Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Os autores agradecem aos Drs. Craig Duvall e Rebecca Cook pelo acesso a dados e recursos laboratoriais para a realização desta pesquisa. Os autores são gratos ao Instituto Vanderbilt para a nanoescala de ciência e engenharia (VINSE) para o acesso a DLS e TEM (NSF EPS 1004083) instrumentos. Os autores são gratos à Fundação Nacional de ciência para apoiar o programa de bolsas de pós-graduação em pesquisa (NSF # 1445197). Os autores agradecem aos institutos nacionais de saúde pelo apoio financeiro (NIH R01 EB019409). Os autores são gratos ao departamento de defesa Congressionally dirigido programa de pesquisa médica para apoio financeiro (DOD CDMRP OR130302).

1. preparação e caracterização de si-NPs
<ol><li>preparação para si-NP<ol>
<li>Dissolva o polímero em tampão de ácido cítrico de 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. O polímero pode primeiramente ser dissolvido na concentração 10x no ethanol para assegurar a dissolução. Nota: o polímero pode ser dissolvido em concentrações mais baixas, mas o uso em concentrações acima de 3,33 mg/mL pode impedir a formação homogénea do NP.</li>
		<li>Adicionar siRNA (50 μM em diH2O) para resultar em N+...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li><li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+down+the+barriers:+siRNA+delivery+and+endosome+escape.">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle&#8211;mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle&#8211;mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicine:+progress,+challenges+and+opportunities.">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect.">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li><li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawning+era+of+polymer+therapeutics.">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine.">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape,+Stability,+Blood+Circulation+Time,+and+Bioactivity+in+vivo.">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li><li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol.">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li><li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis.">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li><li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+gene:+structure+and+expression+in+mammalian+cells.">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li><li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution,+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy.">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery.">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).</li><li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

Os si-NPs descritos aqui são formados por associação eletrostática de siRNA aniônica e Polímeros Catiônicos em complexos de poliion (polyplexes). A complexação eletrostática de siRNA e o bloco catiônicos DB de polímeros Peg-DB são facilitadas pela mistura a baixo pH (4,0). No pH 4,0, o DMAEMA é altamente protonado e, consequentemente, o bloco DB é altamente carregado. Isto assegura-se de que os polímeros se dissolvem como unimers na solução ao contrário de formar micelas e que complexos do DB eficiente...

