Name: preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery
Uploaded: 2019-05-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Yazarlar bu araştırma yürütmek için veri ve laboratuar kaynaklarına erişim için DRS. Craig Duvall ve Rebecca Cook minnettar. Yazarlar, DLS ve TEM (NSF EPS 1004083) enstrümanlarına erişim için nano ölçekli bilim ve mühendislik (VıMSE) için Vanderbilt Enstitüsü 'ne minnettar olurlar. Yazarlar lisansüstü araştırma bursu programı (NSF # 1445197) desteklemek için Ulusal Bilim Vakfı minnettar. Yazarlar mali destek için Ulusal Sağlık Enstitüleri minnettar (NıH R01 EB019409). Yazarlar mali destek (DOD CDMRP OR130302) için savunma Kongre yönetmen tıbbi araştırma programı için minnettar.

1. sı-NPs ' i k i hazırlama ve karakterizasyon
<ol><li>si-NP hazırlama<ol>
<li>10 mM sitrik asit tamponunun (pH 4,0) 3,33 mg/mL 'de polimer çözülür. Polimer önce çözünür sağlamak için etanol içinde 10X konsantrasyonu çözülebilir. Not: Polimer düşük konsantrasyonlarda çözünebilir, ancak 3,33 mg/mL yukarıda konsantrasyonlarda kullanmak homojen NP oluşumunu engelleyebilir.</li>
		<li>SiRNA (50 μM içinde diH2O) Ekle N+:P- oranı 10. Polimer ve siRNA çözümle...

<ol>
	<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).</li><li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs.">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).</li><li>Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference.">RNA interference.</a> Nature. 418, 244 (2002).</li><li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+silent+treatment:+siRNAs+as+small+molecule+drugs.">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li><li>Wittrup, A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knocking+down+disease:+a+progress+report+on+siRNA+therapeutics.">Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).</li><li>Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Intracellular-Acting+Biologics+in+Pro-Apoptotic+Therapies.">Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies.</a> Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+siRNA+nuclease+stability+on+the+in+vitro+and+in+vivo+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing.">Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).</li><li>Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycation-siRNA+nanoparticles+can+disassemble+at+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).</li><li>Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+down+the+barriers:+siRNA+delivery+and+endosome+escape.">Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle&#8211;mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle&#8211;mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).</li><li>Sahay, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+siRNA+delivery+by+lipid+nanoparticles+is+limited+by+endocytic+recycling.">Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+materials+for+siRNA+therapeutics.">Delivery materials for siRNA therapeutics.</a> Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).</li><li>Adams, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patisiran,+an+RNAi+Therapeutic,+for+Hereditary+Transthyretin+Amyloidosis.">Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis.</a> New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).</li><li>Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugging+the+'undruggable'+cancer+targets.">Drugging the 'undruggable' cancer targets.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).</li><li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).</li><li>Verbaan, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+poly(2-dimethyl+amino+ethyl)methacrylate-based+polyplexes+after+intravenous+administration.">The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration.</a> International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).</li><li>Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+cationic+lipids+and+cationic+polymers+in+gene+delivery.">Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).</li><li>Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicine:+progress,+challenges+and+opportunities.">Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+delivery+of+macromolecular+drugs+based+on+the+EPR+effect.">Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).</li><li>Duncan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dawning+era+of+polymer+therapeutics.">The dawning era of polymer therapeutics.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+optimal+size+of+anticancer+nanomedicine.">Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+Cationic+and+Hydrophobic+Content+of+PEGylated+siRNA+Polyplexes+Enhances+Endosome+Escape,+Stability,+Blood+Circulation+Time,+and+Bioactivity+in+vivo.">Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).</li><li>Jackson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zwitterionic+Nanocarrier+Surface+Chemistry+Improves+siRNA+Tumor+Delivery+and+Silencing+Activity+Relative+to+Polyethylene+Glycol.">Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol.</a> ACS Nano. , (2017).</li><li>Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+polyethylenimine-mediated+DNA+transfection+and+the+proton+sponge+hypothesis.">Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis.</a> The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).</li><li>de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+gene:+structure+and+expression+in+mammalian+cells.">Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).</li><li>Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+interaction+with+plasma+proteins+as+it+relates+to+particle+biodistribution,+biocompatibility+and+therapeutic+efficacy.">Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+effects+of+filaments+versus+spherical+particles+in+flow+and+drug+delivery.">Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).</li><li>Chauhan, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanorods+and+nanospheres+for+real-time+in+vivo+probing+of+nanoparticle+shape-dependent+tumor+penetration.">Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).</li><li>Chu, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma,+tumor+and+tissue+pharmacokinetics+of+Docetaxel+delivered+via+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes+in+mice+bearing+SKOV-3+human+ovarian+carcinoma+xenograft.">Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft.</a> Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).</li><li>Werfel, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+mTORC2+Inhibitor+Therapeutically+Blocks+Breast+Cancer+Cell+Growth+and+Survival.">Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival.</a> Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).</li><li>Sarett, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+siRNA+targets+albumin+in+situ+and+promotes+bioavailability,+tumor+penetration,+and+carrier-free+gene+silencing.">Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).</li><li>Williams, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+apoptotic+pathway+activation+increases+response+to+anti-estrogens+in+luminal+breast+cancers.">Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers.</a> Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).</li><li>Evans, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Red+Blood+Cell+Hemolysis+Assay+for+the+Evaluation+of+pH-responsive+Endosomolytic+Agents+for+Cytosolic+Delivery+of+Biomacromolecular+Drugs.">Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).</li><li>Werfel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Optimization+of+PEG+Architecture+and+Hydrophobic+Content+Improves+siRNA+Polyplex+Stability,+Pharmacokinetics,+and+Potency+In+vivo.">Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo.</a> Journal of Controlled Release. , (2017).</li><li>Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Enhanced+Cellular+Uptake+and+Cytosolic+Retention+of+MK2+Inhibitory+Peptide+Nano-polyplexes.">Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).</li><li>Kilchrist, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal8+Visualization+of+Endosome+Disruption+Predicts+Carrier-Mediated+Biologic+Drug+Intracellular+Bioavailability.">Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability.</a> ACS Nano. , (2019).</li></ol>

