Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Les auteurs aimeraient reconnaître les sources de financement des instituts nationaux de santé (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Les lignées de cancer du poumon à petites cellules (SHP77 et H82) étaient un don généreux des Drs John Minna et ADI Gazdar du centre médical du sud-ouest de l’UT.

1. préparation et stockage des tampons
<ol><li>Préparer 50 mL de tampon de lyse NP-40 sans RNase-/DNase-free (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm d’acide éthylenediaminetétraacétique (EDTA), 1% [vol/vol] NP-40, 10% [vol/vol] glycérol, 150 mm de NaCl, 5 mm de β-mercaptoéthanol et 0,1 mm 4- chlorhydrate de fluorure de benzenesulfonyle (AEBSF)). Cette mémoire tampon peut être aliquotée et stockée à-20 ° c pour une utilisation ultérieure. Évitez les cycles de gel/dégel afin d’obtenir u...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

La mesure de l’activité télomérase est essentielle à une pléthore de sujets de recherche, y compris, mais sans s’y limiter, le cancer, la biologie télomère, le vieillissement, la médecine régénérative, et la conception de médicaments à base de structure. Les RNPs de télomérase sont faibles abondants, même dans les cellules cancéreuses, rendant la détection et l’étude de cette enzyme provocante. Dans cet article, nous avons décrit les procédures étape par étape pour le nouveau dosage ddTRAP af...

