Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Die Autoren möchten Förderquellen der National Institutes of Health (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1) anerkennen. Kleine Lungenkrebslinien (SHP77 und H82) waren ein großzügiges Geschenk von Dr. John Minna und Adi Gazdar vom UT Southwestern Medical Center.

1. Puffervorbereitung und-lagerung
<ol><li>Bereiten Sie 50 mL von 1x vorrätig RNase-/DNase-freien NP-40-Lysepuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM MgCl 2, 1 mM Ethylenediaminetetraacetikinsäure (EDTA), 1% [vol/vol] NP-40,10% Glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, und 0,1 mM 4- Benzesulfonyl Fluorid Hydrochlorid (AEBSF)). Dieser Puffer kann für die zukünftige Nutzung bei-20 ° C alitiert und gespeichert werden. Vermeiden Sie Gefrierpunkte, um eine optimale Lyse der Zellen zu erhalten.</li>
	<li>Be...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

Die Messung der Telomeraseaktivität ist für eine Vielzahl von Forschungsthemen von entscheidender Bedeutung, darunter Krebs, Telomerbiologie, Alterung, regenerative Medizin und strukturbasiertes Arzneimitteldesign. Telomerase RNPs sind sehr reichlich vorhanden, auch in Krebszellen, was die Erkennung und Untersuchung dieses Enzyms herausfordernd macht. In diesem Beitrag beschrieben wir die schrittweisen Verfahren für den neu entwickelten ddTRAP-Test, um die Telomerase-Aktivität in Zellen robust zu quantifizieren. Durc...

