Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

De auteurs zouden de financieringsbronnen van de nationale instituten van gezondheid (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1) willen erkennen. Kleine cel longkanker lijnen (SHP77 en H82) waren een royale geschenk van Drs. John Minna en ADI Gazdar van de UT Southwestern Medical Center.

1. buffer voorbereiding en opslag
<ol><li>Bereid 50 mL 1x voorraad-ASE-/DNase-free NP-40 lysis buffer (10 mM tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA), 1% [vol/vol] NP-40, 10% [vol/vol] glycerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoethanol, en 0,1 mm 4- benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF)). Deze buffer kan worden gepaard en opgeslagen bij-20 °C voor toekomstig gebruik. Vermijd Vries/ontdooicycli om een optimale Lysis van cellen te verkrijgen.</li>
	<li>Bereid 50 mL 10x v...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

De meting van telomerase activiteit is essentieel voor een overvloed van onderzoek onderwerpen met inbegrip van, maar niet beperkt tot, kanker, Telomere biologie, het verouderen, regeneratieve geneeskunde, en structuur-gebaseerd drug ontwerp. Telomerase RNPs zijn laag overvloedig, zelfs in kankercellen, het maken van de opsporing en studie van dit enzym uitdagend. In deze paper, beschreven we de stap-voor-stap procedures voor de nieuw ontwikkelde ddTRAP assay om robuust te kwantificeren telomerase activiteit in de cellen...

