Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Авторы благодарят доктора Крейга Дюваля и Ребекку Кук за доступ к данным и лабораторным ресурсам для проведения этих исследований. Авторы благодарят институт по наноразмерным наукам и разработкам (VINSE) Вандербильта для доступа к инструментам DLS и ТЕА (EPS 1004083). Авторы благодарят Национальный научный фонд за поддержку программы стипендий для выпускников исследовательских программ (ННФ # 1445197). Авторы благодарят национальные институты здравоохранения за финансовую поддержку (низ R01 EB019409). Авторы благодарят программу медицинского исследования Министерства обороны США, направленную на финансовую поддержку (ДМО OR130302).

1. Подготовка и характеристика Si-НПВ
<ol><li>подготовка Си-НП<ol>
<li>Растворите полимер в 10-мм лимонной кислоты буфер (pH 4,0) на 3,33 мг/мл. Полимер может сначала растворяться в 10x концентрация в этанол для обеспечения растворения. Примечание: полимер может быть растворен при более низких концен?...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li><li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+down+the+barriers:+siRNA+delivery+and+endosome+escape.">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle&#8211;mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle&#8211;mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicine:+progress,+challenges+and+opportunities.">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect.">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li><li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawning+era+of+polymer+therapeutics.">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine.">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape,+Stability,+Blood+Circulation+Time,+and+Bioactivity+in+vivo.">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li><li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol.">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li><li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis.">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li><li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+gene:+structure+and+expression+in+mammalian+cells.">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li><li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution,+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy.">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery.">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).</li><li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

Описанные здесь Si-НПВ формируются электростатической ассоциацией анионических СиРНА и катионических полимеров в полионные комплексы (полиплексы). Электростатическое комплексирование СиРНА и катионический DB полимеров ПЭГ-DB способствует смешиванию при низком РН (4,0). При pH 4,0, DMAEMA очень...