Como as siRNAs inibem a tradução de proteínas de seqüências de mRNA, teoricamente podem ser usadas para drogas todas as patologias conhecidas1,2,3,4,5. No entanto, o uso de siRNA em medicina é limitado pelo perfil farmacocinético exaustivamente pobre de moléculas de siRNA6,7. Quando injetadas intravenosamente, as siRNAs são rapidamente desmarcadas através dos rins e/ou degradadas por nucleases8,9. Devido ao seu grande tamanho e carga negativa, o siRNA não pode entrar em células ou escapar da via endolysosomal para acessar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que reside no citosol10,11,12, treze anos. Assim, o amplo esforço tem focado no desenho e implementação das estratégias de entrega do siRNA14. Este esforço concentrou-se em grande parte no desenvolvimento de nanopartículas baseadas em lipídios e polímeros que empacotem siRNA, protegem-na do afastamento e da degradação in vivo, e iniciam a captação celular e o escape endossomal através dos grupos ionizable, catiônicos da amina. Muitos sucessos pré-clínicos foram relatados e mais recentemente, o primeiro sucesso clínico foi relatado para a entrega hepatic Nanoparticle-baseada do siRNA para tratar o amiloidose transthyretin-negociado hereditário (hattr)15.
Há muitos genes causadores de câncer que são atualmente "undruggable" pela farmacologia convencional (ou seja, pequenas moléculas de drogas), motivando o projeto de nanopartículas de siRNA poliméricos (si-NPs) para tratar o câncer16. No entanto, há um conjunto separado de parâmetros de projeto que devem ser considerados para a entrega de siRNA não-hepática. O sistema de distribuição deve proteger a carga catiônica do poliplex que provoca aglutinação dentro da circulação sistêmica17,18,19. Para a entrega do tumor, especificamente, a estabilidade do si-NP é essencial para dotar a circulação longa e assim a acumulação aumentada dentro dos tumores através do efeito realçado da permeabilidade e da retenção (EPR)20,21. Além disso, o controle sobre o tamanho de si-NP é essencial, uma vez que apenas nanopartículas de aproximadamente 20 – 200 nm de diâmetro na alavancagem de tamanho EPR22, e menor si-NPS (~ 20 – 50 nm de diâmetro) exibem melhor penetração tumoral sobre nanopartículas de tamanho maior e micropartículas23.
Para abordar estas limitações adicionais do projeto para a entrega sistemática do tumor de siRNA depois da administração intravenosa, neutralmente-carregada, si-NPs pH-responsivo foi desenvolvida (Figura 1)24. Estes si-NPs são PEGylated, ou mais recentemente, Zwitterionated25, para a carga de superfície neutra e a resistência à adsorção e à opsonização da proteína na circulação. Desde que não podem depender unicamente do caráter catiônico para conduzir a entrega intracelular, o escape endossomal extremamente eficiente é imperativo para conseguir o silenciamento de gene potente. Consequentemente, o núcleo destes si-NPS é compor de um núcleo altamente endosomolytic que seja inerte no pH extracelular (7,4), mas que é provocado em um interruptor-como a maneira nas condições acidificado da via endolysosomal [pH 6,8 (endosomes adiantados) – 5,0 ( lisossomas)]. Por último, uma mistura de conteúdo catiônico e hidrofóbico dentro do núcleo do si-NPs fornecer forças de estabilização eletrostática e Van der Waals, melhorando a estabilidade do si-NPs no sangue em comparação com sistemas meramente catiônicos.
A integração de muitas funções em um projeto relativamente simples é possível usando a polimerização controlada de transferência de cadeia de adição-fragmentação reversível (RAFT) para produzir polímeros com arquitetura complexa e composição precisa. Para produzir si-NPs com carga de superfície neutra, pH-responsividade e estabilidade NP, a JANGADA é usada para sintetizar poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) metacrilato de etilo-co-butil metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). O PEG-DB é complexado eletrostaticamente com siRNA, formando si-NPs com uma Corona PEG e núcleo DB/siRNA (Figura 1b). O PEG forma uma camada hidrófila inerte, neutralmente carregada na Corona do si-NP. O bloco DB consiste em uma razão molar de 50:50 de 2-(dimetilamino) de metacrilato de etilo (DMAEMA) e metacrilato de butilo (BMA). Complexos eletrostaticamente catiônicos de DMAEMA com carga negativa de siRNA. BMA Self-Associates dentro do núcleo NP por interações Van der Waals, aumentando a estabilidade NP. Em conjunto, DMAEMA e BMA concebem o comportamento lítico lipídico dependente do pH para o bloco de polímero DB. No pH extracelular, o bloco DB é sequestrado para o núcleo si-NP e é inerte a bilayers lipídicos. condições ácidas, como aquelas dentro da via endolysosomal, a DMAEMA ionizável dentro do bloco DB facilita o efeito da esponja de prótons, onde a tamponamento endossômica leva ao inchaço e ruptura osmótica26. Adicionalmente, os metades hydrofóbicos do BMA dentro do bloco do DB integram ativamente em e lyse bilayers lipídicos, tendo por resultado o endosomolysis potente. Assim, o siRNA é complexado com Peg-DB para formar si-NPS que são neutralmente carregados e altamente estáveis no pH extracelular, mas que perturbam as bicamadas lipídicas no pH ácido, assegurando a entrega citosónica do Payload siRNA.
São descritos aqui os procedimentos experimentais para produzir si-NPs de PEG-DB. Os métodos para caracterizar os parâmetros físico-químicos e a bioatividade de si-NPs são apresentados e discutidos. A fim de avaliar rapidamente a bioatividade de si-NP, a luciferase é usada como um gene modelo para estudos de knockdown. Firefly luciferase é a proteína responsável pelo ' fulgor ' dos vaga-lumes27. Assim, as células de mamíferos transfectadas com o gene da luciferase do vagalume produzem um "brilho" bioluminescente que pode ser capturado usando um luminômetro para quantificar os níveis de expressão de luciferase. Aqui, usamos luciferase para avaliar a bioatividade de si-NPs, entregando siRNA contra luciferase e quantificando a redução correspondente em bioluminescência em células expressando luciferase em comparação com células que recebem um siRNA mexido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

