralt hydrofile lag på si-NP Corona. DB-blokken består av en 50:50 molar ratio på 2-(dimetylamino) etanol akrylat (DMAEMA) og butyl akrylat (BMA). Kationiske DMAEMA elektrostatisk komplekser negativt ladet siRNA. BMA Self-Associates i NP-kjernen av van der Waals interaksjoner, økende NP stabilitet. Sammen, DMAEMA og BMA meddele pH-avhengig lipid bilayer-lytisk oppførsel til DB polymer blokk. Ved ekstracellulære pH er DB-blokken sequestered til si-NP-kjernen og er inert til lipid bilayers. Under Sure forhold, slik som de i endolysosomal veien, ionebyttermembraner DMAEMA innenfor DB blokken Letter Proton svamp effekt, der endosomal bufring fører til osmotisk hevelse og brudd26. I tillegg hydrofobe BMA andeler i DB-blokken aktivt integreres i og lyse lipid bilayers, noe som resulterer i potent endosomolysis. Således, siRNA er complexed med PEG-DB å blankett si-NPs det er nøytralt-ladet og høylig stabile for ekstracellulære pH bortsett fra hvilke avbryte lipid bilayers for syrlig pH, forsikrer cytosolic leveranse av det siRNA payload.
Heri beskrives de eksperimentelle prosedyrene for å produsere si-NPs fra PEG-DB. Metoder for å karakterisere fysikalsk parametre og bioactivity av si-NPs er presentert og diskutert. For å raskt kunne vurdere si-NP-bioactivity, brukes luciferase som modell gen for knockdown studier. Firefly luciferase er proteinet som er ansvarlig for "gløden" av ildfluene27. Følgelig, pattedyrceller transfekterte med Firefly luciferase genet produsere en Puerto Mosquito "glød" som kan fanges opp ved hjelp av en luminometeret å kvantifisere nivåer av luciferase uttrykk. Her bruker vi luciferase å vurdere bioactivity av si-NPs ved å levere siRNA mot luciferase og kvantifisere tilsvarende reduksjon i bioluminesens i luciferase-uttrykker celler i forhold til celler som mottar en forvrengt siRNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

Suksessen til siRNA som en målrettet molekylær medisin er avhengig av sin effektive cytosolic levering til celler i vevet i patologi. Klinisk suksess for behandling av tidligere ' undruggable ' lever sykdoms mål med siRNA har blitt oppnådd. Men effektiv tumor siRNA levering nødvendiggjør ytterligere farmakokinetiske design hensyn, inkludert lang sirkulasjon tid, Evasion av klaring organer (f. eks, lever og nyrer), og tumor penetrasjon og oppbevaring. Her beskriver vi utarbeidelse og in vitro fysikalsk/biologisk karakterisering av polymer nanopartikler designet for effektiv siRNA levering, spesielt til ikke-hepatic vev som svulster. Den siRNA nanopartikler er utarbeidet av elektrostatisk kompleks av siRNA og diblokk kopolymer Poly (etylen glykol-b-[2-(dimetylamino) etanol akrylat-co-butyl AKRYLAT]) (PEG-DB) for å danne polyion komplekser ( polyplexes) der siRNA er sequestered innenfor polyplex kjernen og PEG danner en hydrofile, nøytralt-ladet Corona. Videre DB blokken blir membran-lytisk som blemmer av endolysosomal veien acidify (< pH 6,8), utløser endosomal rømme og cytosolic levering av siRNA. Metoder for å karakterisere de fysikalsk egenskapene til siRNA nanopartikler som størrelse, overflate ladning, partikkel morfologi og siRNA-lasting er beskrevet. Bioactivity av siRNA nanopartikler måles ved hjelp av luciferase som en modell gen i en rask og høy gjennomstrømming gen demping analysen. Tegninger hvilke admission card disse Initial prøver (som PEG-DB-basert polyplexes) er betraktet som passende for oversettelse å prekliniske dyr studier vurderingen leveringen av siRNA å svulst eller annet steder av patologi.

Noen viktige egenskaper ved effektiv si-NPs for in vivo siRNA levering er riktig størrelse (~ 20-200 NM diameter), siRNA emballasje, og gendeaktivering bioactivity. Selv om dette ikke er en uttømmende liste (som omtalt i diskusjonen), bør disse grunnleggende egenskapene bekreftes før du vurderer videre testing av en formulering.
Figur 2 illustrerer karakterisering av si-np størrelse og overflat...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Metoder for å forberede og karakterisere fysikalsk egenskaper og bioactivity av nøytralt-ladet, pH-responsive siRNA nanopartikler er presentert. Kriterier for vellykkede siRNA-nanomedisiner som størrelse, morfologi, overflate ladning, siRNA-lasting og gendeaktivering diskuteres.

