Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Författarna är tacksamma till DRS. Craig Duvall och Rebecca Cook för till gång till data och Lab resurser för att bedriva denna forskning. Författarna är tacksamma till Vanderbilt Institutet för nanoskala vetenskap och teknik (VINSE) för till gång till DLS och TEM (NSF EPS 1004083) instrument. Författarna är tacksamma till National Science Foundation för att stödja Graduate forskar stipendium program (NSF # 1445197). Författarna är tacksamma för de nationella hälso instituten för ekonomiskt stöd (NIH r01 EB019409). Författarna är tacksamma för Department of Defense Congressii riktat medicinsk forskning program för ekonomiskt stöd (DOD CDMRP OR130302).

1. förberedelse och karakterisering av si-NPs
<ol><li>SI-NP beredning<ol>
<li>Lös upp polymeren i 10 mM citron syra buffert (pH 4,0) vid 3,33 mg/mL. Polymer kan först lösas upp vid 10x koncentration i etanol för att säkerställa upplösning. Anmärkning: polymer kan lösas upp vid lägre koncentrationer, men användning vid koncentrationer över 3,33 mg/mL kan förhindra homogent NP-bildning.</li>
		<li>Tillsätt siRNA (50 μM i diH2O) för att resultera i N+:P- förhållandet ...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li><li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+down+the+barriers:+siRNA+delivery+and+endosome+escape.">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle&#8211;mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle&#8211;mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicine:+progress,+challenges+and+opportunities.">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect.">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li><li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawning+era+of+polymer+therapeutics.">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine.">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape,+Stability,+Blood+Circulation+Time,+and+Bioactivity+in+vivo.">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li><li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol.">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li><li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis.">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li><li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+gene:+structure+and+expression+in+mammalian+cells.">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li><li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution,+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy.">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery.">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).</li><li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

SI-NPs beskrivs här bildas genom elektro statisk Association av anjon siRNA och katjoniska polymerer till polyjon komplex (polyplexes). Elektro statisk komplex bildare av siRNA och det katjoniska DB-blocket av PEG-DB-polymerer under lättas genom blandning vid lågt pH (4,0). Vid pH 4,0, DMAEMA är mycket protonated, och därmed DB blocket är mycket laddad. Detta säkerställer att polymererna löses upp som unimers i lösning i stället för att bilda miceller och att DB-komplex effektivt med siRNA. Därefter justeras...