Потому что сирнас ингибирует перевод белков из мРНК последовательностей, они теоретически могут быть использованы для наркотиков всех известных патологий1,2,3,4,5. Тем не менее, использование СиРНА в медицине ограничено всесторонне бедным Фармакокинетический профиль молекул СиРНА6,7. При введении внутривенно, сирнас быстро очищается через почки и/или деградирует нуклеазы8,9. Из-за большого размера и отрицательного заряда, СиРНА не может войти в клетки или избежать эндолизомального пути для доступа к РНК-индуцированной комплекс глушителей (RISC), который находится в цитозоль10,11,12, 13-ое. Таким образом, были предприняты активные усилия по разработке и внедрению стратегий доставки СиРНА14. Эти усилия в значительной степени сосредоточены на развитии липидных и полимеров на основе наночастиц, которые пакет СиРНА, защитить его от очистки и деградации в естественных условиях, и инициировать поглощение клеток и эндосомальных бежать через ионируемых, катионических аминов групп. Многие доклинические успехи были зарегистрированы и в последнее время, первый клинический успех был сообщены для нано, основанных на печени, на основе Рсрнк доставки для лечения наследственных транстимотина-опосредованного (Хаттр) амилоидоз15.
Есть много вызывающих рак генов, которые в настоящее время "undruggable" по традиционной фармакологии (например, малые молекулы наркотиков), мотивируя дизайн полимерных наночастиц СиРНА (Si-НПВ) для лечения рака16. Тем не менее, есть отдельный набор параметров дизайна, которые должны быть рассмотрены для не-печеночной СиРНА доставки. Система доставки должна оградить катионический заряд полиплекса, который вызывает агглютинации в рамках системного обращения17,18,19. Для доставки опухоли, в частности, Si-НП стабильности имеет важное значение для наделять длительный тираж и, следовательно, увеличение накопления в рамках опухоли с помощью расширенной проницаемости и удержания (ОРЭД) эффект20,21. Кроме того, контроль над размером Si-НП имеет важное значение, так как только наночастицы примерно 20-200 Нм диаметром в размер плечо ЭПР22, и меньше Si-ЯИЭ (~ 20-50 Нм диаметром) экспонат Улучшение проникновения опухоли более крупных размеров наночастиц и микрочастицы23.
Для решения этих дополнительных проектных ограничений на системную поставку опухоли в СиРНА после внутривенного введения, нейтрально заряженных, рН-отзывчивый Si-НПВ были разработаны (рис. 1)24. Эти Si-НПВ являются PEGylated, или совсем недавно, Zвиттерионионированной25, для нейтральной поверхности заряда и устойчивость к протеиновой адсорбции и опсонизации в обращении. Поскольку они не могут полагаться исключительно на катионический характер диска внутриклеточного доставки, чрезвычайно эффективным эндосомальных побег является обязательным условием для достижения мощного глушителей генов. Соответственно, ядро этих Si-НПВ состоит из высокоэндолитического ядра, которое инертно при внеклеточной рН (7,4), но которое срабатывает в коммутатор-подобный способ в подкисленные условия эндолизомального пути [pH 6,8 (ранние эндосомы)-5,0 ( лизосомы)]. Наконец, смесь катионного и гидрофобного содержания в ядре Si-ЯИЭ обеспечивают как электростатические, так и стабилизационные силы Ван-дер-Ваальса, улучшая устойчивость Si-НПВ в крови по сравнению с просто катионическим системами.
Интеграция многих функций в относительно простую конструкцию возможна с помощью обратимой цепочки переноса фрагментации (плот), контролируемой полимеризации, для производства полимеров со сложной архитектурой и точным составом. Для производства Si-ЯИЭ с нейтральным поверхностным зарядом, рН-отзывчивостью и стабильностью НП, плот используется для синтеза поли (этиленгликоль-б-[2-(диметиламин) Этилметакрилат-ко-бутил метакрилат)) (ПЭГ-дБ; Рис. 1A). ПЭГ-дБ является электростатически комплексированных с СиРНА, формирование Si-ЯИЭ с ПЭГ Корона и DB/СиРНА ядра (рис. 1b). ПЭГ образует инертный, нейтрально заряженный гидрофильный слой в Си-НП Корона. Блок DB состоит из 50:50 молярного соотношения 2-(диметиламин) этилметакрилта (DMAEMA) и бутиля метакрилат (БМА). Катионические DMAEMA электростатически комплексы отрицательно заряженные СиРНА. БМА самоассоциированные в рамках НП ядро взаимодействия ван дер Ваальса, повышение стабильности НП. Вместе, DMAEMA и БМА передавать рН-зависимых липидного билайер-lytic поведение БД полимерных блоков. При внеклеточной рН, блок DB поглощенных к Си-НП ядро и инертен для липидных билайеры. В кислотных условиях, таких, как в пределах эндосомального пути, иоментизируемая DMAEMA в блоке DB облегчает эффект протонной губки, где эндосомная буферизация приводит к осмотическим отеку и разрыву26. Дополнительно, гидрофобные МДА, в пределах блока DB активно интегрируются в и Lyse липидные билайеры, в результате мощного эндосомолиза. Таким образом, СиРНА комплексируется с ПЭГ-БД для формирования Si-НПВ, которые нейтрально заряженных и очень стабильной при внеклеточной рН, но которые нарушают липидные билайеры на кислотных рН, обеспечивая цитозололические доставки полезной нагрузки СиРНА.
Здесь описаны экспериментальные процедуры по производству Si-НПВ от ПЭГ-БД. Представлены и обсуждаются методы, характеризующие Физикохимические параметры и биоактивность Si-НПВ. Чтобы быстро оценить биоактивность Si-НП, Люцифераза используется в качестве типового гена для исследований нокдауна. Светлячок люциферазы является белок, ответственный за "свечение" светлячков27. Соответственно, клетки млекопитающих, трансфецированных в гене люцифязы Светлячок производят светящихся "свечение", которые могут быть захвачены с помощью лютометр для количественной оценки уровней люциферазы выражения. Здесь мы используем люциферазу для оценки биологической активности Si-НПВ, предоставляя СиРНА против люциферазы и количественного соответствующего сокращения биолюминесценции в Люцифферасе-экспрессируя клетки по сравнению с клетками, которые получают зашифрованный СиРНА.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