Burada anlatılan si-NPs, anjiyonik siRNA ve katyonik polimerlerin elektrostatik Birliği ile polyion kompleksine (polyplexes) oluşur. SiRNA 'nın elektrostatik karışımı ve Peg-DB polimerlerin katyonik DB bloğu düşük pH (4,0) ile karıştırılarak kolaylaştırılır. PH 4,0, DMAEMA son derece protonated, ve dolayısıyla DB bloğu yüksek oranda şarj edilir. Bu, polimerlerin, miselleri şekillendirme ve siRNA ile verimli bir şekilde DB kompleksler yerine çözümde unimers olarak çözülmesini sağlar. Daha...

Çünkü sirnas, proteinleri mRNA dizilerinden çevirmesini inhibe ettiği için, teorik olarak bilinen tüm patolojileri1,2,3,4,5' e ilaç olarak kullanabilirler. Ancak, tıpta siRNA kullanımı siRNA moleküllerinin kapsamlı yoksul farmakokinetik profili ile sınırlıdır6,7. İntravenöz olarak enjekte edildiğinde, sirnas böbrekler üzerinden hızla temizlenir ve/veya nükserler ile8,9' a düşer. Büyük boyutu ve negatif şarj nedeniyle, siRNA hücreleri giremezsiniz veya RNA kaynaklı susturma kompleksi erişmek için endolysosomal yol kaçmak (RıSC) sitsol içinde bulunan10,11,12, 13olmak üzere. Böylece, geniş çaba siRNA teslimat stratejileri tasarım ve uygulanması üzerinde duruldu14. Bu çaba büyük ölçüde lipid ve polimer bazlı nanopartiküller gelişimi üzerinde odaklanmıştır hangi paket siRNA, boşluk ve bozulma içinde vivo korumak, ve Able hücresel Alım ve endosomal kaçış ile iyonizlenebilir, katyonik Amin grupları. Birçok klinik öncesi başarı bildirilmiştir ve en son olarak, kalıtsal Transthyretin-aracılı (hATTR) amilidoz15' i tedavi etmek için nanopmadde bazlı hepatik siRNA tesliminde ilk klinik başarıda bildirilmiştir.
Geleneksel Farmakoloji (yani, küçük molekül ilaçlar) tarafından şu anda "undruggable" olan birçok kanser neden genler vardır, polimerik siRNA Nanopartiküllerin tasarımını motive (sı-NPs) kanser tedavisinde16. Ancak, non-hepatik siRNA teslim için dikkate alınmalıdır tasarım parametreleri ayrı bir dizi vardır. Teslimat sistemi sistemik dolaşım içinde aglütinasyon neden Polyplex cationıc şarj kalkanı gerekir17,18,19. Tümör teslim için, özellikle, si-NP stabilitesi bağışlamak uzun sirkülasyon için esastır ve böylece gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi ile tümörler içinde birikmesi artmıştır20,21. Dahası, üzerinde kontrol si-NP boyutu sadece nanopartiküller yaklaşık olarak esastır 20 – 200 Nm çapı boyutu kaldıraç EPR22, ve daha küçük si-NPS (~ 20 – 50 nm çapı) sergi daha büyük ölçekli nano maddeler üzerinde geliştirilmiş tümör penetrasyon ve mikroparçacıklar23.
İntravenöz uygulamadan sonra siRNA 'nın sistemik tümör teslim edilmemesi için bu ek tasarım kısıtlamalarını ele almak için, nötr olarak şarj edilen pH-duyarlı si-NPs geliştirilmiştir (Şekil 1)24. Bu si-NPS pegylated, ya da en son, zwitterionated25, nötr yüzey şarj ve protein adsorpsiyon ve dolaşım opsonizasyonla direnci için. Sadece hücre içi teslimat götürmek için katyonik karakter güvenemezsiniz beri, son derece verimli endosomal kaçış güçlü gen