Les télomères sont des complexes d’ADN-protéine dynamique aux extrémités des chromosomes linéaires. Les télomères humains sont composés d’un tableau de répétitions de 5 '-TTAGGGn hexamériques qui varient en longueur entre 12 – 15 kilobases (KB) à la naissance1. La télomérase humaine, l’enzyme ribonucléoprotéique qui maintient les télomères, a été identifiée pour la première fois dans les lysats cellulaires de HeLa (lignée de cellules cancéreuses)2. Ensemble, télomères et télomérase jouent un rôle majeur dans un spectre de processus biologiques tels que la protection du génome, la régulation génique et l’immortalité des cellules cancéreuses3,4,5,6.
La télomérase humaine se compose principalement de deux composants clés, à savoir la transcriptase inverse télomérase et l’ARN télomérase (hTERT et hTERC, respectivement). La sous-unité protéique, hTERT, est la composante catalytiquement active de la transcriptase inverse de l’enzyme télomérase. Le modèle d’ARN, hTERC, fournit la télomérase avec le modèle pour étendre et/ou entretenir des télomères. La plupart des tissus somatiques humains n’ont pas d’activité de télomérase détectable. L’incapacité de l’ADN polymérase à prolonger la fin du brin d’ADN en retard avec l’absence de télomérases conduit au raccourcissement progressif des télomères après chaque tour de division cellulaire. Ces phénomènes conduisent au raccourcissement du télomère dans la plupart des cellules somatiques jusqu’à ce qu’ils atteignent une longueur critique raccourcie, par laquelle les cellules entrent dans un état de sénescence réplicative. Le nombre maximal de fois qu’une cellule peut se diviser est dicté par sa longueur de télomère et ce bloc à la division cellulaire continue est pensé pour empêcher la progression à l’oncogenèse7. Les cellules cancéreuses sont capables de surmonter la sénescence réplicative induite par le télomère et continuent de prolirer en utilisant la télomérase pour maintenir leurs télomères. Environ 90% des cancers activent la télomérase, rendant l’activité de la télomérase extrêmement importante dans la détection et le traitement du cancer.
Le développement de l’essai TRAP dans les années 1990 a joué un rôle déterminant dans l’identification des composants nécessaires de l’enzyme télomérase, ainsi que dans la mesure de la télomérase dans un large éventail de cellules et de tissus, normaux et cancéreux. Le dosage d’origine par PCR à base de gel utilisait des substrats d’ADN étiquetés radioactivement pour détecter l’activité de la télomérase. En 2006, le dosage a été adapté dans une forme non radioactive à l’aide de substrats marqués fluorescemment8,9. En utilisant des substrats marqués fluorescemment, les utilisateurs ont pu visualiser les produits d’extension de télomérase sous forme de bandes sur un gel en l’exposant à la longueur d’onde d’excitation correcte. La sensibilité du test TRAP et sa capacité à détecter l’activité de la télomérase dans les lysats cellulaires bruts ont fait de ce test la méthode la plus couramment utilisée pour la détection d’activité de télomérase. Cependant, le test TRAP a des limitations. Le dosage est à base de gel, ce qui rend difficile l’exécution des répétitions nécessaires dans des études de rendement modéré à élevé, et donc, une analyse statistique appropriée est rarement obtenue. En outre, le dosage à base de gel est difficile à quantifier de façon fiable en raison de l’incapacité de détecter moins de deux différences dans l’activité de la télomérase entre les échantillons. Surmonter ces deux limitations est essentiel pour les essais d’activité enzymatique tels que le piège pour passer à des paramètres cliniques ou de l’industrie pour la détection de l’activité télomérase dans des échantillons de patients ou des études de conception de médicaments.
La PCR numérique a été initialement développée en 1999 comme un moyen de convertir la nature exponentielle et analogique de la PCR en un test linéaire et numérique10. La PCR numérique par gouttelettes (ddPCR) est l’innovation la plus récente de la méthodologie de PCR numérique originale. La PCR numérique par gouttelettes est venue avec l’avènement des microfluidique avancés et de la chimie de l’émulsion d’huile dans l’eau pour générer de façon fiable des gouttelettes stables et de taille égale. Contrairement à la PCR à base de gel et même quantitative (qPCR), ddPCR génère une quantification absolue du matériau d’entrée. La clé de ddPCR est la génération de ~ 20 000 réactions individuelles en divisant les échantillons en gouttelettes. Après la PCR de point final, le lecteur de gouttelettes analyse chaque gouttelette dans un flux-cytomètre-comme la mode, le comptage, le dimensionnement, et l’enregistrement de la présence ou l’absence de fluorescence dans chaque gouttelette individuelle (c.-à-d., l’absence ou la présence d’amplicons PCR dans chaque gouttelette). Ensuite, en utilisant la distribution de poisson, les molécules d’entrée sont estimées en fonction du rapport entre les gouttelettes positives et le nombre total de gouttelettes. Ce nombre représente une estimation du nombre de molécules d’entrée dans chaque PCR. En outre, le ddPCR est exécuté et analysé sur une plaque de 96-Well qui permet à l’utilisateur d’exécuter de nombreux échantillons, ainsi que d’effectuer des répliques biologiques et techniques pour une analyse statistique appropriée. En conséquence, nous avons combiné la puissante quantification et la nature à débit modéré de ddPCR avec le test TRAP pour développer le dosage ddTRAP11. Ce dosage est conçu pour que les utilisateurs étudient et quantifient vigoureusement l’activité de télomérase absolue à partir d’échantillons biologiques11,12. La sensibilité du ddTRAP permet la quantification de l’activité télomérase à partir d’échantillons limités et précieux, y compris des mesures à une seule cellule. En outre, les utilisateurs peuvent également étudier les effets des manipulations de télomérase et/ou des médicaments avec une quantification absolue de moins de deux changements (~ 50% différences). Le ddTRAP est l’évolution naturelle du test TRAP dans la nature numérique et à plus haut débit des expériences de laboratoire modernes et des paramètres cliniques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

Le protocole de répétition d’amplification de télomère (TRAP) est le dosage le plus couramment utilisé pour détecter l’activité de télomérase dans un échantillon donné. La méthode de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) permet des mesures robustes de l’activité enzymatique de la plupart des lysats cellulaires. Le piège à base de gel avec des amorces fluorescemment étiquetés limite le débit de l’échantillon, et la capacité de détecter les différences dans les échantillons est limitée à deux fois ou plus de changements dans l’activité enzymatique. La gouttelette Digital TRAP, ddTRAP, est une approche très sensible qui a été modifiée à partir du test TRAP traditionnel, permettant à l’utilisateur d’effectuer une analyse robuste sur 96 échantillons par Run et d’obtenir une quantification absolue de l’ADN (produits d’extension télomérase ) entrée dans chaque PCR. Par conséquent, le test ddTRAP nouvellement développé surpasse les limites du dosage traditionnel à base de gel et fournit une approche plus efficace, précise et quantitative pour mesurer l’activité de la télomérase dans les milieux de laboratoire et cliniques.

