Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende finansieringskilder fra de nationale sundhedsinstitutter (NIH) (NIC-r00-CA197672-01A1). Små celle lungecancer linjer (SHP77 og H82) var en generøs gave fra DRs. John Minna og ADI Gazdar fra UT Southwestern Medical Center.

1. klargøring og oplagring af buffer
<ol><li>Forbered 50 mL 1x lager RNase-/DNase-fri NP-40 lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA), 1% [Vol/Vol] NP-40, 10% [Vol/Vol] glycerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoethanol og 0,1 mm 4- benzensulfonylfluoridhydrochlorid (AEBSF)). Denne buffer kan aliciteres og opbevares ved-20 °C til fremtidig brug. Undgå frost/optønings cyklusser for at opnå optimal lysis af cellerne.</li>
	<li>Forbered 50 mL 10x Stock RNase-...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

Målingen af telomerase aktivitet er afgørende for en overflod af forskningsemner, herunder, men ikke begrænset til, kræft, telomere biologi, aldring, regenerativ medicin, og struktur-baseret Drug design. Telomerase RNPs er lav rigelige, selv i kræftceller, hvilket gør påvisning og undersøgelse af dette enzym udfordrende. I dette papir, beskrev vi trin-for-trin procedurer for den nyudviklede ddTRAP analyse til robust kvantificere telomerase aktivitet i celler. Ved at kombinere den traditionelle telomerase forlæng...