Eftersom sirnas hämmar översättningen av proteiner från mRNA-sekvenser, kan de teoretiskt användas för att drog alla kända patologier1,2,3,4,5. Användningen av siRNA i medicin begränsas dock av den övergripande dåliga farmakokinetiska profilen för siRNA-molekyler6,7. När sirnas injiceras intravenöst elimineras de snabbt genom njurarna och/eller bryts ned av nukleaser8,9. På grund av dess stora storlek och negativa laddning kan siRNA inte komma in i cellerna eller undkomma den endolysosomala vägen för att få till gång till det RNA-inducerade ljud dämpnings komplexet (RISC) som finns i cytosolen10,11,12, och 13. Därför har omfattande insatser fokuserat på design och implementering av siRNA leverans strategier14. Denna ansträngning har till stor del fokuserat på utvecklingen av lipidbaserade och polymerbaserat nanopartiklar som paketerat siRNA, skyddar den från clearance och nedbrytning in vivo, och initierar cellulär upptag och endosomal flykt genom joniserbara, katjoniska amingrupper. Många prekliniska framgångar har rapporter ATS och senast, den första kliniska framgången har rapporter ATS för nanoparticle-baserade hepatiska siRNA leverans för att behandla ärftlig transthyretin-medierad (hATTR) amyloidos15.
Det finns många cancerframkallande gener som för närvarande "undruggable" av konventionella farmakologi (dvs., små molekyl droger), motivera utformningen av polymera siRNA nanopartiklar (SI-NPs) för att behandla cancer16. Det finns dock en separat uppsättning design parametrar som måste övervägas för icke-hepatisk siRNA-leverans. Leverans systemet måste skydda den katjoniska laddningen av Polyplex som orsakar agglutination inom den systemiska cirkulationen17,18,19. För tumör leverans, specifikt, SI-NP stabilitet är viktigt att ge lång cirkulation och därmed ökad ackumulering inom tumörer via förbättrad permeabilitet och retention (EPR) effekt20,21. Dessutom kontroll över si-NP storlek är viktigt eftersom endast nanopartiklar cirka 20-200 nm diameter i storlek hävstångs effekt EPR22, och mindre si-NPs (~ 20-50 nm diameter) uppvisar förbättrad tumör penetration över större storlek nanopartiklar och mikropartiklar23.
För att åtgärda dessa ytterligare konstruktions begränsningar för systemisk tumör leverans av siRNA efter intravenös administrering, har neutralt laddade, pH-responsiva si-NPs utvecklats (figur 1)24. Dessa si-NPs är pegylerat, eller senast Zwitterionated25, för neutral ytladdning och resistens mot proteinadsorption och Opsonization i omlopp. Eftersom de inte kan förlita sig enbart på katjonkaraktär för att driva intracellulär leverans, är extremt effektiv endosomal flykt absolut nödvändigt för att uppnå potent gen ljud dämpning. Följaktligen är kärnan i dessa si-NPs består av en mycket endosomolytic kärna som är inert vid extracellulär pH (7,4), men som utlöses i en switch-liknande sätt i de försurade villkoren för endolysosomala vägen [pH 6,8 (tidig endosomer)-5,0 ( lysosomer)]. Slutligen, en blandning av katjoniska och hydrofoba innehåll i kärnan av si-NPs ger både elektro statiska och Van der Waals stabiliserings styrkor, förbättra stabiliteten i si-NPs i blodet jämfört med bara katjoniska system.
Integrationen av många funktioner i en relativt enkel konstruktion är möjlig med hjälp av reversibel addition-fragmentering Chain transfer (RAFT) kontrollerad polymerisation för att producera polymerer med komplex arkitektur och exakt komposition. För att producera si-NPs med neutral ytladdning, pH-respons, och NP stabilitet, flotte används för att syntetisera poly (etylenglykol-b-[2-(dimethylamino) etylmetakrylat-co-butylmetakrylat]) (PEG-DB; Figur 1a). PEG-DB är elektrostatiskt komplex med siRNA, som bildar si-NPs med en PEG-Korona och DB/siRNA-kärna (figur 1b). PEG bildar ett inert, neutralladdat hydrofila skikt på SI-NP-koronan. DB-blocket består av ett 50:50 molar-förhållande på 2-(dimethylamino) etylmetakrylat (DMAEMA) och butylmetakrylat (BMA). Katjoniska DMAEMA elektrostatiskt komplex negativt laddade siRNA. BMA Self-Associates inom NP kärnan av Van der Waals interaktioner, vilket ökar NP stabilitet. Tillsammans, DMAEMA och BMA förmedla pH-beroende lipidbilayer-lytic beteende till DB polymer blocket. Vid extracellulär pH, är DB blocket binds till si-NP kärna och är inert mot lipidbilayers. Under sura förhållanden, såsom de inom den endolysosomala vägen, fören klar joniserbar DMAEMA inom DB-blocket protonsvampeffekten, där endosomal buffring leder till osmotisk svullnad och ruptur26. Dessutom, hydrofoba BMA-delarna inom DB-blocket integreras aktivt i och lysera lipidbilayers, vilket resulterar i potent endosomolysis. Därför är siRNA komplex med PEG-DB för att bilda si-NPs som är neutralt laddade och mycket stabila vid extracellulär pH men som stör lipidbilayers vid surt pH, vilket säkerställer cytosolisk leverans av siRNA-nyttolasten.
Häri beskrivs de experimentella procedurer för att producera si-NPs från PEG-DB. Metoder för att karakterisera de fysikalisk-kemiska parametrarna och bioaktiviteten hos si-NPs presenteras och diskuteras. För att snabbt kunna bedöma si-NP-bioaktivitet används luciferas som en modell gen för knockdown-studier. Firefly Luciferase är proteinet som ansvarar för "glöd" av eld flugor27. Följaktligen, däggdjurs celler transfekterade med Firefly luciferas genen producerar en bioluminiscerande "glöd" som kan fångas med hjälp av en luminometer för att kvantifiera nivåer av luciferas uttryck. Här använder vi Luciferase för att utvärdera bio aktiviteten hos si-NPs genom att leverera siRNA mot Luciferase och kvantifiera motsvarande reduktion i bioluminescens i Luciferase-uttryck celler jämfört med celler som tar emot en kodad siRNA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

