Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

המחברים רוצים לאשר את מקורות המימון של מכוני הבריאות הלאומיים (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). תאים קטנים לסרטן הריאות (SHP77 ו H82) היו מתנה נדיבה של ד ר. ג'ון מינין ועדי גזדאר מהמרכז הרפואי UT דרום-מערב.

1. הכנה ואחסון של מאגר
<ol><li>להכין 50 mL של 1x מניות RNase-/Dnaset-free NP-40 לליזה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl [pH 8.0], 1 מ"מ MgCl2, 1 מילימטר החומצה (edta), 1% [vol/VOL] NP-40, 10% [vol/vol] גליצרול, 150 מ"מ הנאל, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 mM 4- הידרואנסולולוניל פלווריד (AEBSF)). ניתן לצטט מאגר זה ולאחסנו ב-20 ° c לשימוש עתידי. הימנע הקפאת/הפשרת מחזורי ?...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

המדידה של פעילות טלומראז היא קריטית לשפע של נושאי מחקר כולל, אבל לא מוגבל, סרטן, טלומראז ביולוגיה, הזדקנות, רפואה רגנרטיבית, ועיצוב מבנה מבוסס סמים. Telomerase RNPs נמוכים בשפע, גם בתאים סרטניים, מה שהופך את האיתור והמחקר של האנזים הזה מאתגר. במאמר זה, תיארנו את ההליכים צעד אחר צעד עבור הצורך החדש שפ...