susturma elde etmek için zorunludur. Buna göre, bu si-NPS ' nin çekirdeği, ekstrasellüler pH 'da (7,4) inert olan, ancak endolysosomal yolunun asitlendirilmiş koşullarında anahtar benzeri bir şekilde tetiklenen yüksek endosomolitik çekirdeğden oluşur [pH 6,8 (erken endosomes) – 5,0 ( lysosomes)]. Son olarak, sı-NPs ' i k i çekirdek içindeki katyonik ve hidrofobik içeriğin bir karışımı, hem elektrostatik hem de Van der Waals stabilizasyon kuvvetlerini sağlar, sadece katyonik sistemlere kıyasla kan içinde sı-NPs ' i k i stabilitesini geliştirir.
Nispeten basit bir tasarıma birçok fonksiyonun entegrasyonu, karmaşık mimari ve hassas kompozisyon ile polimerler üretmek için geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) kontrollü polimerizasyon kullanılarak mümkündür. Sı-NPs ' i nötr yüzey şarjı, pH-duyarlılık ve NP stabilitesi ile üretmek için, RAFT Poly (etilen glikol-b-[2-(dimethylamino) etil metakrilgeç-Co-butil metakrilgeç]) (Peg-DB; Şekil 1a). PEG-DB, siRNA ile Electrostatik olarak karmaşıkmış, si-NPs ' i PEG Korona ve DB/siRNA çekirdeği ile şekillendirdi (Şekil 1B). PEG, sı-NP Korona üzerinde inert, nötrsel olarak şarj edilmiş bir hidrofilik tabaka oluşturur. DB bloğu 2-(dimethylamino) etil metakrilgeç (DMAEMA) ve butil metakrilgeç (BMA) 50:50 molar oranından oluşur. Cationic DMAEMA elektrostatik kompleksleri negatif-siRNA şarj. Van der Waals etkileşimleri tarafından NP çekirdek içinde BMA Self-Associates, NP istikrarı artan. Birlikte, dmaema ve BMA, DB polimer bloğuna pH bağımlıdır lipid bilayer-lytic davranışlarını vermek. Hücre dışı pH 'da, DB bloğu si-NP çekirdeğine göre kullanılır ve lipid bilayerine inert olur. Asidik koşullar altında, endolysosomal yol içinde olanlar gibi, DB bloğu içinde iyonizable DMAEMA proton sünger etkisini kolaylaştırır, endosomal tamponlama osrotik şişme ve rüptür26yol açar. Ayrıca, DB bloğundaki hidrofobik BMA moisanları, lipid bilayerine aktif olarak entegre olup, güçlü endosomoliz ile sonuçlanır. Bu nedenle, siRNA PEG-DB ile anatomik olarak şarj edilmiş ve hücre içi pH 'da son derece kararlı olan sı-NPs ' l e, ancak Asidik pH 'da lipid bilayerleri bozarak, siRNA yükü sitomik teslim edilmesini sağlayarak karmaşıklık oluşturmaktadır.
Burada, PEG-DB ' e si-NPs üretmek için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Fizikokimyasal parametreler ve si-NPS biyoaktivite karakterize yöntemleri sunulmuştur ve tartışılır. Si-NP biyoaktivitesini hızla değerlendirmek için, Lusiferaz, sahte çalışmalar için model geni olarak kullanılır. Firefly luciferase, ateşböcekleri27' in ' Glow ' sorumlu proteindir. Buna göre, Firefly Lusiferaz geni ile nakledilmiş olan memelinin hücreleri, Lusiferaz ifadesinin seviyelerini ölçmek için bir Luminometre kullanılarak yakalanabilir bir Bioluminesans ' Glow ' üretir. Burada, biz luciferase karşı siRNA teslim ve luciferase içinde biyolüminesans karşılık gelen azalma ölçülmesi ile sı-NPS biyoaktivite değerlendirmek için Lucia kullanın