Telomeres er dynamiske DNA-protein komplekser i enderne af lineære kromosomer. Human telomerer består af en række 5 '-ttagggn hexameric gentagelser, som varierer i længde mellem 12 – 15 kilo baser (KB) ved fødslen1. Humant telomerase, ribonucleoprotein enzym, der vedligeholder telomerer, blev først identificeret i Hela celle lysaterne (kræft cellelinje)2. Tilsammen spiller telomerer og telomerase en vigtig rolle i et spektrum af biologiske processer som genombeskyttelse, genregulering og kræftcellers udødelighed3,4,5,6.
Human telomerase består primært af to nøglekomponenter, nemlig telomerase reverse transkriptase og telomerase RNA (henholdsvis hTERT og hTERC). Protein-under enheden, hTERT, er den katalytisk aktive reverse transkriptase-komponent i telomeraseenzymet. RNA-skabelonen, hTERC, giver telomerase med skabelonen til at udvide og/eller vedligeholde telomeres. De fleste humane somatiske væv har ingen påviselige telomerase aktivitet. Den manglende evne af DNA-Polymerase til at forlænge slutningen af den halter streng af DNA sammen med manglen på telomerase fører til den progressive forkortelse af telomerer efter hver runde af cellulære division. Disse fænomener fører til telomere forkortelse i de fleste somatiske celler, indtil de når en kritisk forkortet længde, hvor cellerne indtaster en tilstand af replikativ senescens. Det maksimale antal gange en celle kan opdele er dikteret af sin telomere længde og denne blok til fortsat celle division menes at forhindre progression til oncogenesis7. Kræftceller er i stand til at overvinde telomere-induceret replikativ senescens og fortsætte med at formere ved at udnytte telomerase at opretholde deres telomerer. Ca 90% af kræftformer aktivere telomerase, gør telomerase aktivitet kritisk vigtigt i både kræft påvisning og behandling.
Udviklingen af TRAP-analysen i 1990 ' erne var medvirkende til at identificere de nødvendige komponenter af telomeraseenzymet samt til måling af telomerase i en lang række celler og væv, både normale og kræftrelaterede. Den oprindelige gel-baserede PCR-analyse anvendte radioaktivt mærkede DNA-substrater til at detektere telomeraseaktivitet. I 2006 blev analysen tilpasset til en ikke-radioaktiv form ved hjælp af optælling mærket substrater8,9. Ved at bruge optælling mærket substrater, brugere var i stand til at visualisere telomerase udvidelse produkter som bands på en gel ved at udsætte det til den korrekte excitation bølgelængde. Følsomheden af TRAP-analysen og dens evne til at detektere telomeraseaktivitet i rå celle lysater har gjort denne analyse den mest udbredte metode til telomerase aktivitet påvisning. TRAP-analysen har dog begrænsninger. Analysen er gel-baseret, hvilket gør det vanskeligt at udføre de nødvendige replikater i moderat til høj-gennemløb undersøgelser, og dermed korrekt statistisk analyse er sjældent opnået. Desuden er det gel-baserede assay vanskeligt at kvantificere pålideligt på grund af manglende evne til at påvise mindre end to forskelle i telomeraseaktiviteten mellem prøverne. Overvinde disse to begrænsninger er afgørende for enzymatiske aktivitet analyser såsom Trap at flytte til kliniske eller industrielle indstillinger for påvisning af telomerase aktivitet i patientprøver eller Drug Design undersøgelser.
Digital PCR blev oprindeligt udviklet i 1999 som et middel til at omdanne den eksponentielle og analoge karakter af PCR til en lineær og digital assay10. Droplet digital PCR (ddPCR) er den seneste nyskabelse i den oprindelige digitale PCR-metodologi. Droplet digital PCR kom om med fremkomsten af avancerede mikrofluidics og olie-i-vand emulsion kemi til pålideligt generere stabile og lige store dråber. I modsætning til gel-baseret og endda kvantitativ PCR (qPCR) genererer ddPCR absolut kvantificering af input materialet. Nøglen til ddPCR er dannelsen af ~ 20.000 individuelle reaktioner ved at partitionere prøver i dråber. Efter slutpunkt PCR scanner dråbe læseren hver dråbe i en flow-cytometer-lignende mode, tælle, dimensionering, og registrere tilstedeværelsen eller fravær af fluorescens i hver enkelt dråbe (dvs. fravær eller tilstedeværelse af PCR amplikoner i hver dråbe). Derefter, ved hjælp af Poisson ' s fordeling, input molekyler er anslået baseret på forholdet mellem positive dråber til det samlede antal dråber. Dette tal repræsenterer et estimat af antallet af indgangs molekyler i hver PCR. Desuden, ddPCR udføres og analyseres på en 96-brønd plade, som giver brugeren mulighed for at køre mange prøver, samt udføre biologiske og tekniske replikater til korrekt statistisk analyse. Som et resultat, vi har kombineret den kraftige kvantificering og moderat-gennemløb karakter af ddPCR med TRAP-analysen til at udvikle ddTRAP assay11. Denne analyse er designet til brugere til at studere og robust kvantificere absolutte telomerase aktivitet fra biologiske prøver11,12. DdTRAP-følsomheden gør det muligt at kvantificere telomeraseaktivitet fra begrænsede og dyrebare prøver, herunder enkelt celle målinger. Endvidere, brugere kan også studere virkningerne af telomerase manipulationer og/eller narkotika med absolut kvantificering af mindre end to ændringer (~ 50% forskelle). DdTRAP er den naturlige udvikling af TRAP-analysen i den digitale og højere gennemløb karakter af moderne laboratorie eksperimenter og kliniske indstillinger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

Telomere REPEAT-forstærknings protokollen (TRAP) er den mest udbredte analyse til påvisning af telomeraseaktivitet inden for en given prøve. Den polymerasekæde reaktion (PCR)-baserede metode giver mulighed for robuste målinger af enzymaktivitet fra de fleste celle lysater. Den gel-baserede Trap med optælling mærkede primere begrænser prøve gennemløb, og evnen til at detektere forskelle i prøver er begrænset til to gange eller større ændringer i enzymaktivitet. Den dråbe digital TRAP, ddTRAP, er en meget følsom tilgang, der er blevet modificeret fra den traditionelle TRAP-analyse, der gør det muligt for brugeren at udføre en robust analyse på 96 prøver pr. løb og opnå absolut kvantificering af DNA (telomerase forlængelse produkter ) input inden for hver PCR. Derfor overvinder den nyudviklede ddTRAP-analyse begrænsningerne ved den traditionelle gel-baserede TRAP-analyse og giver en mere effektiv, nøjagtig og kvantitativ tilgang til måling af telomeraseaktivitet inden for laboratorie-og kliniske miljøer.

