Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere le fonti di finanziamento degli istituti nazionali di sanità (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Le linee di carcinoma polmonare a piccole cellule (SHP77 e H82) erano un dono generoso di DRS. John Minna e Adi Gazdar dal centro medico UT Southwestern.

1. preparazione e stoccaggio del tampone
<ol><li>Preparare 50 mL di 1x tampone di lisi RNasi-/DNase-free NP-40 Lysis (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm acido etilendiamaminetetraacetico (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerolo, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoetanolo e 0,1 mm 4- fluoruro di benzenesulfonile (AEBSF)). Questo buffer può essere aliquotato e conservato a-20 ° c per un uso futuro. Evitare cicli di congelamento/scongelamento al fine di ottenere una lisi ottimale delle cellule.</l...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

La misurazione dell'attività di telomerasi è fondamentale per una pletora di argomenti di ricerca tra cui, ma non limitati a, cancro, biologia dei telomeri, invecchiamento, medicina rigenerativa e progettazione di farmaci basati sulla struttura. Telomerasi RNP sono bassi abbondanti, anche nelle cellule tumorali, rendendo la rilevazione e lo studio di questo enzima impegnativo. In questo documento, abbiamo descritto le procedure passo-passo per il saggio ddTRAP di nuova concezione per quantificare in modo affidabile l'a...