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 mm pore-size syringe filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F25133</td>
			<td>17 mm diameter, PTFE membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-14 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>AM9869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-7.7 pH test strips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black walled plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Powder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88294</td>
			<td>Monopotassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Invitrogen</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells</td>
			<td>GenTarget Inc</td>
			<td>SC059-Bsd</td>
			<td>Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic sodium phosphate monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scarmbled siRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square polystyrene cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-129</td>
			<td>4.5 mL capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM grids</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>1GC50</td>
			<td>PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of neutrally-charged, ph-responsive polymeric nanoparticles for cytosolic sirna delivery

SiRNA 'nın hedeflenen bir moleküler tıp olarak başarısı, patolojinin dokusu içindeki hücrelere verimli sitosolik teslimine bağlıdır. SiRNA ile daha önce ' undruggable ' hepatik hastalık hedeflerini tedavi etmek için klinik başarı elde edilmiştir. Ancak, verimli tümör siRNA teslim uzun dolaşım süresi, boşluk organları kaçırma (örneğin, karaciğer ve böbrek), ve tümör penetrasyonu ve tutma dahil olmak üzere ek farmakokinetik tasarım hususları gerektirir. Burada, özellikle tümör gibi non-hepatik dokularda, verimli siRNA dağıtımı için tasarlanan polimerik Nanopartiküllerin hazırlanması ve in vitro fizikokimyasal/biyolojik karakterizasyonu açıklanmaktadır. SiRNA nanopartiküller siRNA 'nın elektrostatik karmaşıklığı ve diblock kopolimer Poly (etilen glikol-b-[2-(dimethylamino) etil metakrilgeç-Co-butil metakrilgeç]) (Peg-DB) ile polyion kompleksler oluşturacak şekilde hazırlanmıştır ( polyplexes) nerede siRNA Polyplex çekirdek içinde strestered ve PEG formları hidrofilik, nötrally şarj Korona. Ayrıca, DB bloğu endolysosomal yolu asidify (< pH 6,8) veziküller olarak membran-lytic olur, endosomal kaçış ve siRNA sitosolik teslim tetikleyen. Boyut, yüzey yükü, parçacık Morfoloji ve siRNA yükleme gibi siRNA nanopartiküllerinin fizikokimyasal özelliklerini karakterize etme yöntemleri açıklanmıştır. SiRNA nanopartiküller bioactivity hızlı ve yüksek verimlilik gen susturma tahlil bir model geni olarak Lusiferaz kullanılarak ölçülür. Bu ilk testleri (PEG-DB tabanlı polyplexes gibi) geçen tasarımlar, siRNA 'nın tümörlere veya diğer patolojiler için teslimatını değerlendiren ön klinik hayvan çalışmalarına çeviri için uygun kabul edilir.