Telomeren zijn dynamische DNA-eiwitcomplexen aan de uiteinden van lineaire chromosomen. Menselijke telomeren zijn samengesteld uit een array van 5 '-TTAGGGn hexameren herhalingen die variëren in lengte tussen 12-15 kilobases (KB) bij de geboorte1. Human telomerase, de ribonucleoproteã enzym dat de telomeren handhaaft, werd voor het eerst geïdentificeerd in HeLa cel lysaten (kanker Cell line)2. Samen spelen telomeren en telomerase een belangrijke rol in een spectrum van biologische processen zoals de bescherming van het genoom, gen regulatie, en kanker cel onsterfelijkheid3,4,5,6.
Menselijke telomerase bestaat hoofdzakelijk uit twee belangrijke componenten, namelijk telomerase reverse transcriptase en telomerase RNA (respectievelijk hTERT en hTERC). De eiwit subeenheid, hTERT, is de katalytisch actieve omgekeerde transcriptase component van het telomerase enzym. De RNA template, hTERC, biedt telomerase met de sjabloon uit te breiden en/of te handhaven telomeren. De meeste menselijke somatische weefsels hebben geen detecteerbare telomerase activiteit. Het onvermogen van de polymerase van DNA om het eind van de achtergebleven bundel van DNA samen met het gebrek aan telomerase te verlengen leidt tot het progressieve verkorten van telomeren na elke ronde van cellulaire afdeling. Deze fenomenen leiden tot Telomere verkorting in de meeste somatische cellen tot zij een kritisch verkorte lengte bereiken, waardoor de cellen een staat van replicerende senescentie ingaan. Het maximale aantal keren dat een cel kan verdelen wordt gedicteerd door zijn Telomere lengte en dit blok aan voortdurende celdeling wordt gedacht om progressie te voorkomen tot oncogenese7. Kankercellen zijn in staat om Telomere-geïnduceerde replicerende senescentie te overwinnen en te blijven vermenigvuldigen door gebruik te maken van telomerase om hun telomeren te handhaven. Ongeveer 90% van de kankers te activeren telomerase, waardoor telomerase activiteit kritisch belangrijk in zowel de opsporing van kanker en behandeling.
De ontwikkeling van de val assay in de jaren 1990 was instrumenteel in de identificatie van de noodzakelijke componenten van het telomerase enzym, evenals voor de meting van telomerase in een breed scala van cellen en weefsels, zowel normaal als kanker. De originele op gel-gebaseerde PCR assay gebruikte radioactief geëtiketteerde de substraten van DNA om telomerase activiteit te ontdekken. In 2006, werd de analyse aangepast in een niet-radioactieve vorm gebruikend fluorescerend geëtiketteerde substraten8,9. Door het gebruik van fluorescerende geëtiketteerde substraten, gebruikers in staat waren om de telomerase uitbreiding producten te visualiseren als bands op een gel door het blootstellen aan de juiste excitatie golflengte. De gevoeligheid van de val assay en de mogelijkheid om telomerase activiteit op te sporen in ruwe cel lysaten heeft deze assay de meest gebruikte methode voor telomerase activiteit detectie. Echter, de val assay heeft beperkingen. De assay is gel-based, waardoor het moeilijk is om de nodige replica's uit te voeren in matige tot high-throughput studies, en dus een goede statistische analyse is zelden bereikt. Bovendien is de gel-based assay moeilijk te kwantificeren betrouwbaar te wijten aan het onvermogen van het opsporen van minder dan tweeledige verschillen in telomerase activiteit tussen de monsters. Het overwinnen van deze twee beperkingen is van cruciaal belang voor enzymatische activiteit assays zoals de val te verhuizen naar klinische of industrie-instellingen voor de opsporing van telomerase activiteit in de patiënt monsters of drug design studies.
Digitale PCR werd aanvankelijk ontwikkeld in 1999 als middel om de exponentiële en analoge aard van PCR in een lineaire en digitale analyse10om te zetten. De digitale PCR van het druppeltje (ddPCR) is de recentste innovatie van de originele digitale PCR methodologie. De digitale PCR van het druppeltje kwam over met de komst van geavanceerde microfluidics en olie-in-water emulsie chemie om stabiele en even grote druppeltjes betrouwbaar te produceren. In tegenstelling tot gel-based en zelfs kwantitatieve PCR (qPCR), ddPCR genereert absolute kwantificering van het input materiaal. De sleutel tot ddPCR is de generatie van ~ 20.000 individuele reacties door het verdelen van steekproeven in druppeltjes. Na eind-punt PCR, scant de druppel lezer elke druppel in een cytometer-als manier, het tellen, het rangschikken, en registrerend de aanwezigheid of de afwezigheid van fluorescentie in elke individuele druppel (d.w.z., afwezigheid of aanwezigheid van PCR amplicons in elke druppel). Dan, met behulp van Poisson de distributie, input moleculen worden geschat op basis van de verhouding van de positieve druppels op het totale aantal druppels. Dit aantal vertegenwoordigt een raming van het aantal input molecules in elke PCR. Bovendien wordt ddPCR uitgevoerd en geanalyseerd op een 96-well plaat die het mogelijk maakt de gebruiker om vele monsters te draaien, evenals het uitvoeren van biologische en technische repliceert voor een goede statistische analyse. Als gevolg daarvan hebben we gecombineerd de krachtige kwantificering en matige doorvoersnelheid aard van ddPCR met de val assay om de ddTRAP assay11te ontwikkelen. Deze analyse is ontworpen voor gebruikers om te studeren en robuust te kwantificeren absolute telomerase activiteit van biologische monsters11,12. De gevoeligheid van de ddTRAP maakt het mogelijk de kwantificering van telomerase activiteit van beperkte en kostbare monsters, met inbegrip van single-cell metingen. Voorts kunnen de gebruikers de gevolgen van telomerase manipulaties en/of drugs met absolute kwantificatie van minder dan dubbele veranderingen (~ 50% verschillen) ook bestuderen. De ddTRAP is de natuurlijke evolutie van de val assay in de digitale en hogere doorvoersnelheid aard van de moderne laboratoriumexperimenten en klinische instellingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

De Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) is de meest gebruikte assay om telomerase activiteit te detecteren binnen een gegeven een monster. De polymerase kettingreactie (PCR)-gebaseerde methode staat voor robuuste metingen van enzymactiviteit van de meeste cel lysaten toe. De op gel-gebaseerde val met fluorescently geëtiketteerde inleidingen beperkt steekproef productie, en de capaciteit om verschillen in steekproeven te ontdekken is beperkt tot twee vouwen of grotere veranderingen in enzymactiviteit. De druppel digitale val, ddTRAP, is een zeer gevoelige benadering die is gewijzigd van de traditionele val Assay, waardoor de gebruiker een robuuste analyse uit te voeren op 96 monsters per run en het verkrijgen van absolute kwantificering van het DNA (telomerase extension producten ) input binnen elke PCR. Daarom is de nieuw ontwikkelde ddTRAP assay overwint de beperkingen van de traditionele gel-based TRAP assay en biedt een meer efficiënte, accurate en kwantitatieve benadering van het meten van telomerase activiteit binnen laboratorium en klinische instellingen.

