Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بمصادر التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R00-CA197672-01A1). كانت الخلايا الصغيرة لسرطان الرئة (SHP77 و H82) هديه سخية من المركز الطبي لجنوب غرب البلاد ، جون مينا وعدي غازدار.

1. اعداد المخزن المؤقت والتخزين
<ol><li>اعداد 50 mL من 1x الأوراق المالية RNase-/Dnase-rfree NP-40 تحلل العازلة (10 ملم تريس-HCl [pH 8.0] ، 1 مم MgCl2، 1 مم ايثيلنديدياتيتاتاتاستيك حمض (أدتا) ، 1 ٪ [المجلد/المجلد] NP-40 ، 10 ٪ [vol/vol] الجلسرين ، 150 Mm nacl ، 5 مم β-mercaptoethanol ، و 0.1 mm 4- هيدروكلوريد فلوريد بينزينيسولفونيل (AEBSF بنك). ...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

يعد قياس نشاط التيلوميراز أمرا حاسما بالنسبة لعدد كبير من المواضيع البحثية بما في ذلك ، علي الرغم من عدم الاقتصار علي ، السرطان ، والبيولوجيا التيلوميريه ، والشيخوخة ، والطب التجديدي ، وتصميم الادويه المستندة إلى البنية. التيلوميراز RNPs منخفضه الوفرة ، حتى في الخلايا السرطانية ، مما يجعل ?...