İn vivo siRNA teslimat için etkili si-NPS bazı temel özellikleri uygun boyutta (~ 20 – 200 Nm çapı), siRNA paketleme ve gen susturma biyoaktivite vardır. Bu kapsamlı bir liste olmadığında (tartışmada belirtildiği gibi), bu temel özelliklerin bir formülasyonun daha fazla test edilmesini dikkate almadan önce onaylanması gerekir.
Şekil 2 formülasyon üzerine sı-NP boyutu ve yüze...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery at JoVE.com

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Fizikokimyasal özellikleri hazırlamak ve karakterize etmek için yöntemler ve nöphalı, pH duyarlı siRNA nanopartiküller biyoaktivite sunulmaktadır. Boyut, morfoloji, yüzey yükü, siRNA yüklemesi ve gen susturulması gibi başarılı siRNA nanometinler için kriterler tartışılmaktadır.

Sitosolik siRNA teslim için Nötrsel olarak şarj edilmiş, pH duyarlı polimerik nanopartiküller hazırlanması

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

AraştırmacılarSs siRNA yüklü nano tanecikleri üretmek için izin verir, çünkü mevcut protokol önemlidir, ve yeterli sonraki çalışmalardan önce hayvanlara uygulanması için uygunluk sağlamak için bu nano tanecikleri karakterize etmek. Bu yaklaşımın avantajı, siRNA'nın biyoyararlanımını artıran nano partiküller üretmek ve nötra yüklü ve böylece sistemik uygulama için uygun olan nano tanecikleri üretmektir. SiRNA nano tanecikleri diğerleri arasında kanser, kardiyovasküler hastalık ve otoimmün bozukluklar da dahil olmak üzere sistemik yönetimi gerektiren hastalıkların sayısız tedavisinde uygulanabilir, çünkü bu teknik etkilidir.Başlamak için, mililitre başına 33.3 miligram konsantrasyonda etanol polimer çözünür ve çözünme sağlamak için karıştırın. Sonra mililitre başına 3,33 miligram konsantrasyonulaşmak için 10 milimolar sitrik asit tampon polimer çözeltiaktarmak için bir pipet kullanın. 50 mikromolar konsantrasyonu elde etmek için küçük müdahale RNA içeren bir tüp içine distile su ekleyin.Polimer ve küçük müdahale civarı RNA çözeltilerini bir boru içinde iyice karıştırarak 10 fosfat oranına azot elde edin. Tüpü ortam sıcaklığında 30 dakika yerleştirin. Daha sonra mililitre başına 0,28 miligram konsantrasyon elde etmek için pH 8'de 10 milimolar fosfat tamponunun bir mililitresini tüpe ekleyin ve boruyu boruyla veya ters çevirerek hafifçe karıştırın.Son pH'ın nötr olduğunu doğrulamak için, yaklaşık 7,2 ila 7,5, pipet 10 mikrolitre küçük müdahale eden RNA nano tanecikleri çözeltisi pH test şeritleri üzerine. İlk olarak, bir mililitre küçük müdahale eden RNA nano partiküllerini mililitrelik bir mililitreyi mililitrelik bir milimetrelik konsantrasyonda mililitrelik bir milimetrelik gözenek boyutuşırve 0,45 mikrometrelik gözenek boyutuşırşırşfiltrelerini kare kuvarsveya polistiren çivisine filtreleyerek hazırlayın. Daha sonra üreticinin özelliklerine göre dinamik bir ışık saçılma aleti kullanarak boyut ve yüzey şarj ölçümleri kaydedin.