Met behulp van de ddTRAP, telomerase activiteit werd gemeten in een cel paneel bestaande uit de volgende cel lijnen (Figuur 1): niet-kleine cel longkanker (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, en H2887), kleine cel longkanker (H82 en SHP77), en telomerase-negatieve fibroblasten (BJ). 1.000.000 Cell pellets werden lysed in de NP-40 buffer, en telomerase uitbreiding reacties werden uitgevoerd in biologische Triplo. Een gemeenschappelijke en sterk aanbevolen negatie...

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We hebben met succes omgezet de standaard Telomere REPEAT versterking Protocol (TRAP) assay te worden gebruikt in druppel digitale polymerase chain reacties. Deze nieuwe Assay, genaamd ddTRAP, is gevoeliger en kwantitatieve, waardoor een betere opsporing en statistische analyse van telomerase activiteit binnen verschillende menselijke cellen.

Druppel digitale val (ddTRAP): aanpassing van de Telomere Herhaal versterking protocol aan druppel digitale polymerase kettingreactie

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

De ddTRAP-test biedt de mogelijkheid om een gevoelige, robuuste en zeer kwantitatieve meting van telomerase enzymatische activiteit in cellen te verkrijgen. De mogelijkheid om tot 96 samples per run te lopen in een medium-throughput mode biedt ons een groot voordeel. We kunnen de besturingselementen en repliceren uitvoeren voor een goede statistische analyse van de verzamelde gegevens.Ontdooi onmiddellijk voor de cellysing een bevroren aliquot np-40 lysis buffer. Eenmaal ontdooid, plaats de lysis buffer op ijs. Voeg PMSF proteaseremmer toe aan de NP-40 lysis buffer om een uiteindelijke concentratie van 0,2 millimolar te bereiken.Voeg vervolgens 40 microliter van de lysebuffer toe aan de buis met een celpellet om een celequivalentie van 25.000 cellen per microliter te bereiken. Voorzichtig pipette het lysate op en neer om de cellen open te breken. Probeer te voorkomen dat het maken van bubbels.Laat de cellen 30 minuten op ijs lyse. Voorzichtig vortex de lysate om de 10 minuten om te voorkomen dat clusters van celpuin vormen. Bereid tijdens de cellyse een mastermix in een microcentrifugebuis voor de telomerase extensiereactie en bewaar op ijs.Na de cellyse, pipet 48 microliters van extensie master mix in elke PCR buis. Voeg twee microliter verdund lysaat toe aan elke PCR-buis om een uiteindelijke celequivalentie van 50 cellen per microliter te bereiken en zet de telomerase extensiereactie volgens het manuscript voort. Bereid een master mix in een microcentrifuge buis voor de ddTRAP, en houd het op kamertemperatuur.Pipette 19.8 microliters van ddPCR master mix in elke PCR buis. Voeg 2,2 microliter van de vorige uitbreidingsreactieoplossing toe aan elke buis, waardoor er een totaal volume van 22 microliters overblijft. Om de druppelgeneratiecartridge in te stellen, laadt u eerst 20 microliter van de voorbereide oplossing in het middelste monster goed in de cartridge.Tik voorzichtig op de zijkant van de cartridge om eventuele bellen naar de bovenkant van de oplossing te verplaatsen. Alle putten van de cartridge moeten worden geladen met monster voorafgaand aan het laden van olie. Dan, laad 70 microliter van druppelgeneratie olie in de linker olie put.Zet de pakking op zijn plaats door het aan de uiteinden van de cartridge tetheren en plaats de geladen en gemonteerde cartridge in de druppelgenerator. De generator toont een stevig groen licht om te informeren dat de cartridge goed is geplaatst. Na 60 tot 90 seconden, wanneer het generatorlampje stopt met knipperen, is de cyclus voltooid.Verwijder nu de cartridge. Haal de pakking voorzichtig uit de cartridge. Gebruik een multichannel pipet om ongeveer 40 microliters van de nieuw gegenereerde druppels van rechts goed in een 96-well PCR-plaat te pipetteen.Verwarm de plaat met aluminiumfolie PCR-plaatafdichtingen zodra alle