À l’aide du ddTRAP, l’activité télomérase a été mesurée dans un panneau cellulaire composé des lignées cellulaires suivantes (figure 1): cancer du poumon à cellules non petites (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 et H2887), cancer du poumon à petites cellules (H82 et SHP77), et télomérase-négatif fibroblastes (BJ). 1 million les granules cellulaires ont été lysés dans le tampon NP-40, et des réactions d’extension de télomérase ont été...

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Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Nous avons réussi à convertir le test de protocole d’amplification de télomère standard (TRAP) pour être utilisé dans les réactions en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes. Ce nouveau dosage, appelé ddTRAP, est plus sensible et quantitatif, ce qui permet une meilleure détection et analyse statistique de l’activité de la télomérase dans diverses cellules humaines.

PIÈGE numérique de gouttelettes (ddTRAP): adaptation du protocole de répétition d’amplification de télomère à la réaction en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

L’analyse ddTRAP permet d’obtenir une mesure sensible, robuste et hautement quantitative de l’activité enzymatique de la télomérase dans les cellules. La possibilité d’exécuter jusqu’à 96 échantillons par course d’une manière à débit moyen nous offre un grand avantage. Nous pouvons exécuter les contrôles et les répliques pour une analyse statistique appropriée sur les données recueillies.Immédiatement avant le lysage cellulaire, décongeler un aliquot congelé de tampon de lyse NP-40. Une fois décongelé, placez le tampon de lyse sur la glace. Ajouter l’inhibiteur de la protéase PMSF au tampon de lyse NP-40 pour atteindre une concentration finale de 0,2 millimolaire.Ensuite, ajoutez 40 microlitres du tampon de lyse au tube contenant une pastille cellulaire pour atteindre une équivalence cellulaire de 25 000 cellules par microlitre. Pipette doucement le lysate de haut en bas afin de briser les cellules. Essayez d’éviter de faire des bulles.Laisser les cellules se lyser sur la glace pendant 30 minutes. Vortex doucement le lysate toutes les 10 minutes pour empêcher les grappes de débris cellulaires de se former. Pendant la lyse cellulaire, préparer un mélange principal dans un tube de microcentrifugeuse pour la réaction d’extension de la télomérase, et conserver sur la glace.Après la lyse cellulaire, pipette 48 microlitres de maître d’extension se mélangent dans chaque tube PCR. Ajouter deux microlitres de lysate dilué à chaque tube PCR pour atteindre une équivalence cellulaire finale de 50 cellules par microlitre, et continuer la réaction d’extension de télomérase selon le manuscrit. Préparer un mélange maître dans un tube de microcentrifugeuse pour le ddTRAP, et le garder à température ambiante.Pipette 19,8 microlitres de mélange principal ddPCR dans chaque tube PCR. Ajouter 2,2 microlitres de la solution de réaction d’extension précédente à chaque tube, laissant un volume total de 22 microlitres. Pour installer la cartouche de génération de gouttelettes, chargez d’abord 20 microlitres de la solution préparée dans l’échantillon moyen bien dans la cartouche.Appuyez doucement sur le côté de la cartouche pour déplacer les bulles vers le haut de la solution. Tous les puits de la cartouche doivent être chargés d’échantillon avant de charger l’huile. Ensuite, chargez 70 microlitres d’huile de production de gouttelettes dans le puits de pétrole gauche.Fixez le joint en place en l’attacheant aux extrémités de la cartouche et placez la cartouche chargée et assemblée dans le générateur de gouttelettes. Le générateur affiche une lumière verte solide pour informer que la cartouche est placée correctement. Après 60 à 90 secondes, lorsque la lumière du générateur cesse de clignoter, le cycle est terminé.Maintenant, retirez la cartouche. Retirer délicatement le joint de la cartouche. Utilisez une pipette multicanal pour pipette environ 40 microlitres des gouttelettes nouvellement générées à partir du puits droit dans une plaque PCR de 96 puits.Sceller la plaque avec des joints de plaque PCR en papier d’aluminium une fois que tous les échantillons sont chargés dans la plaque de 96 puits pour éviter l’évaporation. Ensuite, chargez la plaque de 96 puits dans un thermocycleur pour effectuer la réaction PCR. Pour commencer, chargez la plaque