I telomeri sono complessi di proteine del DNA dinamici alle estremità dei cromosomi lineari. I telomeri umani sono composti da una serie di ripetizioni di 5'-TTAGGGn formazione del esamerico che variano in lunghezza tra 12 – 15 chilobasi (KB) alla nascita1. La telomerasi umana, l'enzima ribonucleoproteina che mantiene i telomeri, è stato identificato per la prima volta nei lisati delle cellule di hela (linea cellulare tumorale)2. Insieme, telomeri e telomerasi giocano un ruolo importante in uno spettro di processi biologici come la protezione del genoma, la regolazione genica e l'immortalità delle cellule tumorali3,4,5,6.
La telomerasi umana è costituita principalmente da due componenti chiave, vale a dire la trascrittasi inversa telomerasi e l'RNA telomerasi (hTERT e hTERC, rispettivamente). La subunità proteica, hTERT, è la componente della trascrittasi inversa caticamente attiva dell'enzima telomerasi. Il modello di RNA, hTERC, fornisce telomerasi con il modello per estendere e/o mantenere i telomeri. La maggior parte dei tessuti somatici umani non hanno un'attività di telomerasi rilevabile. L'incapacità della DNA polimerasi di estendere la fine del filamento di DNA in ritardo, insieme alla mancanza di telomasi, porta all'accorciamento progressivo dei telomeri dopo ogni round di divisione cellulare. Questi fenomeni portano a un accorciamento dei telomeri nella maggior parte delle cellule somatiche fino a raggiungere una lunghezza criticamente abbreviata, per cui le cellule entrano in uno stato di senescenza replicativa. Il numero massimo di volte che una cellula può dividere è dettato dalla sua lunghezza telomeri e questo blocco alla divisione cellulare continua è pensato per prevenire la progressione a oncogenesi7. Le cellule tumorali sono in grado di superare la senescenza replicativa indotta da telomere e continuano a proliferare utilizzando telomerasi per mantenere i loro telomeri. Circa il 90% dei tumori attiva la telomerasi, rendendo l'attività della telomerasi di importanza critica sia nel rilevamento che nel trattamento del cancro.
Lo sviluppo del saggio TRAP negli anni novanta è stato determinante per l'identificazione dei componenti necessari dell'enzima telomerasi, nonché per la misurazione della telomerasi in una vasta gamma di cellule e tessuti, sia normali che cancerogene. Il saggio originale basato su gel PCR ha utilizzato substrati del DNA radioattivi etichettati per rilevare l'attività della telomerasi. Nel 2006, il saggio è stato adattato in forma non radioattiva utilizzando substrati con etichetta fluorescente8,9. Utilizzando substrati con etichetta fluorescente, gli utenti sono stati in grado di visualizzare i prodotti di estensione telomerasi come bande su un gel esponendolo alla lunghezza d'onda di eccitazione corretta. La sensibilità del saggio TRAP e la sua capacità di rilevare l'attività telomerasi nei lisati di cellule grezze ha reso questo saggio il metodo più diffuso per il rilevamento dell'attività telomerasi. Tuttavia, il test TRAP ha dei limiti. Il saggio è a base di gel, rendendo difficile eseguire i replicati necessari negli studi a throughput medio-alto, e quindi, una corretta analisi statistica è raramente raggiunta. Inoltre, il saggio a base di gel è difficilmente quantificabile in modo affidabile a causa dell'incapacità di rilevare meno di due differenze nell'attività di telomerasi tra i campioni. Il superamento di queste due limitazioni è fondamentale per i saggi di attività enzimatica, come il TRAP, per passare a impostazioni cliniche o industriali per il rilevamento dell'attività di telomerasi nei campioni dei pazienti o negli studi sulla progettazione di farmaci.
La PCR digitale è stata inizialmente sviluppata in 1999 come mezzo per convertire la natura esponenziale e analogica della PCR in un saggio lineare e digitale10. La PCR digitale droplet (ddPCR) è l'innovazione più recente della metodologia di PCR digitale originale. La PCR digitale droplet è arrivata con l'avvento della microfluidica avanzata e della chimica dell'emulsione olio-in-acqua per generare in modo affidabile goccioline stabili e di dimensioni uguali. A differenza della PCR (qPCR) a base di gel e persino quantitativa, la ddPCR genera una quantificazione assoluta del materiale in ingresso. La chiave per ddPCR è la generazione di ~ 20.000 reazioni individuali di partizionamento di campioni in goccioline. Dopo la PCR end-point, il lettore di gocce scansiona ogni goccia in modo simile a un citometro a flusso, contando, ridimensionando e registrando la presenza o l'assenza di fluorescenza in ogni singola goccia (cioè assenza o presenza di ampliconi PCR in ogni goccia). Quindi, utilizzando la distribuzione di Poisson, le molecole di input sono stimate in base al rapporto delle goccioline positive al numero totale di goccioline. Questo numero rappresenta una stima del numero di molecole di input in ogni PCR. Inoltre, ddPCR viene eseguita e analizzata su una piastra di 96 pozzetti che consente all'utente di eseguire molti campioni, nonché di eseguire repliche biologiche e tecniche per un'adeguata analisi statistica. Di conseguenza, abbiamo combinato la potente quantificazione e la natura a throughput moderato di ddPCR con il saggio TRAP per sviluppare il saggio ddTRAP11. Questo saggio è progettato per gli utenti di studiare e quantificare in modo robusto l'attività di telomerasi assoluta da campioni biologici11,12. La sensibilità del ddTRAP consente la quantificazione dell'attività telomerasi da campioni limitati e preziosi, comprese le misurazioni a cella singola. Inoltre, gli utenti possono anche studiare gli effetti delle manipolazioni telomerasi e/o farmaci con quantificazione assoluta di meno di due cambiamenti (~ 50% differenze). Il ddTRAP è la naturale evoluzione del saggio TRAP nella natura digitale e ad alto rendimento dei moderni esperimenti di laboratorio e delle impostazioni cliniche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

Il protocollo di amplificazione di ripetizione dei telomeri (trap) è il saggio più diffuso per rilevare l'attività telomerasi all'interno di un dato campione. Il metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) consente misurazioni robuste dell'attività enzimatica dalla maggior parte dei lisati cellulari. Il TRAP a base di gel con primer con etichetta fluorescente limita la velocità di campionamento e la capacità di rilevare le differenze nei campioni è limitata a due o più cambiamenti nell'attività enzimatica. Il goccia Digital trap, ddtrap, è un approccio altamente sensibile che è stato modificato dal tradizionale saggio TRAP, permettendo all'utente di eseguire un'analisi robusta su 96 campioni per corsa e ottenere una quantificazione assoluta del DNA (prodotti di estensione telomerasi ) all'interno di ciascuna PCR. Pertanto, il saggio ddTRAP di nuova concezione supera i limiti del tradizionale saggio TRAP basato su gel e fornisce un approccio più efficiente, accurato e quantitativo per misurare l'attività della telomerasi all'interno di contesti clinici e di laboratorio.