O sucesso de siRNA como uma medicina molecular alvejada é dependente em cima de sua entrega citosólica eficiente às pilhas dentro do tecido da patologia. O sucesso clínico para tratar previamente "undruggable" alvos hepatic da doença com siRNA foi conseguido. Entretanto, a entrega eficiente do siRNA do tumor necessita considerações farmacocinéticas adicionais do projeto, incluindo o tempo longo da circulação, a evasão de órgãos do afastamento (por exemplo, fígado e rins), e a penetração e a retenção do tumor. Aqui, nós descrevemos a preparação e in vitro caracterização físico-química/biológica de nanopartículas poliméricos projetadas para a entrega eficiente de siRNA, particular aos tecidos não-hepatic tais como tumores. As nanopartículas de siRNA são preparadas por complexação eletrostática de siRNA e o copolímero diblock poli (etileno glicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-co-butil metacrilato]) (PEG-DB) para formar complexos de poliíons ( polyplexes) onde o siRNA é seqüestrado dentro do núcleo do Polyplex e o Peg dá forma a uma Corona hidrófila, neutrally-carregada. Além disso, o bloco do DB transforma-se membrana-Lytic como os vesículas da via endolysosomal acidificar (< pH 6,8), provocando o escape endossomal e a entrega citosólica de siRNA. Métodos para caracterizar as características físico-químicas de nanopartículas de siRNA como tamanho, carga superficial, morfologia de partículas e carregamento de siRNA são descritos. A bioatividade de nanopartículas de siRNA é medida usando a luciferase como um gene modelo em um ensaio de silenciamento gênico rápido e de alta taxa de transferência. Os projetos que passam estes testes iniciais (tais como polyplexes PEG-DB-baseados) são considerados apropriados para a tradução aos estudos animais pré-clínicos que avaliam a entrega de siRNA aos tumores ou aos outros locais da patologia.

Algumas características essenciais do si-NPs efetivo para a entrega in vivo de siRNA são o tamanho adequado (~ 20 – 200 nm de diâmetro), embalagem de siRNA e bioatividade de silenciamento de genes. Embora esta não seja uma lista exaustiva (como abordada na discussão), estas características básicas devem ser confirmadas antes de considerar mais testes de uma formulação.
A Figura 2 ilustra ...

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Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

São apresentados métodos para preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas e a bioatividade de nanopartículas de siRNA com carga neutra e pH responsivo. Os critérios para nanomedicinas bem sucedidas de siRNA tais como o tamanho, a morfologia, a carga de superfície, o carregamento de siRNA, e o silenciamento do gene são discutidos.