טלומרים הם מתחמי DNA-פרוטאין דינמיים בקצות כרומוזומים ליניאריים. טלומרים אנושיים מורכבים ממערך של 5 '-TTAGGGn hexameric חוזר אשר משתנה באורך בין 12 – 15 קילו (kb) בלידה1. מחיקת האדם, האנזים הריבונאופלפרוטאין השומר על הטלומרים, זוהה לראשונה ב-"הלה תאי" (קו תאי סרטן)2. יחד, טלומרים ו טלומרים לשחק תפקיד מרכזי בספקטרום של תהליכים ביולוגיים כגון הגנת הגנום, תקנות גנים, סרטן תאים אלמוות3,4,5,6.
האדם טלומראז מורכב בעיקר של שני מרכיבים מרכזיים, כלומר טלומראז הפוכה הטרנסקריפטאז ו טלומראז RNA (htert ו htert, בהתאמה). החלבון התחתי, htert, הוא מרכיב הפוכה פעיל היפוך הטרנססקריפט של האנזים טלומראז. תבנית RNA, hterc, מספקת טלומראז עם התבנית כדי להרחיב ו/או לשמור טלומראז. לרוב הרקמות הגופניות האנושיות אין פעילות מוחקת. חוסר היכולת של דנ א פולימראז להאריך את סופו של בפיגור של ה-dna יחד עם חוסר של טלומראז מוביל את הקיצור המתקדם של טלומראז לאחר כל סיבוב של החטיבה התאית. תופעות אלו מובילות לקיצור ברוב התאים הסומטיים עד שהם מגיעים לאורך מקוצר ביקורתי, לפיו תאים נכנסים למצב של הזדקנות מחודשת. המספר המקסימלי של פעמים תא יכול לחלק מוכתב על ידי האורך שלה טלומר ובלוק זה להמשך החטיבה התא הוא חשב למנוע התקדמות אונגנזה7. תאים סרטניים מסוגלים להתגבר על הזדקנות המושרה telomere ולהמשיך להתרבות על ידי ניצול telomere כדי לשמור על telomere שלהם. כ 90% של סרטן להפעיל טלומראז, מה שהופך פעילות טלומראז חשוב באופן ביקורתי בזיהוי וטיפול בסרטן.
ההתפתחות של שיטת המלכודת בשנות ה-90 הייתה אינסטרומנטלית בזיהוי המרכיבים הנחוצים של האנזים הטלומראז, כמו גם למדידת היקף התאים והרקמות, הן נורמליות והן סרטניים. שיטת ה-PCR המקורית המבוססת על ג'ל השתמשה ברדיוגנטית מתייגת מצעים DNA כדי לזהות פעילות טלומראז. בשנת 2006, העיבוד הותאם לצורה לא רדיואקטיבית באמצעות fluorescently אופן התווית מצעים8,9. באמצעות fluorescently אופן התווית מצעים, המשתמשים הצליחו להמחיש את מוצרי ההרחבה טלומראז כמו להקות על ג'ל על ידי חשיפת אותו גל עירור הנכון. הרגישות של שיטת המלכודת ויכולתה לזהות פעילות טלומראז ב-lysates תא גולמי הפכה את השיטה הנפוצה ביותר לשימוש הנפוץ ביותר עבור זיהוי פעילות טלומראז. עם זאת, לשיטת ההשמנה יש מגבלות. הטיפול הינו מבוסס ג'ל, ומקשה על ביצוע השכפל הדרוש בינוני ועד תפוקה גבוהה, ולכן מושגת לעתים רחוקות ניתוח סטטיסטי מתאים. יתרה מזאת, היכולת המבוססת על ג'ל קשה לכמת באופן אמין עקב חוסר מזהה פחות מאשר כפולה הבדלים בפעילות טלומראז בין דגימות. התגברות על שתי מגבלות אלה היא קריטית לטיפול בפעילות אנזימטית כגון המלכודת לעבור להגדרות הקליניות או התעשייה לאיתור פעילות טלומראז בדגימות מטופלים או בלימודי עיצוב סמים.
ה-PCR הדיגיטלי פותח בתחילה ב-1999 כאמצעי להמרת האופי האקספוננציאלי והאנלוגי של הPCR לתוך שיטת ליניארי ודיגיטלית מסוג10. ה-PCR הדיגיטלי (ddPCR) הוא החדשנות העדכנית ביותר של מתודולוגיית ה-PCR הדיגיטלית המקורית. ה-PCR הדיגיטלי של Droplet הגיע עם הופעתו של מיקרופלואידיקה מתקדם מיקרופלואידיקה וכימיה אמולסיה שמן במים כדי ליצור באופן אמין טיפות בגודל יציב ובמידה שווה. בניגוד ל-PCR המבוסס על ג'ל ואפילו כמותי, ddPCR יוצר קוונפיקציה מוחלטת של חומר הקלט. המפתח ddPCR הוא הדור של ~ 20,000 תגובות בודדות על ידי מחיצות דגימות לתוך טיפות. בעקבות ה-PCR של נקודת הסיום, הקורא droplet סורק כל droplet בצורה של זרימה-cytometer לספור, לגודל, ולהקליט את הנוכחות או העדר של הזריחה בכל droplet בודדת (כלומר, היעדרות או נוכחות של הגברה PCR ב-droplet). לאחר מכן, באמצעות התפלגות פואסון, מולקולות קלט מוערכות בהתאם ליחס של טיפות חיוביות למספר הכולל של טיפות. מספר זה מייצג הערכה של מספר מולקולות הקלט ב-PCR. יתר על כן, ddPCR מבוצע ומנותח על צלחת 96-באר אשר מאפשר למשתמש להפעיל דגימות רבות, כמו גם לבצע משכפל ביולוגי וטכני לניתוח סטטיסטי תקין. כתוצאה מכך, אנו שילבו את הקוונפיקציה עוצמה והתפוקה הבינונית של הטבע ddPCR עם בדיקת המלכודת כדי לפתח את השיטת Ddpcr11. שיטת העבודה מיועדת למשתמשים ללמוד ולכמת את הפעילות המוחלטת של טלומראז מדגימות ביולוגיות11,12. רגישות ה-ddtrap מאפשרת את כימות הפעילות של טלומראז מדגימות מוגבלות ויקרות, כולל מדידות תא יחיד. יתר על כן, משתמשים יכולים גם ללמוד את ההשפעות של מניפולציות טלומראז ו/או תרופות עם כימות מוחלטת של פחות מאשר שינויים כפולה (~ 50% הבדלים). ה-ddTRAP הוא האבולוציה הטבעית של הגדרת המלכודת לטבע הדיגיטלי והתפוקה הגבוהה יותר של ניסויי מעבדה מודרניים והגדרות קליניות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

הפרוטוקול של הגברה חוזרת של טלומר (TRAP) הוא הדבר הנפוץ ביותר לזיהוי פעילות טלומר בתוך מדגם נתון. השיטה המבוססת על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מאפשרת מדידות איתנות של פעילות אנזימים ממרבית תאי התאים. המלכודת המבוססת על ג'ל עם התווית התחל מגבילה את התפוקה לדוגמה, והיכולת לזהות הבדלים בדגימות מוגבלת לשני שינויים מתקפל או גדולים יותר בפעילות האנזים. המלכודת ה-droplet הדיגיטלית, ddTRAP, היא גישה רגישה מאוד ששונתה מתוך מבנה המלכודת המסורתי, מה שמאפשר למשתמש לבצע ניתוח מעמיק על 96 דגימות לכל הפעלה ולהשיג קוונפיקציה מוחלטת של ה-DNA (telomerase מוצרים הרחבה ) בתוך כל ה-PCR. לכן, שיטת ddtrap שפותחה לאחרונה גוברת על המגבלות של שיטת ההשמנה המסורתית ג'ל מבוססת ומספקת גישה יעילה יותר, מדויקת וכמותית למדידת פעילות טלומראז בתוך המעבדה והגדרות קליניות.