Telomere sind dynamische DNA-Proteinkomplexe an den Enden linearer Chromosomen. Menschliche Telomere bestehen aus einem Array von 5 '-TTAGGGn hexamerischen Wiederholungen, die bei der Geburt1in der Länge zwischen 12 – 15 Kilobasen (kb) variieren. Das menschliche Telomerase, das Ribonucleoprotein-Enzym, das die Telomere unterhält, wurde erstmals in HeLa-Zell-Lysaten (Krebszelllinie) 2 identifiziert. Telomere und Telomerase spielen zusammen eine große Rolle in einem Spektrum biologischer Prozesse wie Genomschutz, Genregulation und Krebszellunsterblichkeit3,4, 5,6.
Die menschliche Telomerase besteht in erster Linie aus zwei Schlüsselkomponenten, nämlich der Telomerase Reverse Transkriptase und der Telomerase RNA (hTERT bzw. hTERC). Die Proteinuntereinheit hTERT ist die katalytisch aktive Rückkehr-Transkriptase-Komponente des Telomerase-Enzyms. Die RNA-Vorlage, hTERC, stellt Telomerase mit der Vorlage zur Verfügung, um and/oder die Telomere zu erweitern oder zu pflegen. Die meisten menschlichen somatischen Gewebe haben keine nachweisbare Telomerase-Aktivität. Die Unfähigkeit der DNA-Polymerase, das Ende des hinterherhinkenden DNA-Strangs zu verlängern, zusammen mit dem Mangel an Telomerase führt zu einer fortschreitenden Verkürzung der Telomere nach jeder Runde der Zellteilung. Diese Phänomene führen in den meisten somatischen Zellen zu einer telomerierten Verkürzung, bis sie eine kritisch verkürzte Länge erreichen, wobei die Zellen in einen Zustand der replizierenden Seneszenz gelangen. Die maximale Anzahl der Teilung einer Zelle wird durch ihre Telomere-Länge diktiert, und dieser Block zur fortgesetzten Zellteilung wird angenommen, um die Progression zur Onkogenese zu verhindern 7. Krebszellen sind in der Lage, die durch Telom verursachte Replikationsseneszenz zu überwinden und sich weiter zu vermehren, indem sie Telomerase nutzen, um ihre Telomere zu erhalten. Etwa 90% der Krebserkrankungen aktivieren Telomerase, was die Telomerasaktivität sowohl bei der Krebsfrüherkennung als auch bei der Behandlung von entscheidender Bedeutung macht.
Die Entwicklung des TRAP-Test in den 1990er Jahren war maßgeblich an der Identifizierung der notwendigen Komponenten des Telomerase-Enzyms sowie an der Messung von Telomerase in einer Vielzahl von Zellen und Geweben, sowohl normal als auch krebserregend, beteiligt. Der originale gelbasierte PCR-Test verwendete radioaktiv beschriftete DNA-Substrate, um Telomeraseaktivität zu erkennen. Im Jahr 2006 wurde der Test in eine nicht radioaktive Formmitfluoreszierenden Substraten 8,9angepasst. Durch den Einsatz fluoreszierender Substrate konnten die Anwender die Telomerase-Erweiterungsprodukte als Bänder auf einem Gel visualisieren, indem sie es der richtigen Anregungswellenlänge aussetzten. Die Empfindlichkeit des TRAP-Tests und seine Fähigkeit, Telomerase-Aktivität in Rohzell-Lysaten zu erkennen, hat diesen Test zur am weitesten verbreiteten Methode zur Messung der Telomerasaktivität gemacht. Der TRAP-Test hat jedoch Grenzen. Der Test ist gelebasiert, so dass es schwierig ist, die notwendigen Replikate in moderaten bis hochdurchsatz-Studien durchzuführen, und so wird nur selten eine korrekte statistische Analyse durchgeführt. Darüber hinaus ist der gelenbasierte Test aufgrund der Unfähigkeit, weniger als zwei Unterschiede in der Telomerasetaktivität zwischen den Proben zu erkennen, nur schwer zuverlässig zu quantifizieren. Die Überwindung dieser beiden Einschränkungen ist für enzymatische Aktivitätsuntersuchungen wie den TRAP von entscheidender Bedeutung, um in klinische oder industrielle Umgebungen zur Erkennung von Telomeraseaktivität in Patientenproben oder Medikamentendesign-Studien zu gelangen.
Digital PCR wurde 1999 entwickelt, um die exponentielle und analoge Natur von PCR in einen linearen und digitalen Test10umzuwandeln. Tröpfchen Digital PCR (ddPCR) ist die neueste Innovation der ursprünglichen digitalen PCR-Methodik. Tröpfchendigital wurde mit dem Aufkommen von fortschrittlichen Mikrofluidik und Öl-in-Wasser-Emulsion-Chemie entwickelt, um stabile und gleich große Tröpfchen zuverlässig zu erzeugen. Im Gegensatz zu gelbasierter und sogar quantitativer PCR (qPCR) generiert ddPCR eine absolute Quantifizierung des Eingangsmaterials. Der Schlüssel zu ddPCR ist die Generierung von ~ 20.000 individuellen Reaktionen durch die Teilung von Proben in Tröpfchen. Nach dem Endpunkt PCR scannt der Tröpfchenleser jeden Tröpfchenstreuer auf eine Fließzytometer-ähnliche Art und Weise, indem er das Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz in jedem einzelnen Tröpfchen zählt, vergrößert und aufzeichnet (d.h. das Fehlen oder das Vorhandensein von PCR-Amplicons in jedem Tröpfchen). Mit Hilfe der Poisson-Verteilung werden die Eingangsmoleküle anhand des Verhältnisses der positiven Tröpfchen zur Gesamtzahl der Tröpfchen geschätzt. Diese Zahl stellt eine Schätzung der Anzahl der Eingangsmoleküle in jeder PCR dar. Darüber hinaus wird ddPCR auf einer 96-well-Platte durchgeführt und analysiert, die es dem Anwender ermöglicht, viele Proben zu führen, sowie biologische und technische Replikate für eine korrekte statistische Analyse durchzuführen. Als Ergebnis haben wir die leistungsstarke Quantifizierung und Moderate-Durchsatz-Natur von ddPCR mit dem TRAP-Test kombiniert, um den ddTRAP-Test 11 zu entwickeln. Dieser Test ist für Anwender gedacht, um die absolute Telomerasaktivität aus biologischen Proben 11,12zu untersuchen und robust zu quantifizieren. Die Empfindlichkeit des ddTRAP ermöglicht die Quantifizierung der Telomerase-Aktivität aus begrenzten und wertvollen Proben, einschließlich Einzeller-Messungen. Darüber hinaus können die Konsumenten auch die Auswirkungen von Telomerase-Manipulationen und/oder Medikamenten mit absoluter Quantifizierung von weniger als zweifachen Änderungen (~ 50% Unterschiede) untersuchen. Der ddTRAP ist die natürliche Entwicklung des TRAP-Sassay in die digitale und überstrahlerische Natur moderner Laborversuche und klinischer Umgebungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

Das Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) ist der am weitesten verbreitete Test, um Telomeraseaktivität innerhalb einer bestimmten Probe zu erkennen. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode ermöglicht robuste Messungen der Enzymaktivität von den meisten Zelllysaten. Der gelbasierte TRAP mit fluoreszierend gekennzeichneten Primern begrenzt den Probendurchsatz, und die Fähigkeit, Unterschiede in Proben zu erkennen, ist auf zwei oder größere Veränderungen in der Enzymaktivität beschränkt. Der Tröpfchendigital TRAP, ddTRAP, ist ein hochsensibler Ansatz, der vom traditionellen TRAP-Test modifiziert wurde und es dem Anwender ermöglicht, eine robuste Analyse von 96 Proben pro Lauf durchzuführen und eine absolute Quantifizierung der DNA zu erhalten (Telomerase Extension Produkte). ) Eingaben in jeder PCR. Der neu entwickelte ddTRAP-Test überwindet daher die Grenzen des traditionellen gelbasierten TRAP-Tests und bietet einen effizienteren, präziseren und quantitativen Ansatz zur Messung der Telomerasaktivität im Labor und in klinischen Umgebungen.