Preparação de nanopartículas poliméricos neutralmente carregadas e responsivas ao pH para entrega de siRNA citosólica

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

O protocolo atual é significativo porque permite que os pesquisadores produzam nanopartículas carregadas de siRNA e caracterizem adequadamente essas nanopartículas para garantir sua adequação à administração de animais antes de estudos subsequentes. A vantagem dessa abordagem é produzir nanopartículas que aumentem a biodisponibilidade do siRNA e produzam nanopartículas que são carregadas neutramente e, portanto, adequadas para a administração sistêmica. Essa técnica é impactante porque as nanopartículas de siRNA podem ser aplicadas para tratar uma miríade de doenças que necessitam de administração sistêmica, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e doenças autoimunes, entre outras.Para começar, dissolva o polímero no etanol a uma concentração de 33,3 miligramas por mililitro e mexa para garantir a dissolução. Em seguida, use uma pipeta para transferir solução de polímero em 10 milimil de ácido cítrico tampão para atingir uma concentração de 3,33 miligramas por mililitro. Adicione água destilada em um tubo contendo RNA de interferência pequena para alcançar uma concentração de 50 micromolar.Misture o polímero e pequenas soluções de RNA interferindo completamente em um tubo, pipetando para cima e para baixo para obter uma razão de nitrogênio para fosfato de 10. Coloque o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de 10 milimolar tampão de fosfato no pH oito ao tubo para obter uma concentração de 0,28 miligramas por mililitro e misture suavemente, seja por pipetação ou invertendo o tubo.Para confirmar que o pH final é neutro, em torno de 7,2 a 7,5, pipeta 10 microliters da pequena solução de nanopartículas de RNA interferindo nas tiras de teste de pH. Primeiro, prepare uma amostra dinâmica de dispersão de luz filtrando um mililitro de pequenas nanopartículas de RNA interferindo na concentração de 0,28 miligramas por mililitro através de filtros de seringa de tamanho de poros de 0,45 micrômetros em um quartzo quadrado ou cuvette de poliestireno. Em seguida, regiso de tamanho e carga superficial usando um instrumento dinâmico de dispersão de luz de acordo com as especificações do fabricante.Para confirmar o tamanho e a morfologia de pequenas nanopartículas de RNA interferindo usando microscopia eletrônica de transmissão, adicione primeiro cinco microliters de pequena solução de nanopartículas de RNA interferindo filtrada a 0,28 miligramas por mililitro em cada grade TEM. Coloque as grades à temperatura ambiente por 60 segundos. Estaque com papel filtro por três segundos.Em seguida, adicione cinco microliters de solução de acetato de 3%de urano a cada grade e incubar por 20 segundos. Estada seca por três segundos. Em seguida, coloque as grades em um desiccador para secar durante a noite antes da imagem sob microscopia eletrônica de transmissão.Para realizar o retardo de gel de agarose, primeiro adicione dois gramas de pó de agarose de grau eletroforese a 100 mililitros de tampão 1X Tris-acetato-EDTA em pH oito em um béquer para produzir gel de 2%agarose. Mexa para suspender a agarose. Coloque o béquer descoberto em um micro-ondas para aquecer por um a três minutos até que toda a garose seja dissolvida.Uma vez resfriado, adicione cinco microliters de brometo de etídio na concentração de 10 miligramas por mililitro no béquer e misture bem. Em seguida, despeje a agarose em uma bandeja de gel e coloque o pente para produzir poços. Deixe o gel secar por 30 minutos.Remova cuidadosamente o pente para deixar para trás os poços de carregamento e despeje o tampão 1X Tris-acetato-EDTA na bandeja de gel para encher até a linha de enchimento máxima. Em seguida, coloque duas alíquotas de microliter de corante de carga sem SDS ou agentes redudores em filme de parafina para cada pequena formulação de nanopartículas de RNA interferindo em diferentes razões de nitrogênio para fosfato. Pipeta para misturar 10 microliters de pequena solução de nanopartículas de RNA interferindo com corante de carregamento em filme de parafina.Adicione a mistura aos poços de gel agarose. Conecte o sistema de eletroforese a uma fonte de alimentação e execute a 100 volts por 35 minutos ou até que as amostras tenham atravessado 80% do comprimento do gel. Transfira o gel da bandeja para um transilluminador UV e visualize as pequenas bandas de