Успех СиРНА как целевой молекулярной медицины зависит от его эффективной цитозололиной доставки в клетки в тканях патологии. Клинический успех для лечения ранее не «безнаркоспособных» целевых показателей печеночной болезни с помощью Сирны был достигнут. Однако эффективная поставка опухоли СиРНА обусловливает необходимость в дополнительных фармакокинетических соображениях проектирования, включая длительное время циркуляции, уклонение от очистки органов (например, печень и почки), а так же проникновение и удержание опухоли. Здесь мы описываем подготовку и экстракорпоральное физикохимическое/биологическое описание полимерных наночастиц, предназначенных для эффективной доставки СиРНА, в частности, к не печеночной ткани, такой как опухоли. Наночастицы СиРНА подготавлиются электростатической комплексообразованием СиРНА и полиолмера поли (этилен гликоль-б-[2-(диметиламин) этилметакриловой-Co-Butyl метакрилат]) (ПЭГ-дБ) для формирования polyion комплексов ( полиплексы), где СиРНА изолированный внутри полиплекса ядра и ПЭГ образует гидрофильные, нейтрально заряженных короны. Кроме того, блок DB становится мембранно-литической, как пузырьки эндолизомального пути окислить (< рН 6,8), вызывая эндосомальный побег и цитозололическую доставку СиРНА. Описаны методы для характеристики физикохимических характеристик наночастиц СиРНА, таких как размер, поверхностная зарядка, морфология частиц и нагрузка на СиРНА. Биоактивность наночастиц СиРНА измеряется с помощью люциферазы в качестве типового гена в быстром и высокой пропускной способности глушителей анализа гена. Проекты, которые проходят эти первоначальные тесты (например, полиплексы на основе ПЭГ-БД), считаются подходящими для перевода на доклинические исследования животных, оценивающих доставку СиРНА в опухоли или другие места патологии.

Некоторые существенные характеристики эффективного Si-НПВ для в естественных условиях доставки СиРНА являются надлежащий размер (~ 20-200 Нм диаметр), СиРНА упаковки и гена глушителей биологической активности. Хотя это не исчерпывающий перечень (как это было в ходе обсуж?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Представлены методы подготовки и характеристики физико-химических свойств и биоактивности нейтрали-заряженных, рН-отзывчивых наночастиц СиРНА. Обсуждаются критерии успешного, например, размер, морфология, поверхностная зарядка, нагрузка на иРНК и глушителей генов.

Подготовка к нейтрали-заряженной, рН-отзывчивой полимерных наночастиц для Цитосаолийской Сирны Доставка