de 96 puits dans le lecteur de gouttelettes.Orientez correctement la plaque de sorte que l’échantillon A1 corresponde à celui du support. Ouvrez le logiciel associé au lecteur de gouttelettes. Double-cliquez sur le premier puits, A01, pour ouvrir l’écran de l’éditeur bien échantillon.Cliquez sur Expérimenter et sélectionnez le type d’analyse à utiliser dans le menu drop-down. Sélectionnez QX200 ddPCR EvaGreen Supermix comme méthode de détection correcte. Cliquez sur Appliquer dans le côté inférieur droit de l’écran de l’éditeur de puits pour enregistrer les paramètres définis par l’utilisateur sur tous les puits mis en surbrillance.Ensuite, cliquez sur Cible dans l’écran de l’éditeur de puits et cliquez sur le menu drop-down de Target pour sélectionner le contrôle inconnu, de référence ou sans modèle pour définir le type d’échantillon. Dans la section Nom de l’échantillon, étiquetez tous les échantillons et cliquez sur Appliquer. Cliquez sur Exécuter pour lire la plaque.Sélectionnez colonnes ou lignes dans l’écran Des options d’exécuter lorsqu’elles sont invitées à informer de l’orientation dans qui la plaque doit être lue. Déterminez le nombre de gouttelettes acceptées pour chaque échantillon en cliquant en double sur les puits individuels ou les en-têtes de colonne et de rangée pour fournir un tableau d’information. Pour le ddTRAP, les échantillons de 10 000 gouttelettes acceptées ou plus sont valides pour une analyse plus approfondie.Mettre en évidence les puits représentant des répliques d’échantillons et des échantillons de CNT. Définissez manuellement le seuil pour les échantillons en cliquant sur l’icône pour définir des seuils en bas à gauche de l’écran. Dans ce protocole, l’activité de telomerase a été mesurée dans un panneau cellulaire se composant de neuf lignes cellulaires du cancer de poumon et des fibroblastes telomerase-négatifs.Un seuil a été fixé à environ 2000 amplitudes de fluorescence pour les trois répliques biologiques pour le SHP77, le H2887 et le CNT. Les gouttelettes positives avaient une intensité de fluorescence autour de 6000 amplitude de fluorescence, qui formait une population claire au sommet, et se séparaient des gouttelettes négatives autour de 1100 amplitude de fluorescence. Les produits totaux d’extension de télomérase par équivalent cellulaire entre tous les échantillons ont été estimés à partir de la concentration mesurée des acides nucléiques, qui représente l’activité de télomérase dans les lignées de cancer du poumon.Toute contamination par la RNase pendant les étapes de la lyse ou de la réaction d’extension détruira l’activité enzymatique de la télomérase puisqu’il s’agit d’un complexe de ribonucléoprotéines. ddTRAP peut être suivi avec ddPCR sur les niveaux d’expression de l’ARNm hTERT dans la cellule. Les deux ensembles de données nous permettent de corréler l’expression du hTERT avec l’activité de la télomérase et de creuser plus profondément dans les mécanismes de régulation potentiels de la télomérase tels que l’épissage alternatif.Nous pouvons explorer les manipulations à des facteurs d’épissage spécifiques et leurs effets sur l’activité de la télomérase. Actuellement, nous concevons des modulateurs d’épissage d’oligonucléotide comme médicaments potentiels ciblant l’activité de télomérase.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l&#39;aide de l&#39;hybridation en gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Détection d’une variante de transcription Rare CDH1 dans les tissus frais congelés de Cancer gastrique par puce numérique PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Analyse numérique de l'immunostaining de ZW10 Interagir les protéines dans les tissus pulmonaires humains

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Points de terminaison et marqueurs proliférants importants pour évaluer les petites blessures intestinales et l'adaptation à l'aide d'un modèle de souris de mucosite induite par la chimiothérapie

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Détection de fusion génique oncogène utilisant la réaction ancrée de chaîne de polymérase de multiplex suivie du séquençage de prochaine génération

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Profilage spatial numérique pour la caractérisation du microenvironnement dans le gliome à infiltration diffuse de type adulte

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...