Ved hjælp af ddTRAP blev telomeraseaktiviteten målt i et celle panel bestående af følgende cellelinjer (figur 1): ikke-småcellet lungecancer (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 og H2887), småcellet lungecancer (H82 og SHP77) og telomerase-negative fibroblaster (BJ). 1.000.000 celle pellets blev lyseret i np-40 buffer, og telomerase forlængelses reaktioner blev udført i biologiske triplicater. En fælles og stærkt anbefalet negativ kontrol er "NTC", no-T...

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Vi har med succes konverteret standard telomere gentagelse forstærknings protokol (TRAP) assay, der skal anvendes i dråbe digitale polymerase kædereaktioner. Denne nye analyse, kaldet ddTRAP, er mere følsom og kvantitativ, giver mulighed for bedre påvisning og statistisk analyse af telomerase aktivitet inden for forskellige humane celler.

Dråbe digital TRAP (ddTRAP): tilpasning af telomere REPEAT forstærknings protokol til droplet digital polymerase kædereaktion

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

DdTRAP-analysen giver mulighed for at opnå en følsom, robust og meget kvantitativ måling af telomerase enzymatisk aktivitet i celler. Evnen til at køre op til 96 prøver pr køre i en medium-throughput mode giver os en stor fordel. Vi kan køre kontroller og replikater for korrekt statistisk analyse af de indsamlede data.Umiddelbart før cellelysning, tø en frossen aliquot af NP-40 lysis buffer. Når optøet, skal lysis bufferen på isen. Der tilsættes PMSF proteasehæmmer til NP-40 lysis-bufferen for at nå en endelig koncentration på 0,2 millimolar.Derefter tilsættes 40 mikroliter af lysisbufferen til røret, der indeholder en cellepellet for at nå en celleækvivalens på 25.000 celler pr. mikroliter. Pipetter forsigtigt lysatet op og ned for at bryde cellerne. Prøv at undgå at lave bobler.Lad cellerne lyse på is i 30 minutter. Vortex lysatet forsigtigt hvert 10. Under cellen lysis, forberede en master mix i en mikrocentrifuge rør til telomerase forlængelse reaktion, og opbevares på is.Efter cellen lysis, pipette 48 mikroliter af forlængermester blandes i hver PCR rør. Der tilsættes to mikroliter fortyndet lysat til hvert PCR-rør for at opnå en endelig celleækvivalens på 50 celler pr. mikroliter, og fortsætte telomeraseforlængelsesreaktionen i henhold til manuskriptet. Forbered en master mix i en mikrocentrifuge rør til ddTRAP, og holde det ved stuetemperatur.Pipette 19,8 mikroliter af ddPCR master blandes i hvert PCR-rør. Der tilsættes 2,2 mikroliter af den tidligere forlængelsesreaktionsopløsning på hvert rør, hvilket efterlader et samlet volumen på 22 mikroliter. For at opsætte dråbegenereringspatronen skal der første indlæsesede 20 mikroliter af den forberedte opløsning i den midterste prøvebeholder i patronen.Bank forsigtigt på siden af patronen for at flytte eventuelle bobler til toppen af opløsningen. Alle patronens brønde skal være læsset med prøve, før der lægges olie. Derefter belastning 70 mikroliter af dråbe generation olie i venstre olie godt.Fastgør pakningen på plads ved at binde den fast til enderne af patronen, og sæt den indlæste og monterede patron i dråbegeneratoren. Generatoren viser et solidt grønt lys for at informere patronen er placeret korrekt. Efter 60 til 90 sekunder, når generatorlyset holder op med at blinke, er cyklussen færdig.Fjern nu patronen. Fjern forsigtigt pakningen fra patronen. Brug en multikanalpipette til at pipette ca. 40 mikroliter af de nygenererede dråber fra højre brønd til en 96-brønd PCR-plade.Varme forsegle pladen med aluminiumsfolie PCR plade sæler, når alle prøverne er indlæst i 96-brøndpladen for at forhindre fordampning. Derefter skal du indlæse 96-brøndpladen i en termocyr for at udføre PCR-reaktionen. Til at begynde, skal du lægge 96-brøndpladen i dråbelæseren.Vend pladen