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Текущий протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет исследователям производить наночастицы, загруженные siRNA, и адекватно охарактеризовать эти наночастицы, чтобы обеспечить их пригодность для введения животным до последующих исследований. Преимущество этого подхода заключается в производстве наночастиц, которые повышают биодоступность siRNA и производить наночастицы, которые нейтрально заряжены и, таким образом, пригодны для системного введения. Этот метод является ударным, потому что наночастицы siRNA могут быть применены для лечения множества заболеваний, требующих системного введения, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и аутоиммунные расстройства, среди других.Для начала растворите полимер в этаноле при концентрации 33,3 миллиграмма на миллилитр и перемешайте, чтобы обеспечить растворение. Затем используйте пипетки для передачи полимерного раствора в 10 миллимолярный буфер лимонной кислоты, чтобы достичь концентрации 3,33 миллиграмма на миллилитр. Добавьте дистиллированную воду в трубку, содержащую небольшую мешащую РНК, чтобы достичь концентрации 50 микромоляров.Смешайте полимер и небольшие мешающие РНК растворы тщательно в трубке путем трубопроводов вверх и вниз для достижения соотношения азота к фосфатам 10. Поместите трубку при температуре окружающей среды в течение 30 минут. Затем добавьте один миллилитр 10 миллимолярный фосфатный буфер при рН восемь в трубку, чтобы достичь концентрации 0,28 миллиграмма на миллилитр и аккуратно перемешать либо путем пипетки или инвертирования трубки.Чтобы подтвердить, что окончательный рН является нейтральным, около 7,2 до 7,5, пипетка 10 микролитров малых вмешательства РНК наночастиц раствора на рН тест-полоски. Во-первых, подготовить динамический образец рассеяния света путем фильтрации одного миллилитра малых помех РНК наночастиц при концентрации 0,28 миллиграмма на миллилитр через 0,45-микрометровый пор размер шприца фильтры в квадратный кварц или полистирол кювет. Затем рекордные размеры и измерения поверхностного заряда с помощью динамического инструмента рассеяния света в соответствии со спецификациями производителя.Для подтверждения размера и морфологии малых мешающихся РНК-наночастиц с помощью электронной микроскопии передачи сначала добавьте пять микролитров фильтрованного малого мешательного раствора РНК-наночастиц по 0,28 миллиграмма на миллилитр к каждой сетке TEM. Поместите сетки при температуре окружающей среды в течение 60 секунд. Пятно сухой с фильтровальной бумагой в течение трех секунд.Затем добавьте пять микролитров раствора ацетата 3%уранила в каждую сетку и инкубировать в течение 20 секунд. Пятно сухое в течение трех секунд. Затем поместите сетки в децикатор, чтобы высохнуть на ночь перед визуализацией под электронной микроскопией передачи.Для выполнения агарозы гель отсталости, сначала добавить два грамма электрофорез-класса агарозы порошок 100 миллилитров 1X Tris-ацетат-EDTA буфера на рН восемь в стакане для производства 2%agarose гель. Перемешать, чтобы приостановить агарозу. Поместите стакан обнаружили в микроволновой печи, чтобы нагреть в течение одной-трех минут, пока все агарозы растворяется.После охлаждения добавьте пять микролитров бромистого этидия при концентрации 10 миллиграммов на миллилитр в стакан и хорошо перемешайте. Затем залить агарозу в гель лоток и место гребень для производства скважин. Дайте гель высохнуть в течение 30 минут.Аккуратно удалите гребень, чтобы оставить позади погрузки скважин, и залить 1X Tris-ацетат-EDTA буфера в гель лоток для заполнения до максимальной линии заполнения. Затем поместите два микролитерных алицита погрузочного красителя без SDS или уменьшая агентов на парафиновой пленке для каждой небольшой мешательной формулировки РНК-наночастиц при разных соотношениях азота и фосфатов. Пипетку смешать 10 микролитров мелкого раствора РНК-наночастиц с загрузкой красителя на парафиновую пленку.Добавьте смесь в скважины агарозового геля. Подключите систему электрофореза к источнику питания и запустите источник напряжения на 100 вольт в течение 35 минут или до тех пор, пока образцы не проехав 80% длины геля. Перенесите гель из лотка в уфимский трансиллюминатор и визуализируете небольшие мешающие РНК-полосы на уф-трансиллюминаторе в соответствии со спецификациями производителя.Определите оптимальное соотношение азота и фосфатов на основе исчезновения небольших мешающихся РНК-полос в нижней части геля. Чтобы сбить модель генной люциферазы, первые семенные люциферазы-выражают клетки в 96-ну черной стеной пластины с DMEM в 10%FBS при плотности 2000 клеток на колодец. Поместите пластину в инкубатор на ночь, чтобы клетки придерживаться.