التيلوميرات هي مركبات حيوية من بروتين الحمض النووي في نهايات الكروموسومات الخطية. وتتكون التيلوميرات البشرية من مجموعه من 5 '-TTAGGGn هيكامريميك تكرار التي تختلف في الطول بين 12-15 كيلوبياسيس (kb) عند الولادة1. الإنسان التيلوميراز ، انزيم ريبونكليوبروتين الذي يحافظ علي التيلوميرات ، تم تحديده لأول مره في خليه هيلا (خط الخلايا السرطانية)2. معا ، تلعب التيلوميرات والتيلوميراز دورا رئيسيا في طيف من العمليات البيولوجية مثل حماية الجينوم ، وتنظيم الجينات ، وخلود الخلايا السرطانية3،4،5،6.
يتكون التيلوميراز البشري في المقام الأول من مكونين رئيسيين ، هما الناسخ العكسي التيلوميراز والحمض الريبي التيلوميراز (hTERT و Htert ، علي التوالي). الوحدة الفرعية للبروتين ، hTERT ، هي مكون الناسخ العكسي النشط المحفز لانزيم التيلوميراز. يوفر قالب RNA ، hTERC ، التيلوميراز مع القالب لتمديد و/أو الحفاظ علي التيلوميرات. معظم الانسجه الجسدية البشرية ليس لها نشاط قابل للكشف عن التيلوميراز. ان عدم قدره البوليميرات الحمض النووي علي تمديد نهاية الحبل المتخلف من الحمض النووي إلى جانب عدم وجود التيلوميراز يؤدي إلى التقصير التدريجي للوميرات بعد كل جولة من الانقسام الخلوي. وتؤدي هذه الظواهر إلى تقصير التيلوميريه في معظم الخلايا الجسدية حتى تصل إلى الطول المختصر للغاية ، حيث تدخل الخلايا حاله من الشيخوخة التكرارية. والعدد الأقصى من المرات خليه يمكن تقسيم تمليه طول التيتيمير وهذا كتله لاستمرار انقسام الخلايا ويعتقد لمنع التقدم إلى اونكوجينيسيس7. الخلايا السرطانية قادره علي التغلب علي الشيخوخة المستحثة التيلوميريه والاستمرار في التكاثر عن طريق استخدام التيتيلوراز للحفاظ علي التيلوميرات. وينشط حوالي 90% من السرطانات التيلوميراز ، مما يجعل نشاط التيلوميراز مهما للغاية في كل من الكشف عن السرطان وعلاجه.
وكان تطوير اختبار الفخ في التسعينات مفيدا في تحديد المكونات الضرورية لانزيم التيلوميراز ، فضلا عن قياس التيلوميراز في مجموعه واسعه من الخلايا والانسجه ، سواء كانت طبيعيه أو سرطانيه. الأصلي المستندة إلى هلام الفحص PCR تستخدم راديوب# نشاط المسمي ركائز الحمض النووي للكشف عن النشاط التيلوميراز. في 2006, تم تكييف الفحص في شكل غير مشع باستخدام فلوريسسينتلي المسمي ركائز8,9. باستخدام ركائز فلوريسسينتلي المسمية ، كان المستخدمون قادرين علي تصور منتجات تمديد التيلوميراز كعصابات علي هلام من خلال تعريضه لطول الموجه الاثاره الصحيحة. وقد جعلت حساسية الفحص فخ وقدرته علي الكشف عن النشاط التيلوميراز في الخلايا الخام لهذا الفحص الطريقة الأكثر استخداما للكشف عن النشاط التيلوميراز. ومع ذلك ، الفحص فخ له قيود. ويستند الفحص إلى الهلام ، مما يجعل من الصعب اجراء النسخ المتماثلة الضرورية في الدراسات المتوسطة إلى العالية الانتاجيه ، التالي ، نادرا ما يتحقق التحليل الإحصائي السليم. وعلاوة علي ذلك ، من الصعب تحديد الفحص القائم علي الهلام بشكل موثوق بسبب عدم قدره الكشف عن الاختلافات المزدوجة في نشاط التيلوميراز بين العينات. التغلب علي هذين القيدين أمر بالغ الاهميه لاختبارات النشاط الانزيمي مثل فخ للانتقال إلى الإعدادات السريرية أو الصناعية للكشف عن نشاط التيلوميراز في عينات المريض أو دراسات تصميم المخدرات.
تم تطوير PCR الرقمية في البداية في 1999 كوسيلة لتحويل الطبيعة الاسيه والتناظرية من PCR إلى الفحص الخطي والرقمي10. الحبريه الرقمية PCR (ddPCR) هو أحدث الابتكارات من منهجيه PCR الرقمية الاصليه. وجاءت القطرة الرقمية PCR مع ظهور ميكروفلويديكس المتقدمة والنفط في المياه مستحلب الكيمياء لتوليد موثوق بها قطرات مستقره والحجم علي قدم المساواة. علي عكس الهلام القائم وحتى PCR الكمي (qPCR) ، ddPCR يولد التحديد الكمي المطلق للمواد المدخلة. المفتاح إلى ddPCR هو توليد التفاعلات الفردية ~ 20,000 عن طريق تقسيم عينات إلى قطرات. بعد نقطه النهاية PCR ، يمسح القارئ القطيرات كل قطره في الأزياء التي تشبه التدفق المضخم للخلايا ، والعد ، والتحجيم ، وتسجيل وجود أو غياب الفلورية في كل قطره فرديه (اي غياب أو وجود الرموز المصغرة PCR في كل قطره). ثم ، باستخدام توزيع بواسون ، يتم تقدير جزيئات الإدخال استنادا إلى نسبه القطرات الموجبة إلى العدد الإجمالي للقطيرات. يمثل هذا الرقم تقديرا لعدد جزيئات الإدخال في كل PCR. وعلاوة علي ذلك ، يتم تنفيذ ddPCR وتحليلها علي لوحه 96 البئر الذي يسمح للمستخدم لتشغيل العديد من العينات ، فضلا عن أداء البيولوجية والتقنية والنسخ المتماثلة للتحليل الإحصائي السليم. ونتيجة لذلك ، فقد جمعنا بين القياس الكمي القوي والطبيعة المتوسطة الانتاجيه لddpcr مع مقايسة الفخ لتطوير الفحص الخاص ب Ddpcr11. تم تصميم هذا الفحص للمستخدمين لدراسة وتحديد كميه النشاط التيلوميراز المطلق من العينات البيولوجية11،12. وتسمح حساسية ddTRAP بالتحديد الكمي لنشاط التيلوميراز من العينات المحدودة والثمينة ، بما في ذلك قياسات الخلايا الواحدة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن للمستخدمين أيضا دراسة اثار التلاعب التيلوميراز و/أو المخدرات مع التحديد الكمي المطلق لأقل من التغييرات مزدوجة (~ 50 ٪ الاختلافات). و ddTRAP هو التطور الطبيعي لفحص فخ في الطبيعة الرقمية والانتاجيه العالية من التجارب المختبرية الحديثة والإعدادات السريرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

ان بروتوكول تضخيم التيلوميريه (فخ) هو الاختبار الأكثر استخداما للكشف عن نشاط التيتيلوراز داخل عينه معينه. يسمح الأسلوب القائم علي تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) باجراء قياسات قويه لنشاط الانزيم من معظم الخلايا الخلوية. فخ القائم علي هلام مع فلوريسسينتلي المسمي الإشعال حدود الانتاجيه عينه ، والقدرة علي الكشف عن الاختلافات في عينات يقتصر علي اثنين اضعاف أو أكبر التغييرات في نشاط الانزيم. فخ الرقمية الحبريه, ddTRAP, هو نهج حساسة للغاية التي تم تعديلها من المقايسة فخ التقليدية, تمكين المستخدم من اجراء تحليل قوي علي 96 عينات لكل تشغيل والحصول علي التحديد الكمي المطلق للحمض النووي (التيلوميراز تمديد المنتجات ) المدخلات داخل كل PCR. ولذلك ، فان فحص ddTRAP المطور حديثا يتغلب علي القيود التي تفرضها المقايسة التقليدية القائمة علي الهلام ويوفر نهجا أكثر كفاءه ودقه وكميه لقياس نشاط التيلوميراز داخل المختبرات والإعدادات السريرية.