Framgången för siRNA som en riktad molekylär medicin är beroende av dess effektiva cytosoliska leverans till celler i vävnaden i patologi. Klinisk framgång för behandling av tidigare "oregerliga" mål för lever sjukdom med siRNA har uppnåtts. Emellertid, effektiv tumör siRNA leverans nödvändigdrar ytterligare farmakokinetiska design överväganden, inklusive lång cirkulations tid, undvikande av clearance organ (t. ex., lever och njurar), och tumör penetration och retention. Här beskriver vi preparering och in vitro fysikalisk-kemisk/biologisk karakterisering av polymernanopartiklar konstruerade för effektiv siRNA leverans, särskilt till icke-hepatiska vävnader såsom tumörer. SiRNA nanopartiklar bereds genom elektro statisk komplexering av siRNA och diblocksampolymerpoly (etylenglykol-b-[2-(dimethylamino) etylmetakrylat-co-butylmetakrylat]) (PEG-dB) för att bilda polyjonkomplex ( polyplexes) där siRNA binds i polyplexkärnan och PEG bildar en hydrofil, neutralladdad Korona. Dessutom, DB blocket blir membran-lytic som vesikler av endolysosomala vägen försura (< pH 6,8), utlöser endosomal flykt och cytosoliskt leverans av siRNA. Metoder för att karakterisera de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos siRNA nanopartiklar såsom storlek, ytladdning, partikelmorfologi och siRNA-lastning beskrivs. Bioaktivitet av siRNA nanopartiklar mäts med luciferas som en modell gen i en snabb och hög genom strömning gen ljud dämpning assay. Konstruktioner som klarar dessa initiala tester (såsom PEG-DB-baserade polyplexes) anses lämpliga för översättning till prekliniska djur studier som bedömer leveransen av siRNA till tumörer eller andra sjukdoms platser.

Vissa väsentliga egenskaper hos effektiva si-NPs för in vivo siRNA leverans är rätt storlek (~ 20-200 nm diameter), siRNA förpackning, och gen tysta bio aktivitet. Även om detta inte är en uttömmande förteckning (som behandlas i diskussionen), bör dessa grundläggande egenskaper bekräftas innan man överväger ytterligare testning av en formulering.
Figur 2 illustrerar karaktäriseringen ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Metoder för att bereda och karakterisera de fysikalisk-kemiska egenskaperna och bioaktiviteten hos neutralt laddade, pH-responsiva siRNA-nanopartiklar presenteras. Kriterier för framgångs rika siRNA nanomedicines som storlek, morfologi, ytladdning, siRNA lastning och nedtystning av gener diskuteras.

Beredning av Neutrally laddade, pH-lyhörd polymera nanopartiklar för Cytosolic siRNA leverans