RNA interferindo no transilluminador UV de acordo com as especificações do fabricante.Determine a razão ideal de nitrogênio para fosfato com base no desaparecimento de pequenas bandas de RNA interferindo na parte inferior do gel. Para derrubar a luciferase genética modelo, as primeiras células expressas da luciferase em uma placa murada 96-bem preta com DMEM em 10% FBS a uma densidade de 2.000 células por poço. Coloque a placa em uma incubadora durante a noite para permitir que as células aderam.Pela manhã, remova a mídia e adicione 10 microliters por poço de pequenas nanopartículas de RNA interferindo diluídas em mídia de soro total para uma concentração final de RNA interferindo de 100 nanomolar. Devolva os poços à incubadora por 24 horas para tratar as células com pequenas nanopartículas de RNA interferentes. No dia seguinte, substitua a mídia de soro total contendo 150 microgramas por mililitro D-luciferina.Incubar as células à temperatura ambiente por cinco minutos antes de medir a luminescência em um leitor de placas. Em seguida, repita o refresco da mídia duas vezes com mídia de soro total fresco livre de D-luciferin, seguido de incubação por 24 horas. Substitua a mídia por mídia de soro completo contendo 150 miligramas por mililitro D-luciferin e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.Meça a luminescência no ponto de tempo de 48 horas. Para estudos longitudinais, deixe a tampa em cima da placa do poço quando fora do armário de biossegurança para manter as células em condições estéreis e continuar a incubação depois de substituir a mídia contendo luciferina por mídia completa fresca. Medições dinâmicas de dispersão de luz mostram que pequenas nanopartículas de RNA interferindo têm um diâmetro médio de 35 nanômetros.A presença de um único pico com largura de pico estreita indica distribuição unimodal e baixa polidispersidade. As medições tem confirmam a medição de tamanho da dispersão dinâmica da luz sugere a presença de uma população uniforme de pequenas nanopartículas de RNA interferindo e revelaram a morfologia esférica das pequenas nanopartículas de RNA interferindo. A concentração muito alta de polímero na etapa de preparação resultou em pequenas nanopartículas de RNA interferindo dois em diâmetro indesejável de maior que 200 nanômetros, uma população multimodal e polidispersada, e agregados em solução que não forma morfologia de partículas distintas.Ambas as pequenas nanopartículas de RNA interferentes um e dois exibem carga de superfície neutra indicada por valores potenciais de zeta médias próximas a zero. O ensaio de retardo de gel de Agarose mostra o desaparecimento de pequenas bandas de RNA interferindo no fundo do gel, o que indica a complexidade do RNA de interferência pequena para o polímero. O RNA de pequenas interferências do polímero é incapaz de migrar através do gel e, portanto, é visualizado na parte superior do gel nas proximidades dos poços de carregamento.À medida que a razão nitrogênio para fosfato é aumentada, a pequena complexidade de RNA interfere, aumenta conforme indicado pela diminuição da intensidade da pequena banda de RNA interferindo no fundo do gel. A pequena nanopartícula de RNA interferente bioativa apresenta uma atividade de luciferase significativamente diminuída quando comparada ao controle mexido. Em contraste, a pequena nanopartícula de RNA interferindo não é considerada bioativa.Para produzir nanopartículas siRNA consistentes com propriedades físico-químicas desejadas, deve-se utilizar soluções de polímeros com concentrações adequadas e validar o pH das soluções tampão em cada etapa do protocolo. Usando esses métodos em nossa pesquisa, conseguimos produzir terapias baseadas em nanopartículas de siRNA para genes que causam câncer anteriormente indisciplinados e testar a eficácia dessas terapias em modelos pré-clínicos de câncer de mama.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Bioengenharia

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Fabricação microfluida de fibras poliméricas e biohibridas com tamanho e forma predesigned

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porous Silicon micropartículas para entrega de siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polimérico Fabrication matriz Microneedle por fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabricação de super-hidrofóbicas Materiais Poliméricos para aplicações biomédicas

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...