باستخدام ddTRAP ، تم قياس نشاط التيلوميراز في لوحه خليه تتكون من خطوط الخلايا التالية (الشكل 1): سرطان الرئة غير الصغيرة للخلايا (H2882 ، H1299 ، Calu6 ، H920 ، A549 ، و H2887) ، وسرطان الرئة الخلوية الصغيرة (H82 و SHP77) ، والسلبية التيلوميراز الخلايا الليفية (BJ). 1,000,000 الكريات الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

قمنا بنجاح بتحويل معيار التضخيم المكرر لبروتوكول التيتيمير (فخ) ليتم استخدامه في التفاعلات المتسلسلة الرقمية للبوليميريز. هذا الفحص الجديد ، ويسمي ddTRAP ، هو أكثر حساسية وكميه ، مما يسمح للكشف بشكل أفضل والتحليل الإحصائي للنشاط التيلوميراز داخل الخلايا البشرية المختلفة.

المصيدة الرقمية الحبريه (ddTRAP): تكييف بروتوكول تضخيم التيتيمير المكرر إلى التفاعل المتسلسل الرقمي لسلسله البلمره

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

يوفر مقايسة ddTRAP القدرة على الحصول على قياس حساس وقوي وكمي للغاية للنشاط الأنزيمي الذيلوميرازي في الخلايا. القدرة على تشغيل ما يصل إلى 96 عينات لكل تشغيل بطريقة متوسطة الإنتاجية يقدم لنا ميزة كبيرة. يمكننا تشغيل عناصر التحكم و نسخ متماثلة للتحليل الإحصائي السليم على البيانات التي تم جمعها.مباشرة قبل lysing الخلية، ذوبان aliquot المجمدة من NP-40 تحلل العازلة. بمجرد إذابة، ضع عازلة التحلل على الجليد. إضافة مثبطات بروتياز PMSF إلى العازلة تحلل NP-40 للوصول إلى تركيز النهائي من 0.2 ملليمولار.ثم، إضافة 40 ميكرولترات من العازلة تحلل إلى أنبوب يحتوي على بيليه خلية للوصول إلى معادلة الخلية من 25،000 خلية لكل ميكرولتر. بلطف ماصة وlysate صعودا وهبوطا من أجل كسر فتح الخلايا. في محاولة لتجنب صنع فقاعات.السماح للخلايا لlyse على الجليد لمدة 30 دقيقة. دوامة بلطف lysate كل 10 دقائق لمنع مجموعات من حطام الخلية من تشكيل. أثناء تحلل الخلية ، قم بإعداد مزيج رئيسي في أنبوب microcentrifuge لرد فعل تمديد التيلوميراز ، وتخزينه على الجليد.بعد تحلل الخلية، ماص 48 ميكرولترات من التمديد مزيج رئيسي في كل أنبوب PCR. إضافة اثنين من microliters من lysate المخفف إلى كل أنبوب PCR للوصول إلى معادلة الخلية النهائية من 50 خلية لكل ميكرولتر، ومواصلة رد فعل تمديد التيلوميراز وفقا للمخطوطة. إعداد مزيج رئيسي في أنبوب microcentrifuge لdDTRAP، والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة.Pipette 19.8 ميكرولترات من مزيج سيد ddPCR في كل أنبوب PCR. إضافة 2.2 ميكرولترات من حل رد فعل التمديد السابق لكل أنبوب، وترك حجم إجمالي من 22 ميكرولترات. لإعداد خرطوشة توليد القطيرات، قم أولاً بتحميل 20 ميكرولترات من الحل المعد في العينة الوسطى بشكل جيد في الخراطيش.اضغط بلطف على جانب الكارتريدج لنقل أي فقاعات إلى أعلى الحل. يجب تحميل جميع آبار الكارتريدج مع عينة قبل تحميل النفط. ثم، تحميل 70 ميكرولترات من النفط توليد قطرات في بئر النفط الأيسر.تأمين طوقا في مكان عن طريق ربطه إلى نهايات خرطوشة، ووضع خرطوشة محملة وتجميعها في مولد قطرة. يظهر المولد الضوء الأخضر الصلب لإبلاغ الكارتريدج يتم وضعه بشكل صحيح. بعد 60 إلى 90 ثانية، عندما يتوقف ضوء مولد وامض، تكون الدورة كاملة.الآن قم بإزالة الكارتريدج. قم بإزالة طوقا من الخراطيشة برفق. استخدام ماصة متعددة القنوات إلى ماصة ما يقرب من 40 ميكرولترات من قطرات ولدت حديثا من الحق في بئر إلى 96 جيدا PCR لوحة.قم بختم لوحة مع رقائق الألومنيوم PCR لوحة الأختام مرة واحدة يتم تحميل جميع العينات في لوحة 96-جيدا لمنع التبخر. ثم، تحميل لوحة 96-جيدا في ثيرسيكلولر لأداء تفاعل PCR. للبدء ، قم بتحميل لوحة 96-well في قارئ القطرات.