korrekt, så A1-prøven svarer til holderens. Åbn den software, der er knyttet til slipværktøjslæseren. Dobbeltklik på den første brønd, A01, for at åbne prøven godt editor skærmen.Klik på Eksperimentér, og vælg den type analyse, der skal bruges, i rullemenuen. Vælg QX200 ddPCR EvaGreen Supermix som den korrekte detektionsmetode. Klik på Anvend i nederste højre side af godt editor skærmen for at gemme de brugerdefinerede indstillinger til alle de fremhævede brønde.Klik derefter på Mål på skærmbilledet godt redigering, og klik på rullemenuen Mål for at vælge enten ukendt kontrolelement, referencekontrol eller ingen skabelon for at definere eksempeltypen. Marker alle eksemplerne i sektionen Eksempelnavn, og klik på Anvend. Klik på Kør for at læse pladen.Vælg enten Kolonner eller Rækker på skærmbilledet Kørselsindstillinger, når du bliver bedt om at informere om den retning, pladen skal læses i. Bestem antallet af accepterede dråber for hvert eksempel ved at dobbeltklikke på de enkelte brønde eller kolonne- og rækkeoverskrifter for at give en tabel med oplysninger. For ddTRAP er prøver med 10.000 eller flere accepterede dråber gyldige til yderligere analyse.Fremhæv de brønde, der repræsenterer eksempelrelikts og NTC-prøver. Angiv værdien for eksemplerne manuelt ved at klikke på ikonet for at angive tærskler nederst til venstre på skærmen. I denne protokol blev telomeraseaktiviteten målt i et cellepanel bestående af ni cellelinjer af lungekræft og telomerase-negative fibroblaster.En tærskel blev sat til omkring 2.000 fluorescens amplitude for alle tre biologiske replikater for SHP77, H2887 og NTC. Positive dråber havde en fluorescens intensitet omkring 6, 000 fluorescens amplitude, som dannede en klar befolkning i toppen, og adskilt fra negative dråber omkring 1, 100 fluorescens amplitude. De samlede telomeraseforlængelsesprodukter pr. celleækvivalent mellem alle prøverne blev anslået ud fra den målte koncentration af nukleinsyrerne, hvilket repræsenterer telomeraseaktiviteten i lungekræftlinjer.Enhver RNase forurening under lysis eller udvidelse reaktion trin vil ødelægge telomerase enzymatisk aktivitet, da det er en ribonucleoprotein kompleks. ddTRAP kan følges op med ddPCR på hTERT mRNA-ekspressionsniveauer i cellen. De to datasæt giver os mulighed for at korrelere ekspressionen af hTERT med telomeraseaktivitet og grave dybere ned i potentielle telomeraseregulerende mekanismer såsom alternativ splejsning.Vi kan undersøge manipulationer til specifikke splejsning faktorer og deres virkninger på telomerase aktivitet. I øjeblikket er vi designe oligonucleotid splejsning modulatorer som potentielle lægemidler rettet mod telomerase aktivitet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Modificeret Terminal Restriktion Fragment Analyse til kvantificering af telomer længde ved brug af in-gel hybridisering

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Counting proteiner i enkelt celler med adresserbare Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Påvisning af en CDH1 sjældne udskrift Variant i frisk frosset gastrisk kræft væv af Chip-baserede digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analyse af immun farvning af ZW10 interagerende protein i humant lunge væv

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Vigtige endepunkter og proliferative markører til at vurdere små tarmskader og tilpasning ved hjælp af en muse model af kemoterapi-induceret mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Onkogen Genfusions detektering ved hjælp af forankret multiplex Polymerasekæde reaktion efterfulgt af næste generations sekvensering

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digital rumlig profilering til karakterisering af mikromiljøet i voksentype diffust infiltrerende gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...