monsters in de 96-putplaat zijn geladen om verdamping te voorkomen. Laad vervolgens de 96-put plaat in een thermocycler om de PCR-reactie uit te voeren. Om te beginnen laadt u de 96-putplaat in de druppellezer.Oriënteer de plaat goed zodat het A1 monster overeenkomt met dat van de houder. Open de software die is gekoppeld aan de druppellezer. Dubbelklik op de eerste put, A01, om het voorbeeld goed editor scherm te openen.Klik op Experimenteren en selecteer het type test dat moet worden gebruikt in het vervolgkeuzemenu. Selecteer QX200 ddPCR EvaGreen Supermix als de juiste detectiemethode. Klik rechtsonder op Toepassen in het scherm van de goededitor om de door de gebruiker gedefinieerde instellingen op te slaan in alle gemarkeerde putten.Klik vervolgens op Doel in het scherm goededing en klik op de vervolgkeuzelijst Doel om onbekend, referentie- of no-templatebesturingselement te selecteren om het type voorbeeld te definiëren. Label in de sectie Voorbeeldnaam alle voorbeelden en klik op Toepassen. Klik op Uitvoeren om de plaat te lezen.Selecteer kolommen of rijen in het scherm Uitvoeropties wanneer u wordt gevraagd te informeren over de afdrukstand waarin de plaat moet worden ingelezen. Bepaal het aantal geaccepteerde druppels voor elk voorbeeld door dubbel te klikken op de afzonderlijke putten of kolom- en rijkoppen om een tabel met informatie te verstrekken. Voor de ddTRAP zijn monsters met 10.000 of meer geaccepteerde druppels geldig voor verdere analyse.Markeer de putten die voorbeeldrepliceert en NTC-monsters vertegenwoordigen. Stel handmatig de drempel voor de voorbeelden in door op het pictogram te klikken voor het instellen van drempels linksonder in het scherm. In dit protocol werd telomerase activiteit gemeten in een celpaneel bestaande uit negen cellijnen van longkanker en telomerase-negatieve fibroblasten.Een drempel werd vastgesteld op ongeveer 2.000 fluorescentie amplitude voor alle drie de biologische replica's voor SHP77, H2887, en NTC. Positieve druppels hadden een fluorescentie intensiteit rond 6,000 fluorescentie amplitude, die een duidelijke populatie aan de top gevormd, en gescheiden van negatieve druppels rond 1, 100 fluorescentie amplitude. De totale telomerase extensie producten per cel equivalent tussen alle monsters werden geschat op basis van de gemeten concentratie van de nucleïnezuren, die de telomerase activiteit in longkanker lijnen vertegenwoordigt.Elke RNase besmetting tijdens de lyse- of uitbreidingsreactiestappen zal de telomerase enzymatische activiteit vernietigen omdat het een ribonucleoproteïnecomplex is. ddTRAP kan worden opgevolgd met ddPCR op hTERT mRNA expressieniveaus in de cel. De twee datasets stellen ons in staat om expressie van hTERT te correleren met telomerase activiteit en dieper in te graven in potentiële telomerase regulerende mechanismen zoals alternatieve splicing.We kunnen manipulaties onderzoeken naar specifieke splicing factoren en hun effecten op telomerase activiteit. Momenteel ontwerpen we oligonucleotide splicing modulators als potentiële geneesmiddelen gericht op telomerase activiteit.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Aangepaste Terminal Restriction Fragment Analyse voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van in-gel hybridisatie

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digitale analyse van immunokleuring van ZW10 interactie eiwit in menselijke Long weefsels

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Belangrijke eindpunten en proliferatieve markers om kleine darm letsel en aanpassing te beoordelen met behulp van een muis model van chemotherapie-geïnduceerde Mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Oncogene Genfusie detectie met behulp van verankerde multiplex polymerase kettingreactie gevolgd door sequenties van de volgende generatie

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...