Mit dem ddTRAP, Die Telomerase-Aktivität wurde in einer Zelltafel gemessen, die aus folgenden Zelllinien besteht (Abbildung1): Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 und H2887), Klassenturfaltenkrebs (H82 und SHP77) und Telomerase-negativ Fibroblasten (BJ). Eine Million Zellpellets wurden im NP-40-Puffer lysisiert, und Telomerase-Verlängerungsreaktionen wurden in biologischen Triplikaten durchgeführt. Eine gängige und sehr empfoh...

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Wir haben erfolgreich den Standard-Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) umgebaut, der in Tröpfchenspolonen-Kettenreaktionen eingesetzt werden soll. Dieser neue Test, genannt ddTRAP, ist sensibler und quantitativer, was eine bessere Erkennung und statistische Analyse der Telomeraseaktivität in verschiedenen menschlichen Zellen ermöglicht.

Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Der ddTRAP-Assay bietet die Möglichkeit, eine empfindliche, robuste und hochquantitative Messung der telomerase-enzymatischen Aktivität in Zellen zu erhalten. Die Möglichkeit, bis zu 96 Samples pro Durchlauf mitteldurchsatzweise zu laufen, bietet uns einen großen Vorteil. Wir können die Steuerelemente und Replikationen für eine ordnungsgemäße statistische Analyse der gesammelten Daten ausführen.Unmittelbar vor der Zelllysierung einen gefrorenen Aliquot von NP-40-Lysepuffer auftauen. Nach dem Auftauen den Lysepuffer auf Eis legen. Fügen Sie dem NP-40-Lysepuffer einen PMSF-Protease-Inhibitor hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 Millimolar zu erreichen.Fügen Sie dann 40 Mikroliter des Lysepuffers in die Röhre ein, die ein Zellpellet enthält, um eine Zelläquivalenz von 25 000 Zellen pro Mikroliter zu erreichen. Das Lysat nach oben und unten sanft pipette, um die Zellen aufzubrechen. Versuchen Sie, Blasen zu vermeiden.Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis lysieren. Mischen Sie das Lysat alle 10 Minuten sanft, um die Bildung von Zellabfallhaufen zu verhindern. Während der Zelllyse eine Mastermischung in einem Mikrozentrifugenrohr für die Telomerase-Verlängerungsreaktion vorbereiten und auf Eis lagern.Nach der Zelllyse mischen sich Pipette 48 Mikroliter Verlängerungsmaster in jedes PCR-Rohr. Fügen Sie zwei Mikroliter verdünntes Lysat zu jedem PCR-Röhrchen hinzu, um eine endgültige Zelläquivalenz von 50 Zellen pro Mikroliter zu erreichen, und setzen Sie die Telomerase-Erweiterungsreaktion entsprechend dem Manuskript fort. Bereiten Sie eine Master-Mischung in einem Mikrozentrifugenrohr für den ddTRAP vor und halten Sie ihn bei Raumtemperatur.Pipette 19,8 Mikroliter ddPCR Master-Mix in jedes PCR-Rohr. Fügen Sie 2,2 Mikroliter der vorherigen Verlängerungsreaktionslösung zu jeder Röhre hinzu, so dass ein Gesamtvolumen von 22 Mikrolitern übrig bleibt. Um die Tröpfchen-Generierungspatrone einzurichten, laden Sie zunächst 20 Mikroliter der vorbereiteten Lösung gut in die mittlere Probe gut in die Patrone.Tippen Sie vorsichtig auf die Seite der Patrone, um Blasen an die Oberseite der Lösung zu bewegen. Alle Brunnen der Patrone müssen vor dem Verladen des Öls mit Probe beladen werden. Dann 70 Mikroliter Tröpfchen-Erzeugungsöl in den linken Ölbrunnen laden.Sichern Sie die Dichtung an Ort und Stelle, indem Sie sie an die Enden der Patrone kleben, und legen Sie die geladene und montierte Patrone in den Tröpfchengenerator. Der Generator zeigt ein durchgehendes grünes Licht an, um die korrekt platzierte Patrone mitzuteilen. Nach 60 bis 90 Sekunden, wenn das Generatorlicht nicht mehr blinkt, ist der Zyklus abgeschlossen.Entfernen Sie nun die Patrone. Entfernen Sie die Dichtung vorsichtig aus der Patrone. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ca. 40 Mikroliter der neu erzeugten Tröpfchen von rechts in eine 96-Well-PCR-Platte zu pipette.Wärmen Sie die Platte mit Aluminiumfolie PCR-Plattendichtungen, sobald alle Proben in der 96-Well-Platte geladen sind, um Verdunstung zu verhindern. Dann laden Sie die 96-Well-Platte in einen Thermocycler, um die PCR-Reaktion durchzuführen. Laden Sie zunächst die 96-Well-Platte in den Tröpfchenleser.Richten Sie die Platte richtig aus, so dass die A1-Probe mit der des Halters übereinstimmt. Öffnen Sie die Software, die dem Tröpfchenleser zugeordnet ist. Doppelklicken Sie auf den ersten Brunnen, A01, um den Beispiel-Gut-Editor-Bildschirm zu öffnen.Klicken Sie auf Experimentieren, und wählen Sie den Typ des Assays aus, der im Dropdown-Menü verwendet werden soll. Wählen Sie QX200 ddPCR EvaGreen Supermix als korrekte Erkennungsmethode aus. Klicken Sie auf Anwenden in der unteren rechten Seite des Gut-Editor-Bildschirms, um die benutzerdefinierten Einstellungen in allen hervorgehobenen Brunnen zu speichern.Klicken Sie als Nächstes im Gut-Editor-Bildschirm auf Ziel, und klicken Sie auf das Dropdown-Menü Ziel, um entweder unbekanntes, Referenz- oder Vorlagensteuerelement auszuwählen, um den Typ des Beispiels zu definieren. Beschriften Sie im Abschnitt Beispielname alle Beispiele, und klicken Sie auf Anwenden. Klicken Sie auf Ausführen, um das Kennzeichen zu lesen.Wählen Sie entweder Spalten oder Zeilen im Bildschirm Ausführungsoptionen aus, wenn Sie aufgefordert werden, über die Ausrichtung der Platte zu informieren. Bestimmen Sie die Anzahl der akzeptierten Tröpfchen für jede Probe, indem Sie auf die einzelnen Brunnen oder Spalten- und Zeilenüberschriften doppelklicken, um eine Tabelle mit Informationen bereitzustellen. Für den ddTRAP gelten Proben mit 10.000 oder mehr akzeptierten Tröpfchen für die weitere Analyse.Markieren Sie die Bohrungen, die Beispielreplikationen und NTC-Beispiele darstellen. Legen Sie den Schwellenwert für die Beispiele manuell fest, indem Sie auf das Symbol zum Festlegen von Schwellenwerten unten links auf dem Bildschirm klicken. In diesem Protokoll wurde die Telomeraseaktivität in einem Zellpanel gemessen, das aus neun Zelllinien von Lungenkrebs und Telomerase-negativen Fibroblasten besteht.Für alle drei biologischen Replikationen für SHP77, H2887 und NTC wurde ein Schwellenwert von etwa 2 000 Fluoreszenzamplitude festgelegt. Positive Tröpfchen hatten eine Fluoreszenzintensität von etwa 6 000 Fluoreszenzamplitude, die eine klare Population an der Spitze bildete und von negativen Tröpfchen um 1,100 Fluoreszenzamplitude getrennt war. Die gesamten Telomerase-Erweiterungsprodukte pro Zelläquivalent zwischen allen Proben wurden anhand der gemessenen Konzentration der Nukleinsäuren geschätzt, die die Telomerase-Aktivität in Lungenkrebslinien darstellt.Jede RNase-Kontamination während der Lyse- oder Verlängerungsreaktionsschritte zerstört die enzymatische Aktivität von Telomerase, da es sich um einen Ribonukleoprotein-Komplex handelt. ddTRAP kann mit ddPCR auf hTERT mRNA-Expressionsebenen in der Zelle verfolgt werden. Die beiden Datensätze ermöglichen es uns, den Ausdruck von hTERT mit telomerase Aktivität zu korrelieren und tiefer in mögliche Telomerase-Regulierungsmechanismen wie alternatives Spleißen einzutauchen.Wir können Manipulationen zu bestimmten Spleißfaktoren und deren Auswirkungen auf die Telomerase-Aktivität untersuchen. Derzeit entwickeln wir Oligonukleotid-Spleißmodulatoren als potenzielle Medikamente, die auf Telomerase-Aktivität abzielen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Forschung

Krebsforschung

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digitale Analyse der Immunostainierung von ZW10 Interacting Protein in menschlichen Lungengeweben

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Wichtige Endpunkte und proliferative Marker zur Beurteilung von kleinen Darmverletzungen und Anpassung mit einem Mausmodell der Chemotherapie-induzierten Mukositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...