Utilizzando il ddTRAP, l'attività telomerasi è stata misurata in un pannello cellulare costituito dalle seguenti linee cellulari (Figura 1): carcinoma polmonare non a piccole cellule (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 e H2887), carcinoma polmonare a piccole cellule (H82 e SHP77), e telomerasi-negativo fibroblasti (BJ). 1 milione pellet di cellule sono stati lisati in NP-40 buffer, e le reazioni di estensione telomerasi sono state eseguite in triplicates biolo...

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Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Abbiamo convertito con successo il saggio di protocollo di amplificazione (TRAP) di teleomere standard per essere impiegato nelle reazioni a catena della polimerasi digitale delle gocce. Questo nuovo saggio, chiamato ddTRAP, è più sensibile e quantitativo, permettendo una migliore rilevazione e analisi statistica dell'attività telomerasi all'interno di varie cellule umane.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Il saggio ddTRAP fornisce la capacità di ottenere una misurazione sensibile, robusta e altamente quantitativa dell'attività enzimatica della telomeasi nelle cellule. La possibilità di eseguire fino a 96 campioni per corsa in modo medio-throughput ci offre un grande vantaggio. Possiamo eseguire i controlli e le repliche per una corretta analisi statistica sui dati raccolti.Immediatamente prima della lysing cellulare, scongelare un'aliquota congelata di tampone di lysis NP-40. Una volta scongelato, posizionare il tampone di lysis sul ghiaccio. Aggiungere l'inibitore della proteasi PMSF al tampone di lysis NP-40 per raggiungere una concentrazione finale di 0,2 millimolare.Quindi, aggiungere 40 microlitri del tampone di lisi al tubo contenente un pellet cellulare per raggiungere un'equivalenza cellulare di 25.000 celle per microlitro. Pipettare delicatamente il lysate su e giù per rompere le cellule. Cerca di evitare di fare bolle.Lasciare che le cellule si leghino sul ghiaccio per 30 minuti. Vortice delicatamente il lysate ogni 10 minuti per evitare la formazione di gruppi di detriti cellulari. Durante lalisi cellulare, preparare un master mix in un tubo di microcentrifugo per la reazione di estensione della telomerasi e conservare sul ghiaccio.Dopo la llisi cellulare, pipetta 48 microlitri di estensione master mix in ogni tubo PCR. Aggiungere due microlitri di lysate diluito a ciascun tubo PCR per raggiungere un'equivalenza cellulare finale di 50 celle per microlitro e continuare la reazione di estensione della telomerasi secondo il manoscritto. Preparare un mix master in un tubo di microcentrifugo per il ddTRAP e mantenerlo a temperatura ambiente.Pipettare 19,8 microlitri di master mix ddPCR in ogni tubo PCR. Aggiungere 2,2 microlitri della precedente soluzione di reazione di estensione a ciascun tubo, lasciando un volume totale di 22 microlitri. Per impostare la cartuccia di generazione delle goccioline, caricare prima 20 microlitri della soluzione preparata nel campione centrale bene nella cartuccia.Toccare delicatamente il lato della cartuccia per spostare eventuali bolle nella parte superiore della soluzione. Tutti i pozzi della cartuccia devono essere caricati con campione prima di caricare l'olio. Quindi, caricare 70 microlitri di olio di generazione di goccioline nel pozzo dell'olio sinistro.Fissare la guarnizione in posizione posizionarla alle estremità della cartuccia e posizionare la cartuccia caricata e assemblata nel generatore di goccioline. Il generatore mostra una luce verde solida per informare che la cartuccia è posizionata correttamente. Dopo 60-90 secondi, quando la luce del generatore smette di lampeggiare, il ciclo è completo.Ora rimuovi la cartuccia. Rimuovere delicatamente la guarnizione dalla cartuccia. Utilizzare una pipetta multicanale per pipettare circa 40 microlitri delle goccioline appena generate dal pozzo destro in una piastra PCR da 96 po '.Sigillare termicamente la piastra con guarnizioni della piastra PCR in alluminio una volta caricati tutti i campioni nella