İletim elektron mikroskobu kullanarak küçük müdahale eden RNA nano partiküllerinin boyutunu ve morfolojisini doğrulamak için ilk olarak her TEM şebekesine mililitre başına 0,28 miligram da filtrelenmiş küçük müdahaleci RNA nanopartikül çözeltisi beş mikrolitre ekleyin. Izgaraları ortam sıcaklığına 60 saniye yerleştirin. Üç saniye boyunca filtre kağıdı ile kuru lekeler.Daha sonra, her ızgara için% 3 uranyl asetat çözeltisi beş mikrolitre ekleyin ve 20 saniye kuluçka. Leke üç saniye kuru. Daha sonra iletim elektron mikroskobu altında görüntüleme önce bir gecede kurulamak için bir kurulaştırıcı ızgaraları yerleştirin.Agarose jel geriliği gerçekleştirmek için, ilk 100 mililitre 1X Tris-asetat-EDTA tampon için elektroforez dereceli agarose tozu iki gram ekleyin pH sekiz bir kabın% 2 agarose jel üretmek için. Agarose askıya almak için karıştırın. Tüm agarose çözülene kadar bir ila üç dakika ısıtmak için bir mikrodalga içinde ortaya çıkarılan kabı yerleştirin.Soğuduktan sonra, kabın içine mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda beş mikrolitre ethidyum bromür ekleyin ve iyice karıştırın. Sonra bir jel tepsiye agarose dökün ve kuyu üretmek için tarak yerleştirin. Jel30 dakika kuru.Yükleme kuyularını geride bırakmak için taramayı dikkatlice çıkarın ve maksimum dolgu hattına doldurmak için jel tepsisine 1X Tris-asetat-EDTA tamponu dökün. Daha sonra, fosfat oranlarına göre farklı azotta her küçük müdahale eden RNA nanopartikül formülasyonu için parafin filmine SDS olmadan veya çözücü ajanlarla iki mikrolitre boya yerleştirin. Pipet parafin film yükleme boya ile küçük müdahale RNA nanopartikül çözeltisi 10 mikrolitre karıştırmak için.Agarose jel kuyularına karışımı ekleyin. Elektroforez sistemini bir güç kaynağına takın ve 100 voltluk voltaj kaynağını 35 dakika boyunca veya numuneler jel uzunluğunun %80'ini geçene kadar çalıştırın. Jeli tepsiden UV transilluminator'a aktarın ve UV transilluminator'daki küçük müdahale eden RNA bantlarını üreticinin özelliklerine göre görselleştirin.Jelin altındaki küçük müdahale eden RNA bantlarının kaybolmasına bağlı olarak fosfat oranına optimum nitrojeni belirleyin. Model gen luciferase yıkmak için, ilk tohum luciferase ifade hücreleri 96-iyi siyah duvarlı plaka DMEM ile 10% FBS bir yoğunlukta 2, 000 hücre başına. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için bir gece boyunca bir kuvöz içine plaka yerleştirin.Sabah ları ortam kaldırın ve 100 nanomolar son küçük müdahale RNA konsantrasyonu için tam serum ortamiçine seyreltilmiş küçük müdahale RNA nano tanecikleri kuyu başına 10 mikrolitre ekleyin. Küçük müdahale eden RNA nano tanecikleri ile hücreleri tedavi etmek için 24 saat boyunca kuvözkuyular dönün. Ertesi gün, mililitre D-luciferin başına 150 mikrogram içeren tam serum media ile medya değiştirin.Bir plaka okuyucu üzerinde parlaklık ölçmeden önce beş dakika oda sıcaklığında hücreleri kuluçka. Daha sonra d-luciferin içermeyen taze tam serum media ile iki kez medya ferahlık tekrarlayın, 24 saat kuluçka takip. Ortamı mililitre D-luciferin başına 150 miligram içeren tam serum media ile