Utarbeidelse av nøytralt-ladet, pH-responsive polymer nanopartikler for cytosolic siRNA levering

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Den nåværende protokollen er betydelig fordi den tillater forskere å produsere siRNA-belastede nanopartikler, og å tilstrekkelig karakterisere disse nanopartiklene for å sikre deres egnethet for administrasjon til dyr før påfølgende studier. Fordelen med denne tilnærmingen er å produsere nanopartikler som øker biotilgjengeligheten til siRNA og å produsere nanopartikler som er nøytralt ladet og dermed egnet for systemisk administrasjon. Denne teknikken er virkningsfull fordi siRNA nanopartikler kan brukes til å behandle en myriade av sykdommer som krever systemisk administrasjon, inkludert kreft, kardiovaskulær sykdom, og autoimmune lidelser, blant andre.For å begynne, oppløse polymer i etanol ved en konsentrasjon på 33,3 milligram per milliliter og rør for å sikre oppløsning. Bruk deretter en pipette til å overføre polymerløsning i 10 millimolar sitronsyrebuffer for å nå en konsentrasjon på 3,33 milligram per milliliter. Tilsett destillert vann i et rør som inneholder små forstyrrende RNA for å oppnå en konsentrasjon på 50 mikromos.Bland polymeren og små forstyrrende RNA-løsninger grundig i et rør ved å pipe opp og ned for å oppnå et nitrogen-til-fosfatforhold på 10. Plasser røret ved omgivelsestemperatur i 30 minutter. Tilsett deretter en milliliter med 10 millimolar fosfatbuffer ved pH åtte til røret for å oppnå en konsentrasjon på 0,28 milligram per milliliter og bland forsiktig enten ved å pipe eller invertere røret.For å bekrefte at den endelige pH er nøytral, rundt 7,2 til 7,5, pipette 10 mikroliter av de små forstyrrende RNA nanopartikler løsning på pH testlister. Først forberede en dynamisk lysspøkeprøve ved å filtrere en milliliter små forstyrrende RNA nanopartikler ved konsentrasjonen av 0,28 milligram per milliliter gjennom 0,45-mikrometer pore størrelse sprøytefiltre i en firkantet kvarts eller polystyren cuvette. Deretter registrerer du størrelses- og overflateladningsmålinger ved hjelp av et dynamisk lysspytelsesinstrument i henhold til produsentens spesifikasjoner.For å bekrefte størrelsen og morfologien til små forstyrrende RNA nanopartikler ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi, legg først til fem mikroliter filtrert liten forstyrrende RNA nanopartikkelløsning ved 0,28 mg per milliliter til hvert TEM-rutenett. Plasser nettene ved omgivelsestemperatur i 60 sekunder. Tørk med filterpapir i tre sekunder.Deretter legger du til fem mikroliter med 3% uranylacetatløsning til hvert rutenett og inkuberer i 20 sekunder. Blot tørr i tre sekunder. Plasser deretter rutenettene i en desiccator for å tørke over natten før avbildning under overføring elektronmikroskopi.For å utføre agarose gel retardasjon, først legge til to gram elektroforese-grade agarose pulver til 100 milliliter av 1X Tris-acetate-EDTA buffer ved pH åtte i et beger for å produsere 2% agarose gel. Rør for å suspendere agarose. Plasser begeret avdekket i en mikrobølgeovn for å varme i ett til tre minutter til all agarose er oppløst.Når den er avkjølt, tilsett fem mikroliter ethidiumbromid ved konsentrasjonen av 10 milligram per milliliter i begeret og bland godt. Hell deretter agarose i et gelbrett og legg kam for å produsere brønner. La gelen tørke i 30 minutter.Fjern forsiktig kammen for å etterlate lastebrønner, og hell 1X Tris-acetat-EDTA-bufferen i gelbrettet for å fylle til maksimal fylllinje. Plasser deretter to mikroliter aliquots av lasting fargestoff uten SDS eller redusere midler på parafin film for hver liten forstyrrende RNA nanopartikkel formulering ved ulike nitrogen til fosfat prosenter. Pipette for å blande 10 mikroliter små forstyrrende RNA nanopartikkelløsning med lasting fargestoff på parafinfilm.Tilsett blandingen til agarose gel brønner. Koble elektroforesesystemet til en strømforsyning og kjøre spenningskilde på 100 volt i 35 minutter eller til prøvene har krysset 80% av gellengden. Overfør gelen fra brettet til en UV-transilluminator og visualiser de små forstyrrende RNA-båndene på UV-transilluminatoren i henhold til produsentens spesifikasjoner.Bestem det optimale nitrogen-til-fosfatforholdet