توجيه لوحة بشكل صحيح بحيث يطابق نموذج A1 أن من حامل. افتح البرنامج المرتبط بقارئ القطرات. انقر نقرًا مزدوجًا فوق أول بئر ، A01 ، لفتح شاشة محرر العينة جيدًا.انقر على التجربة، وحدد نوع الفحص الذي سيتم استخدامه من القائمة المنسدلة. حدد QX200 ddPCR EvaGreen Supermix كطريقة الكشف الصحيحة. انقر على تطبيق في الجانب الأيسر السفلي من شاشة محرر البئر لحفظ الإعدادات المعرفة من قبل المستخدم في جميع الآبار المميزة.بعد ذلك، انقر فوق الهدف في شاشة محرر البئر، وانقر على القائمة المنسدلة الهدف لتحديد عنصر تحكم غير معروف أو مرجع أو عدم وجود قالب لتحديد نوع العينة. في المقطع اسم العينة تسمية كافة النماذج ثم انقر فوق تطبيق. انقر فوق تشغيل لقراءة اللوحة.حدد إما أعمدة أو صفوف في شاشة خيارات التشغيل عند مطالبتك بإعلامك حول الاتجاه الذي يجب أن تقرأ فيه اللوحة. تحديد عدد القطرات المقبولة لكل عينة بالنقر المزدوج على الآبار الفردية أو رؤوس الأعمدة والصف لتوفير جدول معلومات. بالنسبة لـ ddTRAP، فإن العينات التي بها 10000 قطرة مقبولة أو أكثر صالحة لمزيد من التحليل.تسليط الضوء على الآبار التي تمثل نماذج مكررة وعينات المجلس الوطني الانتقالي. تعيين عتبة يدوياً للعينات بالنقر على رمز لتعيين عتبات على أسفل يسار الشاشة. في هذا البروتوكول، تم قياس نشاط التيلوميراز في لوحة الخلايا التي تتكون من تسعة خطوط الخلايا من سرطان الرئة والتيلوميراز السلبية الخلايا الليفية.تم تعيين عتبة في حوالي 2،000 سعة الفلورنس لجميع النسخ البيولوجية الثلاثة لSHP77، H2887، NTC. وكان قطرات إيجابية كثافة الفلوريسين حول 6،000 السعة الفلورية، والتي شكلت سكاناً واضحة في الجزء العلوي، وفصلت عن قطرات سلبية حوالي 1، 100 السعة الفلورية. تم تقدير مجموع منتجات تمديد التيلوميراز لكل مكافئ خلية بين جميع العينات من التركيز المقاس للأحماض النووية، والذي يمثل نشاط التيلوميراز في خطوط سرطان الرئة.أي تلوث RNase أثناء خطوات تفاعل التحلل أو التمديد سوف تدمر التيلوميراز النشاط الأنزيمي لأنه مركب ribonucleoprotein. ddTRAP يمكن أن يتبع مع ddPCR على مستويات التعبير hTERT مرنا في الخلية. وتتيح لنا مجموعتان من البيانات ربط تعبير hterT بنشاط التيلوميراز والتعمق في الآليات التنظيمية المحتملة التيلوميرازية مثل الربط البديل.يمكننا استكشاف التلاعب بعوامل الربط محددة وآثارها على نشاط التيلوميراز. حاليا، ونحن على تصميم oligonucleotide التضمينات والعقاقير المحتملة التيلوميراز النشاط.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

تعديل محطة الطرفية تقييد جزء تحليل لقياس طول تيلومير باستخدام التهجين في هلام

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

الكشف عن متغير CDH1 نسخة نادرة في الأنسجة المجمدة الطازجة سرطان المعدة ببكر الرقمية المستندة إلى شرائح

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

التحليل الرقمي للتلطيخ المناعي للبروتين المتفاعل ZW10 في أنسجة الرئة البشرية

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

نقاط النهاية الهامة وعلامات التكاثر لتقييم إصابات الأمعاء الصغيرة والتكيف باستخدام نموذج الماوس من الغشاء المخاطي الناجم عن العلاج الكيميائي

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

الكشف عن الانصهار الجيني الأنسيوجيني باستخدام تفاعل سلسلة بوليميراز متعددة المضاعفات متبوعاً بتسلسل الجيل التالي

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

التنميط المكاني الرقمي لتوصيف البيئة المكروية في الورم الدبقي المتسلل بشكل منتشر من النوع البالغ

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...