piastra da 96 pozzi per evitare l'evaporazione. Quindi, caricare la piastra da 96 po 'in un termociclo per eseguire la reazione PCR. Per iniziare, caricare la piastra da 96 pozzi nel lettore di goccioline.Orientare correttamente la piastra in modo che il campione A1 corrisponda a quello del supporto. Aprire il software associato al lettore di goccioline. Fare doppio clic sul primo pozzo, A01, per aprire la schermata dell'editor del pozzo di esempio.Fate clic su Esperimento (Experiment) e selezionate il tipo di saggio da utilizzare dal menu a discesa. Selezionare QX200 ddPCR EvaGreen Supermix come metodo di rilevamento corretto. Fare clic su Applica nella parte inferiore destra della schermata dell'editor di pozzi per salvare le impostazioni definite dall'utente in tutti i pozzi evidenziati.Fare quindi clic su Destinazione nella schermata dell'editor di pozzi e scegliere il menu a discesa Destinazione per selezionare un controllo sconosciuto, di riferimento o senza modello per definire il tipo di esempio. Nella sezione Nome di esempio etichettare tutti gli esempi e fare clic su Applica. Fare clic su Esegui per leggere la piastra.Selezionare Colonne o Righe nella schermata Opzioni di esecuzione quando viene richiesto di informare sull'orientamento in cui deve essere letta la piastra. Determinare il numero di goccioline accettate per ogni campione facendo doppio clic sui singoli pozzi o sulle intestazioni di colonna e riga per fornire una tabella di informazioni. Per il ddTRAP, i campioni con 10.000 o più goccioline accettate sono validi per ulteriori analisi.Evidenziare i pozzi che rappresentano le repliche di esempio e gli esempi NTC. Impostare manualmente la soglia per gli esempi facendo clic sull'icona per impostare le soglie in basso a sinistra dello schermo. In questo protocollo, l'attività delle telomerasi è stata misurata in un pannello cellulare costituito da nove linee cellulari di cancro ai polmoni e fibroblasti telomerasi-negativi.Una soglia è stata fissata a circa 2.000 ampiezza di fluorescenza per tutte e tre le repliche biologiche per SHP77, H2887 e NTC. Le goccioline positive avevano un'intensità di fluorescenza intorno a 6.000 ampiezza di fluorescenza, che formava una popolazione chiara nella parte superiore e si separava dalle goccioline negative intorno a 1.100 ampiezza di fluorescenza. I prodotti di estensione totale della telomeasi per cellula equivalente tra tutti i campioni sono stati stimati sulla base della concentrazione misurata degli acidi nucleici, che rappresenta l'attività delle telomerasi nelle linee tumorali polmonari.Qualsiasi contaminazione da RNasi durante le fasi di lisi o di reazione di estensione distruggerà l'attività enzimatica della telomeasi poiché è un complesso di ribonucleoproteina. ddTRAP può essere seguito con ddPCR sui livelli di espressione dell'mRNA hTERT nella cella. I due set di dati ci permettono di correlare l'espressione di hTERT con l'attività delle telomerasi e scavare più a fondo nei potenziali meccanismi normativi della telomerasi come lo splicing alternativo.Possiamo esplorare le manipolazioni a specifici fattori di giunzione e i loro effetti sull'attività delle telomerasi. Attualmente, stiamo progettando modulatori di splicing oligonucleotidi come potenziali farmaci mirati all'attività della telomeasi.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l&#39;ibridazione in gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Rilevamento di una variante rara trascrizione CDH1 in tessuti di cancro gastrico fresco congelato mediante PCR digitale basata su Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

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Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

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Analisi digitale dell'immunostaining delle proteine che interagiscono con la W10 nei tessuti polmonari umani

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

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Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...