Утром удалите средства массовой информации и добавьте 10 микролитров на колодец небольших наночастиц РНК, разбавленных в полный сывороточный смил для окончательной небольшой интервокантной концентрации РНК в 100 наномолярных. Верните скважины в инкубатор в течение 24 часов для лечения клеток с небольшими мешать РНК наночастиц. На следующий день замените средства массовой информации полными сывороточной медиа, содержащими 150 микрограмм на миллилитр D-люциферина.Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение пяти минут, прежде чем измерять люминесценцию на считыватель пластины. Затем повторите освежение средств массовой информации дважды со свежими полными средствами сыворотки, свободными от D-люциферина, а затем инкубации в течение 24 часов. Замените средства массовой информации полными средствами сыворотки, содержащими 150 миллиграммов на миллилитр D-люциферина, и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.Измерьте люминесценцию в 48-часовой точке времени. Для продольных исследований оставьте крышку верхней части пластины, когда за пределами шкафа биобезопасности для поддержания клеток в стерильных условиях и продолжить инкубацию после замены люциферин-содержащих средств массовой информации со свежими полными средствами массовой информации. Измерения динамического рассеяния света показывают, что небольшая мешающая РНК-наночастица имеет средний диаметр 35 нанометров.Наличие одного пика с узкой пиковой шириной указывает на одномодное распределение и низкую полидисперсность. Измерения TEM подтверждают размер измерения от динамического рассеяния света предполагает наличие равномерной популяции малых мешающих РНК наночастиц и показал сферической морфологии малых вмешательства РНК наночастиц. Слишком высокая концентрация полимера на этапе подготовки привела к небольшому вмешательству РНК-наночастицы 2 в нежелательном диаметре более 200 нанометров, мультимодальной и полидисперсной популяции, а также агрегатам в растворе, не образуя отдельной морфологии частиц.Оба небольших мешая наночастицы РНК один и два отображения нейтрального поверхностного заряда, указанного почти нулевым средним zeta потенциальных значений. Анализ отсталости геля агарозы показывает исчезновение небольших мешателей РНК-полос на гель-дне, что указывает на у сложности небольшой интерфузной РНК с полимером. Полимерная сложная небольшая мешаемая РНК не может мигрировать через гель и, таким образом, визуализируется в верхней части геля рядом с погрузочными скважинами.По мере увеличения соотношения азота к фосфатам увеличивается небольшая интерструляция РНК, о чем свидетельствует снижение интенсивности небольшой мешаемой РНК-полосы на дне геля. Биоактивная люцифераза малых вмешательства РНК наночастицы один экспонатов значительно уменьшилась активность люциферазы по сравнению с скремблированный контроль. В отличие от этого, люцифераза малых вмешательства РНК наночастицы два не считается биоактивным.Для получения последовательных наночастиц siRNA с желаемыми физикохимическими свойствами следует использовать полимерные растворы с соответствующими концентрациями и проверять рН буферных решений на каждом этапе протокола. Используя эти методы в наших исследованиях, мы смогли производить наночастицы siRNA на основе терапии для ранее неопровожимых генов, вызывающих рак, и проверить эффективность этих методов лечения в доклинических моделях рака молочной железы.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Формулировка диблок Полимерные наночастицы через Nanoprecipitation Техника

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Оценка Полимерные доставки генов наночастиц наночастиц Анализ отслеживания и высокой пропускной проточной цитометрии

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Стволовые Программирование Клетки для терапевтической ангиогенеза Использование биоразлагаемых полимерных наночастиц

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Микрофлюидное изготовление полимерных и биогибридных волокон с заранее разработанным размером и формой

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Гармоник Наночастицы регенеративной исследований

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Пористого кремния Микрочастицы для доставки миРНК терапии

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Полимерные микроиглы массив Изготовление по фотолитографии

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Изготовление супергидрофобных полимерных материалов для биомедицинских применений

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Доставки терапевтических миРНК в ЦНС с использованием катионных и анионных липосом

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...