değiştirin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.48 saatlik zaman noktasında parlaklığı ölçün. Uzunlamasına çalışmalar için, steril koşullar altında hücreleri korumak ve taze tam medya ile luciferin içeren medya yerine sonra kuluçka devam etmek için biyogüvenlik kabine dışında zaman kuyu plaka üstüne kapak bırakın. Dinamik ışık saçılma ölçümleri küçük müdahaleci RNA nanopartikül ünün ortalama çapının 35 nanometre olduğunu göstermektedir.Dar tepe genişliğine sahip tek bir tepenin varlığı tek modal dağılım ve düşük polidispersitliği gösterir. TEM ölçümleri, dinamik ışık saçılımından elde edilen boyut ölçümlerinin, küçük müdahaleci RNA nano partiküllerinin tek tip popülasyonunun varlığını gösterdiğini ve küçük müdahaleci RNA nano partiküllerinin küresel morfolojisini ortaya çıkarmasını sağlar. Hazırlık adımında polimerin çok yüksek konsantrasyonu, 200 nanometreden daha fazla istenmeyen çapta küçük müdahale rna nanopartikül iki, multimodal ve polidispersed popülasyon ve farklı parçacık morfolojisi oluşturan çözeltideki agregalar için sonuçlandı.Her iki küçük müdahale RNA nano tanecikleri bir ve iki ekran nötr yüzey yükü sıfıra yakın ortalama zeta potansiyel değerleri ile gösterilir. Agarose jel geriliği töz, jel insanın altındaki küçük müdahale cihetindeki Küçük müdahaleci RNA bantlarının kayboluşunu gösterir ve bu da küçük müdahale cihetinin polimere karmaşıklaşmasını gösterir. Polimer karmaşık küçük müdahale RNA jel yoluyla göç edemiyor ve böylece yükleme kuyuları yakın jel üst kısmında görselleştirilmiş.Azot-fosfat oranı arttıkça jel alt kısmında küçük müdahale RNA bandının yoğunluğuazalmış olarak belirtildiği gibi küçük müdahale RNA karmaşıklığı artar. Biyoaktif luciferase küçük interferans RNA nanopartikül bir önemli ölçüde karışık kontrol ile karşılaştırıldığında azalmış luciferase aktivitesi sergiler. Buna karşılık, luciferase küçük interferans RNA nanopartikül iki biyoaktif olarak kabul edilmez.İstenilen fizyokimyasal özelliklere sahip tutarlı siRNA nano partikülleri üretmek için, uygun konsantrasyonlarda polimer çözeltileri kullanmalı ve protokolün her adımında tampon çözeltilerinin pH'ını doğrulamalıdır. Araştırmamızda bu yöntemleri kullanarak daha önce ilaçlandırılmaz kansere neden olan genler için siRNA nanopartikül bazlı tedaviler üretebildik ve bu tedavilerin etkinliğini meme kanserinin klinik öncesi modellerinde test ettik.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanoprecipitation Tekniği Diblock Polimerik Nanopartiküller formülasyonu

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Biyobozunur polimerik nano partiküllerin kullanılması Tedavi Angiogenezis Programlama Kök Hücreler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Önceden Tasarlanmış Boyut ve Şekle Sahip Polimerik ve Biyohidred Elyafların Mikroakışkan İmalatı

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Biyomedikal Uygulamalar için Süperhidrofobik Polimer Malzemeler imalatı

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...