באמצעות מלכודת ddomמחק נמדד בלוח התא המורכב של קווי התא הבאים (איור 1): סרטן ריאות תא קטן (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, ו H2887), סרטן ריאות תא קטן (H82 ו-SHP77), ו-טלומראז-שלילי פיברותקיעות (BJ). 1,000,000 כדורי תא היתה לאחר מאגר NP-40, ו-טלומראז תגובות הארכה בוצעו בטריליטים ביולוגיים. פק?...

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

הצלחנו להמיר בהצלחה את התקן טלומר חוזר פרוטוקול (מלכודת) האפשרות להיות מועסק בתגובות שרשרת droplet דיגיטלית פולימראז. שיטת הפעולה החדשה, הנקראת ddtrap, רגישה יותר וכמותית, ומאפשרת זיהוי טוב יותר וניתוח סטטיסטי של פעילות טלומראז בתוך תאים אנושיים שונים.

מלכודת droplet דיגיטלית (ddTRAP): הסתגלות פרוטוקול Telomere חזרה הגברה על תגובת שרשרת התגובה של רביב דיגיטלי

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

המבחן ddTRAP מספק את היכולת להשיג מדידה רגישה, חזקה, וכמותית מאוד של פעילות אנזימטית telomerase בתאים. היכולת לרוץ עד 96 דגימות לכל ריצה בצורה בתפוקה בינונית מציעה לנו יתרון גדול. אנחנו יכולים להפעיל את הפקדים והשכפולים לניתוח סטטיסטי נכון על הנתונים שנאספו.מיד לפני lysing התא, להפשיר aliquot קפוא של מאגר תריס NP-40. לאחר הפשרה, מניחים את חיץ תיזה על קרח. הוסף מעכבי פרוטאז PMSF למאגר תות NP-40 כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2 מילימולר.לאחר מכן, להוסיף 40 microliters של מאגר תיזה לצינור המכיל גלולת תא כדי להגיע שקילות תא של 25, 000 תאים לכל microliter. בעדינות pipette את lysate למעלה ולמטה על מנת לשבור לפתוח את התאים. נסה להימנע מהכנת בועות.אפשר לתאים lyse על קרח במשך 30 דקות. בעדינות מערבולת lysate כל 10 דקות כדי למנוע אשכולות של פסולת התא להיווצר. במהלך תמוגת התא, להכין תערובת אב בצינור microcentrifuge לתגובת הארכת telomerase, ולאחסן על קרח.לאחר תות התא, פיפטה 48 מיקרוליטרים של מאסטר הארכה לערבב לתוך כל צינור PCR. הוסיפו שני מיקרוליטרים של ליט מדולל לכל צינור PCR כדי להגיע לשווי משקל תאי סופי של 50 תאים למיקרוליטר, והמשיכו את תגובת הארכת הטלומראז על פי כתב היד. הכינו תערובת אב בצינור מיקרוצנטריפוגה עבור ddTRAP, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.פיפטה 19.8 מיקרוליטרים של ddPCR מאסטר לערבב לתוך כל צינור PCR. הוסף 2.2 microliters של פתרון תגובת ההרחבה הקודמת לכל צינור, משאיר נפח כולל של 22 microliters. כדי להגדיר את מחסנית ייצור טיפות, טען תחילה 20 מיקרוליטרים של הפתרון המוכן לתוך הדגימה האמצעית היטב במחסנית.הקש בעדינות על צד המחסנית כדי להעביר את כל הבועות לראש הפתרון. כל בארות המחסנית חייבות להיות עמוסות בדגימה לפני טעינת שמן. לאחר מכן, לטעון 70 microliters של שמן ייצור טיפה לתוך באר השמן השמאלי.אבטחו את אטם במקום על ידי חבלו אותו לקצוות המחסנית, והכנסו את המחסנית הטעונה וההרכבה לגנרטור טיפה. הגנרטור מראה אור ירוק מוצק כדי להודיע שהמחסנית ממוקמת כראוי. לאחר 60 עד 90 שניות, כאשר אור הגנרטור מפסיק להבהב, המחזור הושלם.כעת הסר את המחסנית. מוציאים בעדינות את אטם הגז מהמחסנית. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי pipette כ 40 microliters של טיפות שזה עתה נוצרו מן הגם הימנית לתוך צלחת PCR 96-well.חום לאטום את הצלחת עם אטמי לוח PCR רדיד אלומיניום פעם כל הדגימות נטענים בצלחת 96 גם כדי למנוע אידוי. לאחר מכן, לטעון את הצלחת 96-well לתוך תרמוסיקלר כדי לבצע את תגובת PCR. כדי להתחיל, לטעון את הלוח 96 באר לתוך קורא טיפות.כוון את הלוח כראוי כך שדגימה A1 תואמת לזה של המחזיק. פתח את התוכנה המשויכת לקורא טיפות. לחץ פעמיים על הבאר הראשונה, A01, כדי לפתוח את מסך עורך הבאר לדוגמה.לחץ על ניסוי ובחר את סוג ההתן לשימוש מהתפריט הנפתח. בחר QX200 ddPCR EvaGreen Supermix כשיטה לזיהוי הנכון. לחץ על החל בצד הימני התחתון של מסך עורך הבאר כדי לשמור את ההגדרות המוגדרות על-ידי המשתמש בכל הבאר המסומן.לאחר מכן, לחץ על יעד במסך עורך הבאר ולחץ על התפריט הנפתח Target כדי לבחור פקד לא ידוע, הפניה או פקד ללא תבנית כדי להגדיר את סוג הדגימה. במקטע שם לדוגמה, סמן את כל הדוגמאות בתווית ולחץ על החל. לחץ על הפעל כדי לקרוא את הלוח.בחר עמודות או שורות במסך אפשרויות הפעלה כאשר תתבקש להודיע על הכיוון שבו יש לקרוא את הלוח. קבע את מספר ה טיפות מקובלות עבור כל מדגם על-ידי לחיצה כפולה על הבארים הבודדים או כותרות העמודות והעמודות כדי לספק רשימת מידע. עבור ddTRAP, דגימות עם 10, 000 טיפות מקובלות או יותר תקפות לניתוח נוסף.סמן את בארות המייצגות שכפולים לדוגמה ודגימות NTC. הגדר ידנית את הסף עבור הדוגמאות על-ידי לחיצה על הסמל להגדרת ספי סף בפינה הימנית התחתונה של המסך. בפרוטוקול זה נמדדה פעילות טלומראז בלוח תאים המורכב מתשעה קווי תאים של סרטן ריאות ופיברובלסטים שליליים טלומראז.סף נקבע בסביבות 2,000 משרעת פלואורסצנטיות עבור כל שלושת השכפולים הביולוגיים עבור SHP77, H2887 ו- NTC. טיפות חיוביות היו בעוצמת פלואורסצנטיות סביב 6, 000 משרעת פלואורסצנטיות, אשר יצרה אוכלוסייה ברורה בחלק העליון, ונפרד טיפות שליליות סביב 1, 100 משרעת פלואורסצנטיות. סך כל מוצרי הרחבת הטלומראז לתא המקביל בין כל הדגימות הוערך מהריכוז הנמדד של חומצות הגרעין, המייצג את פעילות הטלומראז בקווי סרטן הריאות.כל זיהום RNase במהלך תמיסת או שלבי תגובת הארכה יהרוס את הפעילות האנזימטית telomerase שכן הוא קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין. ddTRAP ניתן לעקוב עם ddPCR ברמות ביטוי mRNA hTERT בתא. שתי ערכות הנתונים מאפשרות לנו לתאם את הביטוי של hTERT עם פעילות telomerase ולחפור עמוק יותר לתוך מנגנונים רגולטוריים telomerase פוטנציאליים כגון שיפוח חלופי.אנחנו יכולים לחקור מניפולציות לגורמי שיפוח ספציפיים וההשפעות שלהם על פעילות telomerase. נכון לעכשיו, אנו מעצבים אפנוני שיפודי אוליגונוקלאוטיד כסמים פוטנציאליים המכוונים לפעילות טלומראז.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג&#39;ל

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

ניתוח דיגיטלי של מעטפת חיסונית של חלבון ZW10 אינטראקציה רקמות ריאות האדם

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

חשוב נקודות קצה וסמנים ההתרבות כדי להעריך פגיעה במעיים קטנים והסתגלות באמצעות מודל העכבר של Mucositis הנגרמת כימותרפיה

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

היתוך גנים אונגניים באמצעות שרשרת מעוגנת התגובה השרשרת מעוגן ואחריו רצף הדור הבא

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...