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Det nuvarande protokollet är betydande eftersom det tillåter forskare att producera siRNA laddade nanopartiklar, och att på lämpligt sätt karakterisera dessa nanopartiklar för att säkerställa deras lämplighet för administrering till djur före efterföljande studier. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att producera nanopartiklar som ökar biotillgängligheten av siRNA och att producera nanopartiklar som är neutralt laddade och därmed lämpade för systemisk administration. Denna teknik är slagkraftiga eftersom siRNA nanopartiklar kan tillämpas för att behandla en myriad av sjukdomar som kräver systemisk administration inklusive cancer, hjärt-kärlsjukdom, och autoimmuna sjukdomar, bland annat.Till att börja, lös polymer i etanol vid en koncentration av 33,3 milligram per milliliter och rör om för att säkerställa upplösning. Använd sedan en pipett för att överföra polymerlösning i 10 millimole citronsyra buffert för att nå en koncentration av 3.33 milligram per milliliter. Tillsätt destillerat vatten i ett rör som innehåller små störande RNA för att uppnå en koncentration på 50 mikromolar.Blanda polymeren och små interferera RNA-lösningarna noggrant i ett rör genom pipettering upp och ner för att uppnå ett kväve-fosfatförhållande på 10. Placera röret vid omgivningstemperatur i 30 minuter. Tillsätt sedan en milliliter på 10 millimolarfosfatbuffert vid pH åtta till röret för att uppnå en koncentration på 0,28 milligram per milliliter och blanda försiktigt antingen genom pipettering eller invertera röret.För att bekräfta att det slutliga pH-värdet är neutralt, runt 7,2 till 7,5, pipetter 10 mikroliter av den lilla störande RNA nanopartiklar lösningen på pH-testremsor. Först förbereda ett dynamiskt ljusspridningsprov genom att filtrera en milliliter av små störande RNA-nanopartiklar vid koncentrationen av 0,28 milligram per milliliter genom 0,45-mikrometer porstorleksspruta filtreras till en fyrkantig kvarts- eller polystyren cuvette. Registrera sedan storlek och ytladdningsmätningar med hjälp av ett dynamiskt ljusspridningsinstrument enligt tillverkarens specifikationer.För att bekräfta storleken och morfologi små störande RNA nanopartiklar med hjälp av transmissionselektronmikroskopi först lägga till fem mikroliter av filtrerade små störande RNA nanopartikellösning på 0,28 milligram per milliliter till varje TEM rutnät. Placera gallren vid omgivningstemperatur i 60 sekunder. Blot torr med filterpapper i tre sekunder.Därefter lägger du till fem mikroliter med 3%uranylacetatlösning till varje rutnät och inkubera i 20 sekunder. Blot torr i tre sekunder. Placera sedan gallren i en exsiccator för att torka över natten innan bildbehandling under transmissionselektronmikroskopi.För att utföra agarosgel retardation, först lägga till två gram elektrofores-grade agaros pulver till 100 milliliter av 1X Tris-acetat-EDTA buffert vid pH åtta i en bägare för att producera 2%agaros gel. Rör om för att upphäva agarose. Placera bägaren som inte avslöjats i en mikrovågsugn för att värma i en till tre minuter tills all agarose är upplöst.När svalnat, tillsätt fem mikroliter ethidiumbromid vid koncentrationen av 10 milligram per milliliter i bägaren och blanda väl. Häll sedan agaros i en gel bricka och placera kam för att producera brunnar. Låt gelen torka i 30 minuter.Ta försiktigt bort kammen för att lämna kvar lastning brunnar, och häll 1X Tris-acetat-EDTA buffert i gel facket för att fylla till maximal fyllning linje. Placera sedan två mikroliter alikvoter av lastning färgämne utan SDS eller reduktionsmedel på paraffinfilm för varje liten störande RNA nanopartikel formulering vid olika kväve till fosfat nyckeltal. Pipetten att blanda 10 mikroliter av små störande RNA nanopartikellösning med lastning färgämne på paraffinfilm.Tillsätt blandningen till agaros gel brunnar. Anslut elektroforessystemet till en strömförsörjning och kör spänningskälla vid 100 volt i 35 minuter eller tills proverna har genomkorsat 80%av gellängden. Överför gelen från brickan till en UV-transilluminator och visualisera de små störande RNA-banden på UV-transilluminatorn enligt tillverkarens specifikationer.Bestäm optimalt kväve till fosfatförhållande baserat på försvinnandet av små