Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

著者は、国立衛生研究所 (NIH) (R00 ・ CA197672 ・ 01A1) からの資金調達源を確認したいと考えています。小細胞肺癌線 (SHP77 と H82) は、ジョン・みんなと Adi Gazdar ・メディカル・センターから贈られた、寛大な贈り物でした。

1. バッファの準備と保存
<ol><li>50の1x ストック RNase-/DNase-free NP-40 溶解バッファー (10 mM トリス-HCl [pH 8.0]、1 mM MgCl2、1 mm ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)、1% [vol/VOL] NP-40、10%(vol/vol] グリセロール、150 mm NaCl、5 mm β-メルカプトエタノール、および 0.1 mm 4-benzenesulfonyl 塩酸塩 (AEBSF))。このバッファは、将来の使用のために-20 ° c で等分および保存することができます。細胞の最適な溶解を得る?...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

テロメラーゼの活動の測定は、癌、テロメア生物学、老化、再生医療、および構造ベースの薬物設計を含むが、これらに限定されない研究テーマの茄多に重要です。テロメラーゼ RNPs は、がん細胞であっても、豊富に不足しているため、この酵素の検出と研究は困難です。本論文では、新たに開発した ddTRAP アッセイについて、細胞内のテロメラーゼ活性を確実に定量化するためのステップ?...

テロメアは、線状染色体の末端にある動的な DNA-タンパク質複合体です。ヒトテロメアは、出生1で 12-15 キロベース (kb) の長さが異なる 5 '-TTAGGGn hexameric の繰り返しの配列で構成されています。ヒトテロメラーゼは、テロメアを維持する ribonucleoprotein 酵素を、HeLa 細胞溶解物 (癌細胞株)2で最初に同定した。共に、テロメアとテロメラーゼは、ゲノム保護、遺伝子調節、および癌細胞不滅性3、4、5、6などの生物学的プロセスのスペクトルにおいて主要な役割を果たしています。
ヒトテロメラーゼは主に、テロメラーゼ逆転写酵素とテロメラーゼ RNA (hTERT および hTERC) の2つの主要成分から構成されています。タンパク質サブユニットは、hTERT、テロメラーゼ酵素の触媒活性逆転写酵素成分である。RNA テンプレート、hTERC は、テロメアを拡張および/または維持するためのテンプレートをテロメラーゼに提供する。ほとんどのヒト体細胞組織は、検出可能なテロメラーゼ活性を有しない。DNA ポリメラーゼが不足している DNA の末端を広げることができないことは、テロメラーゼの欠如とともに、細胞分裂の毎ラウンド後のテロメアの漸進的短縮につながります。これらの現象は、ほとんどの体細胞において、非常に短い長さに達するまでテロメア短縮をもたらし、それによって細胞は複製老化の状態に入る。細胞が分裂できる最大回数はそのテロメア長によって決まり、このブロックはもとづき7への進行を防ぐと考えられています。がん細胞はテロメア誘発複製の老化を克服することができ、テロメラーゼを利用してテロメアを維持することによって増殖を続けています。癌の約 90% がテロメラーゼを活性化し、癌の検出と治療の両方においてテロメラーゼ活性を極めて重要なものにします。
1990年代の TRAP アッセイの開発は、テロメラーