Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

लेखकों को स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1) से धन स्रोतों को स्वीकार करना चाहते हैं । छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर लाइनों (SHP77 और H82) Drs से एक उदार उपहार थे । जॉन Minna और आदि Gazdar यूटी पश्चिमी चिकित्सा केंद्र से ।

1. बफर तैयारी और भंडारण
<ol><li>1x स्टॉक RNase-/Dnase-free एनपी-४० lysis बफर के ५० मिलीलीटर तैयार करें (10 मिमी Tris-एचसीएल [पीएच ८.०], 1 मिमी MgCl2, 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 1% [vol/vol] NP-४०, 10% [vol/०.१ १५० बेन्ज़ेनेसल्फोनिल फ्लोराइड हाइड्रोक्?...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

टेलोमिरेज गतिविधि की माप सहित अनुसंधान विषयों के एक बहुतायत के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन तक ही सीमित नहीं, कैंसर, टेलोमिरेज जीवविज्ञान, उंर बढ़ने, पुनर्योजी चिकित्सा, और संरचना आधारित दवा डिजाइन । Telomerase RNP...

Telomeres गतिशील डीएनए-रेखीय गुणसूत्र के सिरों पर प्रोटीन परिसरों हैं । मानव telomeres के एक सरणी से बना रहे है 5 '-TTAGGGn hexameric दोहराता है जो 12 के बीच लंबाई में अलग--15 किलोबाइट (kb) में जन्म1। मानव telomerase, ribonucleoprotein एंजाइम है कि telomerase का कहना है, सबसे पहले HeLa सेल lysates (कैंसर सेल लाइन)2में पहचाना गया था । साथ में, telomeres और telomeres जीनोम संरक्षण, जीन विनियमन, और कैंसर सेल अमरत्व3,4,5,6के रूप में जैविक प्रक्रियाओं के एक स्पेक्ट्रम में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं ।
मानव टेलोमिरेज मुख्य रूप से दो प्रमुख घटकों, अर्थात् टेलोमिरेज रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस और टेलोमिरेज आरएनए (htert और htert, क्रमशः) के शामिल है । प्रोटीन उपइकाई, hTERT, टेलोमेरेज एंजाइम के उत्प्रेरक के रूप में सक्रिय रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस घटक है । आरएनए टेम्पलेट, hterc, टेलोमिरेज प्रदान करता है और विस्तार करने के लिए टेंपलेट के साथ/ अधिकांश मानव दैहिक ऊतकों का कोई detectable टेलोमेरेज क्रियाकलाप नहीं है । डीएनए पॉलीमरेज की अक्षमता के साथ-साथ टेलोमेरेज की कमी के साथ डीएनए के पश्चगामी भूग्रस्त का विस्तार करने के लिए कोशिकीय विभाजन के हर दौर के बाद टेमराज का उत्तरोत्तर छोटा हो जाता है । इन घटनाओं सबसे दैहिक कोशिकाओं में telomere छोटा करने के लिए नेतृत्व जब तक वे एक गंभीर रूप से छोटा लंबाई तक पहुँचने, जिससे कोशिकाओं रेचक जीर्णता के एक राज्य में प्रवेश. बार एक सेल विभाजित कर सकते है की अधिकतम संख्या अपनी telomere लंबाई से तय है और जारी सेल डिवीजन के लिए इस ब्लॉक के लिए oncogenesis7के लिए प्रगति को रोकने के लिए सोचा है । कैंसर की कोशिकाओं को telomere प्रेरित replicative जीर्णता पर काबू पाने के लिए और telomere का उपयोग करने के लिए उनके telomere बनाए रखने के लिए जारी रखने में सक्षम हैं । कैंसर का लगभग ९०% टेलोमिरेज सक्रिय है, टेलोमिरेज गंभीर रूप से महत्वपूर्ण गतिविधि बनाने के दोनों में जांच और उपचार ।
1990 के दशक में जाल परख के विकास टेलोमिरेज एंजाइम के आवश्यक घटकों की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं और ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में टेलोमिरेज के मापन के लिए, दोनों सामांय और कैंसर । मूल जेल आधारित पीसीआर परख रेडियोसक्रिय रूप से डीएनए substrates लेबल के लिए टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने का इस्तेमाल किया । २००६ में, परख एक nonradioactive रूप में अनुकूलित किया गया fluorescently का उपयोग कर8,9substrates लेबल । Fluorescently लेबल substrates का उपयोग करके, उपयोगकर्ताओं को यह सही उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को उजागर द्वारा एक जेल पर बैंड के रूप में टेलोमिरेज विस्तार उत्पादों कल्पना करने में सक्षम थे । जाल परख और इसके लिए कच्चे तेल की सेल lysates में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने की क्षमता की संवेदनशीलता इस परख टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि बना दिया है । हालांकि, जाल परख की सीमाएं हैं । परख जेल आधारित है, यह कठिन प्रदर्शन करने के लिए उदार उच्च throughput अध्ययन करने के लिए, और इस प्रकार, उचित सांख्यिकीय विश्लेषण शायद ही कभी हासिल की है । इसके अलावा, जेल आधारित परख के लिए मज़बूती से नमूनों के बीच टेलोमिरेज गतिविधि में कम दोहरा मतभेदों से पता लगाने की अक्षमता की वजह से मुश्किल है । इन दो सीमाओं पर काबू पाने एंजाइमी गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है assays है जैसे जाल रोगी नमूनों या दवा डिजाइन अध्ययन में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए नैदानिक या उद्योग सेटिंग्स में ले जाने के लिए ।
डिजिटल पीसीआर को प्रारंभ में १९९९ में पीसीआर के घातीय और एनालॉग प्रकृति को एक रैखिक और डिजिटल परख10में परिवर्तित करने के लिए एक साधन के रूप में विकसित किया गया था । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) मूल डिजिटल पीसीआर प्रणाली के सबसे हाल ही में नवाचार है । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर उंनत microfluidics और तेल में पानी पायस रसायन के आगमन के साथ मज़बूती से स्थिर और समान रूप से आकार बूंदों उत्पंन करने के लिए आया था । जेल आधारित और यहां तक कि मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के विपरीत, ddPCR इनपुट सामग्री का पूर्ण प्रमात्रीकरण उत्पंन करता है । DdPCR के लिए कुंजी ~ २०,००० बूंदों में विभाजन नमूनों द्वारा व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी है । अंत बिंदु पीसीआर के बाद, छोटी बूंद पाठक एक प्रवाह-cytometer की तरह फैशन, गिनती, नौकरशाही का आकार घटाने में प्रत्येक छोटी बूंद को स्कैन, और उपस्थिति या प्रत्येक व्यक्ति छोटी बूंद में प्रतिदीप्ति की अनुपस्थिति रिकॉर्डिंग (यानी, अनुपस्थिति या प्रत्येक छोटी बूंद में पीसीआर amplicons की उपस्थिति) । फिर, पॉसन के वितरण का उपयोग करके, इनपुट अणुओं को बूंदों की कुल संख्या के लिए सकारात्मक बूंदों के अनुपात के आधार पर अनुमान लगाया जाता है । यह संख्या प्रत्येक पीसीआर में इनपुट अणुओं की संख्या का अनुमान दर्शाती है । इसके अलावा, ddpcr प्रदर्शन किया है और एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट जो उपयोगकर्ता कई नमूनों को चलाने के लिए, साथ ही जैविक और तकनीकी उचित सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रतिकृति प्रदर्शन की अनुमति देता है पर विश्लेषण । परिणामस्वरूप, हमने डीडीपीसीआर की शक्तिशाली मात्रा और मॉडरेट थ्रूपुट प्रकृति को ट्रैप परख के साथ जोड़ दिया है ताकि डीडीट्रैप आमापन11को विकसित किया जा सके । इस परख के लिए उपयोगकर्ताओं के अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है और दृढ़ता से जैविक नमूनों11,12से पूर्ण टेलोमिरेज गतिविधि मात्रा ठहराना । Ddtrap की संवेदनशीलता सीमित और कीमती नमूनों से टेलोमिरेज गतिविधि की मात्रा, एकल कोशिका माप सहित की अनुमति देता है । इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं को भी टेलोमिरेज जोड़तोड़ के प्रभाव का अध्ययन कर सकते है और/या दवाओं के पूर्ण प्रमात्रीकरण से कम दोहरा परिवर्तन (~ ५०% मतभेद) । DdTRAP आधुनिक प्रयोगशाला प्रयोगों और नैदानिक सेटिंग्स की डिजिटल और उच्च थ्रूपुट प्रकृति में जाल परख के प्राकृतिक विकास है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

Telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल (जाल) एक दिया एक नमूना के भीतर telomere गतिविधि का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख है । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित विधि सबसे सेल lysates से एंजाइम गतिविधि के मजबूत माप के लिए अनुमति देता है । Fluorescently लेबल प्राइमरों के साथ जेल आधारित जाल नमूना throughput सीमा, और नमूनों में मतभेदों का पता लगाने की क्षमता दो गुना या एंजाइम गतिविधि में अधिक से अधिक परिवर्तन करने के लिए प्रतिबंधित है. छोटी बूंद डिजिटल जाल, ddtrap, एक अत्यंत संवेदनशील दृष्टिकोण है कि पारंपरिक जाल परख से संशोधित किया गया है, उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए प्रति रन ९६ नमूनों पर एक मजबूत विश्लेषण करने के लिए और डीएनए के निरपेक्ष परिमाणन प्राप्त (telomerase विस्तार उत्पादों ) प्रत्येक पीसीआर के भीतर इनपुट । इसलिए, नव विकसित ddtrap परख पारंपरिक जेल आधारित जाल परख की सीमाओं पर काबू पा और एक अधिक कुशल, सटीक, और प्रयोगशाला और नैदानिक सेटिंग्स के भीतर टेलोमिरेज गतिविधि को मापने के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

Ddtrap का उपयोग करते हुए, टेलोमिरेज गतिविधि एक सेल निंनलिखित कोशिका लाइनों से मिलकर पैनल में मापा गया था (चित्रा 1): nonsmall सेल फेफड़ों के कैंसर (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, और H2887), छोटे सेल फेफड़ों के कैं?...

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Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

हम सफलतापूर्वक मानक telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल (जाल) परख परिवर्तित करने के लिए छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं में कार्यरत हो । यह नई परख, ddtrap कहा जाता है, और अधिक संवेदनशील और मात्रात्मक है, बेहतर पता लगाने और विभिंन मानव कोशिकाओं के भीतर टेलोमिरेज गतिविधि के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अनुमति दी ।

छोटी बूंद डिजिटल ट्रैप (ddTRAP): छोटी बूंद डिजिटल Polymerase चेन रिएक्शन करने के लिए Telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल के अनुकूलन

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

डीडीट्रैप परख कोशिकाओं में टेलोमेरेज एंजाइमेटिक गतिविधि के संवेदनशील, मजबूत और अत्यधिक मात्रात्मक माप प्राप्त करने की क्षमता प्रदान करती है। मीडियम थ्रूपुट फैशन में प्रति रन ९६ नमूनों को चलाने की क्षमता हमें एक बड़ा फायदा देती है । हम एकत्र किए गए डेटा पर उचित सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए नियंत्रण और प्रतिकृति चला सकते हैं।सेल लाइसिंग से तुरंत पहले, एनपी-40 लाइसिस बफर के एक जमे हुए एलिकोट को पिघलाएं। एक बार गल जाने के बाद, लाइसिस बफर को बर्फ पर रखें। 0.2 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए एनपी-40 लाइसिस बफर में पीएमएसएफ प्रोटीज अवरोधक जोड़ें।फिर, 25, 000 कोशिकाओं प्रति माइक्रोलीटर की कोशिका तुल्यता तक पहुंचने के लिए एक सेल पेलेट युक्त ट्यूब में लाइसिस बफर के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को खोलने के लिए धीरे-धीरे लिस्एट को ऊपर और नीचे करें। बुलबुले बनाने से बचने की कोशिश करें।कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए बर्फ पर lyse करने की अनुमति दें। सेल मलबे के समूहों को बनाने से रोकने के लिए हर 10 मिनट में धीरे-धीरे भंवर। सेल लाइसिस के दौरान, टेलोमेराज़ एक्सटेंशन रिएक्शन के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मास्टर मिक्स तैयार करें, और बर्फ पर स्टोर करें।सेल लाइसिस के बाद, प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में एक्सटेंशन मास्टर के 48 माइक्रोलीटर मिक्स करें। प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में पतला lysate के दो माइक्रोलीटर जोड़ें ताकि प्रति माइक्रोलीटर 50 कोशिकाओं की अंतिम कोशिका तुल्यता तक पहुंच सके, और पांडुलिपि के अनुसार टेलोमेरेस एक्सटेंशन प्रतिक्रिया जारी रखें। डीडीट्रैप के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मास्टर मिक्स तैयार करें, और इसे कमरे के तापमान पर रखें।प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में डीडीपीसीआर मास्टर के पिपेट 19.8 माइक्रोलीटर मिक्स करते हैं। प्रत्येक ट्यूब में पिछले एक्सटेंशन रिएक्शन समाधान के 2.2 माइक्रोलीटर जोड़ें, जिससे कुल 22 माइक्रोलीटर की मात्रा छोड़ी जा सके। बूंद पीढ़ी कारतूस स्थापित करने के लिए, पहले तैयार समाधान के 20 माइक्रोलीटर को कारतूस में बीच के नमूने में अच्छी तरह से लोड करें।किसी भी बुलबुले को समाधान के शीर्ष पर ले जाने के लिए धीरे-धीरे कारतूस के किनारे टैप करें। कारतूस के सभी कुओं तेल लोड करने से पहले नमूना के साथ लोड किया जाना चाहिए। फिर, बाएं तेल में बूंद पीढ़ी के तेल के 70 माइक्रोलीटर अच्छी तरह से लोड करें।इसे कारतूस के सिरों पर सीमित करके गैसकेट को सुरक्षित करें, और लोडेड और इकट्ठे कारतूस को बूंद जनरेटर में रखें। जनरेटर कारतूस ठीक से रखा गया है सूचित करने के लिए एक ठोस हरी बत्ती से पता चलता है। 60 से 90 सेकंड के बाद जब जनरेटर लाइट टिमटिमाना बंद हो जाता है तो चक्र पूरा हो जाता है।अब कारतूस निकाल ें। धीरे-धीरे कारतूस से गैसकेट निकाल दें। एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग सही अच्छी तरह से 96-अच्छी पीसीआर प्लेट में नए उत्पन्न बूंदों के लगभग 40 माइक्रोलीटर को पिपेट करने के लिए करें।गर्मी एल्यूमीनियम पन्नी पीसीआर प्लेट जवानों के साथ थाली सील एक बार सभी नमूनों ९६-अच्छी तरह से प्लेट में लोड कर रहे है वाष्पीकरण को रोकने के लिए । फिर, पीसीआर रिएक्शन करने के लिए 96-अच्छी प्लेट को थर्मोसाइकिलर में लोड करें। शुरू करने के लिए, बूंद पाठक में ९६ अच्छी तरह से थाली लोड ।प्लेट को ठीक से उन्मुख करें ताकि A1 नमूना धारक से मेल खाता हो। बूंद पाठक के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर खोलें। नमूना अच्छी तरह से संपादक स्क्रीन खोलने के लिए, पहली अच्छी तरह से, A01 पर डबल क्लिक करें।प्रयोग पर क्लिक करें, और ड्रॉप-डाउन मेनू से उपयोग किए जाने वाले परख के प्रकार का चयन करें। सही डिटेक्शन विधि के रूप में QX200 ddPCR EvaGreen सुपरमिक्स का चयन करें। उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित सेटिंग्स को सभी हाइलाइट किए गए कुओं में सहेजने के लिए वेल एडिटर स्क्रीन के निचले दाहिने हाथ की ओर लागू करें।इसके बाद, वेल एडिटर स्क्रीन में टारगेट पर क्लिक करें, और नमूने के प्रकार को परिभाषित करने के लिए या तो अज्ञात, संदर्भ या नो-टेम्पलेट नियंत्रण का चयन करने के लिए लक्ष्य ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें। नमूना नाम अनुभाग में, सभी नमूनों को लेबल करें और आवेदन पर क्लिक करें। थाली पढ़ने के लिए रन पर क्लिक करें।रन ऑप्शन स्क्रीन में या तो कॉलम या पंक्तियों का चयन करें जब प्लेट को पढ़ने के लिए अभिविन्यास के बारे में सूचित करने के लिए प्रेरित किया जाता है। जानकारी की तालिका प्रदान करने के लिए व्यक्तिगत कुओं या कॉलम और पंक्ति हेडर पर डबल-क्लिक करके प्रत्येक नमूने के लिए स्वीकृत बूंदों की संख्या निर्धारित करें। डीडीट्रैप के लिए, 10, 000 या अधिक स्वीकृत बूंदों वाले नमूने आगे के विश्लेषण के लिए मान्य हैं।नमूना प्रतिकृति और एनटीसी नमूनों का प्रतिनिधित्व कुओं पर प्रकाश डाला । मैन्युअल रूप से स्क्रीन के नीचे बाईं ओर थ्रेसहोल्ड सेट करने के लिए आइकन पर क्लिक करके नमूनों के लिए सीमा निर्धारित करें। इस प्रोटोकॉल में, टेलोमेरास गतिविधि को एक सेल पैनल में मापा गया था जिसमें फेफड़ों के कैंसर और टेलोमेराज़-नकारात्मक फाइब्रोब्लास्ट की नौ सेल लाइनें शामिल थीं।SHP77, H2887, और एनटीसी के लिए सभी तीन जैविक प्रतिकृति के लिए लगभग 2, 000 फ्लोरेसेंस आयाम पर एक सीमा निर्धारित की गई थी। सकारात्मक बूंदों में 6, 000 फ्लोरेसेंस आयाम के आसपास फ्लोरेसेंस तीव्रता थी, जिसने शीर्ष पर एक स्पष्ट आबादी बनाई, और 1, 100 फ्लोरेसेंस आयाम के आसपास नकारात्मक बूंदों से अलग। सभी नमूनों के बीच प्रति सेल समकक्ष कुल टेलोमेराज़ विस्तार उत्पादों का अनुमान न्यूक्लिक एसिड की मापी गई एकाग्रता से लगाया गया था, जो फेफड़ों के कैंसर लाइनों में टेलोमेरास गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है।लाइसिस या एक्सटेंशन रिएक्शन चरणों के दौरान कोई भी आरएनईजी एंजाइमेटिक गतिविधि को नष्ट कर देगा क्योंकि यह एक राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स है। डीडीट्रैप का पालन सेल में एचटीईआरटी एमआरएनए एक्सप्रेशन लेवल पर डीडीपीसीआर के साथ किया जा सकता है। दो डेटा सेट हमें टेलोमेराज़ गतिविधि के साथ एचआरटी की अभिव्यक्ति को सहसंबंधित करने और वैकल्पिक स्प्लिसिंग जैसे संभावित टेलोमेराज़ नियामक तंत्र में गहराई से खुदाई करने की अनुमति देता है।हम विशिष्ट स्प्लिसिंग कारकों और टेलोमेराज़ गतिविधि पर उनके प्रभावों के लिए जोड़तोड़ का पता लगा सकते हैं। वर्तमान में, हम टेलोमेरेस गतिविधि को लक्षित करने वाली संभावित दवाओं के रूप में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड स्प्लिसिंग मॉड्यूलर डिजाइन कर रहे हैं।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

इन-जेल हाइब्रिडिजेशन का इस्तेमाल करते हुए टेलीमोएरे की मात्रा को बढ़ा देने के लिए संशोधित टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा विश्लेषण

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

पता करने वाली छोटी बूंद Microarrays के साथ एकल कोशिकाओं में प्रोटीन गिनती

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

चिप आधारित डिजिटल पीसीआर द्वारा ताजा जमे हुए गैस्ट्रिक कैंसर ऊतकों में एक CDH1 दुर्लभ प्रतिलिपि संस्करण का पता लगाने

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

डिजिटल पोलीमरेज़ एक छिटपुट पारिवारिक एडिनोमेटस पोलीपोसिस रोगी में आनुवंशिक भिंनता के लिए श्रृंखला प्रतिक्रिया परख चिप का उपयोग कर-a-ट्यूब प्रारूप

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

मानव फेफड़ों के ऊतकों में $W10 बातचीत प्रोटीन के इम्यूनोस्टेनिंग का डिजिटल विश्लेषण

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

रसायन चिकित्सा-प्रेरित म्यूकोसाइटिस के माउस मॉडल का उपयोग करके छोटे आंत्र चोट और अनुकूलन का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण एंडपॉइंट और प्रोliferative मार्कर

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Oncogenic जीन फ्यूजन जांच लंगर मल्टीप्लेक्स पॉलिमरेज चेन रिएक्शन का उपयोग अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा पीछा किया

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

ट्यूमर कोशिकाओं के पार्श्व पूंछ-शिरा इंजेक्शन के बाद फेफड़ों के मेटास्टेसिस का पैथोलॉजिकल विश्लेषण

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

वयस्क-प्रकार डिफ्यूजली घुसपैठ ग्लियोमा में माइक्रोएन्वायरमेंट के लक्षण वर्णन के लिए डिजिटल स्थानिक प्रोफाइलिंग

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...