störande RNA-band i botten av gelen. För att slå ner modell genen luciferas, första frö luciferas-uttrycker celler i en 96-väl svart walled platta med DMEM i 10%FBS vid en densitet av 2, 000 celler per brunn. Placera plattan i en inkubator över natten så att cellerna att hålla fast.På morgonen ta bort media och tillsätt 10 mikroliter per brunn av små störande RNA nanopartiklar utspädd i full serum media för en slutlig liten störande RNA koncentration av 100 nanomolar. Returnera brunnarna till inkubatorn i 24 timmar för att behandla cellerna med små störande RNA-nanopartiklar. Nästa dag, ersätta media med full serum media som innehåller 150 mikrogram per milliliter D-luciferin.Inkubera cellerna i rumstemperatur i fem minuter innan lumininde på en tallriksläsare mäts. Upprepa sedan mediaförfriskningen två gånger med färska full serummedia fri från D-luciferin, följt av inkubation i 24 timmar. Ersätt media med full serummedia som innehåller 150 milligram per milliliter D-luciferin och inkubera i rumstemperatur i fem minuter.Mät luminience vid 48-timmars tidspunkten. För longitudinella studier, lämna locket ovanpå brunnsplattan när du är utanför biosäkerhetsskåpet för att bibehålla celler under sterila förhållanden och fortsätta inkubationen efter att ha ersatt luciferininnehållande media med färska fullmediemedia. Dynamiska ljusspridningsmätningar visar att små störande RNA-nanopartikel en har en genomsnittlig diameter på 35 nanometer.Förekomsten av en enda topp med smal topp bredd indikerar unimodal fördelning och låg polydispersity. TEM mätningar bekräftar storleken mätning från dynamisk ljusspridning tyder på förekomsten av en enhetlig population av små störande RNA nanopartiklar och avslöjade sfäriska morfologi av de små störande RNA nanopartiklar. För hög koncentration av polymer i beredningssteget resulterade för små störande RNA nanopartikel två i oönskad diameter på större än 200 nanometer, en multimodal och polydispersed population, och aggregat i lösning bildar ingen distinkt partikel morfologi.Både små störande RNA nanopartiklar en och två visa neutrala ytladdning anges med nära noll medelvärdet zeta potentiella värden. Agarose gel retardation assay visar försvinnandet av små störande RNA-band vid gel botten vilket indikerar complexation av små störande RNA till polymer. Polymer complexed small interfering RNA är oförmögen att migrera genom gelen och är därmed visualiseras på toppen av gelen i närheten av lastning brunnar.Eftersom kväve-fosfatförhållandet är ökad liten störande RNA-komplexökningar som indikeras av minskad intensitet hos det lilla störande RNA-bandet vid gelbottnen. Bioaktiva luciferas små störande RNA nanopartikel en uppvisar betydligt minskad luciferas aktivitet jämfört med förvrängd kontroll. I motsats till detta anses inte luciferas små interferera RNA nanopartikel två vara bioaktiva.För att framställa konsekventa siRNA-nanopartiklar med önskade fysikalkemiska egenskaper bör man använda polymerlösningar med lämpliga koncentrationer och validera buffertlösningarnas pH vid varje steg i protokollet. Med hjälp av dessa metoder i vår forskning har vi kunnat producera siRNA nanopartikel-baserade terapier för tidigare undruggable cancerframkallande gener och testa effekten av dessa behandlingar i prekliniska modeller av bröstcancer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering av Diblock polymera nanopartiklar genom Nanoprecipitation Teknik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmerings stamceller i terapeutiska Angiogenes använda biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk tillverkning av polymera och biohybridfibrer med fördesignad storlek och form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartiklar för regenerativ forskning

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porös Silicon Mikropartiklar för leverans av siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymera mikronålmatris Fabrication genom fotolitografi

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabricating superhydrofoba Polymera material för biomedicinska tillämpningar

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Avgivning av terapeutiska siRNA mot CNS Använda katjoniska och anjoniska liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...