basert på forsvinningen av små forstyrrende RNA-bånd nederst på gelen. For å slå ned modellgen luciferase, første frø luciferase-uttrykkende celler i en 96-brønn svart inngjerdet plate med DMEM i 10% FBS med en tetthet på 2000 celler per brønn. Plasser platen i en inkubator over natten for å la cellene holde seg.Om morgenen fjerner du medier og legger til 10 mikroliter per brønn med små forstyrrende RNA nanopartikler fortynnet til fulle serummedier for en endelig liten forstyrrende RNA-konsentrasjon på 100 nanomos. Returner brønnene til inkubatoren i 24 timer for å behandle cellene med små forstyrrende RNA nanopartikler. Neste dag erstatter du medier med fullt serummedi som inneholder 150 mikrogram per milliliter D-luciferin.Inkuber cellene ved romtemperatur i fem minutter før du måler luminescence på en plateleser. Gjenta deretter medieoppdatering to ganger med friske fulle serummedier uten D-luciferin, etterfulgt av inkubasjon i 24 timer. Bytt ut mediet med hele serummedier som inneholder 150 milligram per milliliter D-luciferin og inkuber ved romtemperatur i fem minutter.Mål lysstyrken ved 48-timers tidspunkt. For langsgående studier, la lokket stå på toppen av brønnplaten når du er utenfor biosikkerhetsskapet for å opprettholde celler under sterile forhold og fortsette inkubasjonen etter å ha erstattet luciferinholdige medier med friske fulle medier. Dynamiske lysspittmålinger viser at små forstyrrende RNA nanopartikkel har en gjennomsnittlig diameter på 35 nanometer.Tilstedeværelsen av en enkelt topp med smal toppbredde indikerer unimodal fordeling og lav polydisperitet. TEM-målinger bekrefter størrelsesmålingen fra dynamisk lyssppisering antyder tilstedeværelsen av en jevn populasjon av små forstyrrende RNA nanopartikler og avslørte sfærisk morfologi av de små forstyrrende RNA nanopartikler. For høy konsentrasjon av polymer i forberedelsestrinnet resulterte for små forstyrrende RNA nanopartikkel to i uønsket diameter på større enn 200 nanometer, en multimodal og polydispersed befolkning, og aggregater i oppløsning danner ingen distinkt partikkelmorfologi.Både små forstyrrende RNA nanopartikler en og to skjerm nøytral overflateladning indikert med nær null gjennomsnittlig zeta potensielle verdier. Agarose gel retardasjon analyse viser forsvinningen av små forstyrrende RNA band på gel bunnen som indikerer hudfarge av små forstyrrende RNA til polymer. Polymerkomplekset liten forstyrrende RNA kan ikke migrere gjennom gelen og visualiseres dermed på toppen av gelen i nærheten av lastebrønnene.Etter hvert som nitrogen-til-fosfatforholdet økes øker små forstyrrende RNA-kompleksasjon som indikert av redusert intensitet av det lille forstyrrende RNA-båndet på gelbunnen. Bioaktiv luciferase liten forstyrrende RNA nanopartikkel man viser betydelig redusert luciferase aktivitet sammenlignet med kryptert kontroll. I motsetning anses luciferase liten forstyrrende RNA nanopartikkel to ikke som bioaktiv.For å produsere konsistente siRNA nanopartikler med ønskede fysikalske egenskaper, bør man bruke polymerløsninger med passende konsentrasjoner og validere pH-en til bufferløsningene i hvert trinn av protokollen. Ved hjelp av disse metodene i vår forskning har vi vært i stand til å produsere siRNA nanopartikkelbaserte terapier for tidligere uuggelige kreftfremkallende gener og teste effekten av disse behandlingene i prekliniske modeller av brystkreft.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmering stamceller for Therapeutic Angiogenese Bruke biologisk nedbrytbart Polymer Nanopartikler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fabrikasjon av polymere og biohybridfibre med forhåndsdesignet størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartikler for regenerativ Forskning

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porøs Silicon Mikropartikler for levering av siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymer Microneedle Array Fabrikasjon av Fotolitografi

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabrikere superhydrophobic polymere materialer for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering av Terapeutisk siRNA til CNS Bruke kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...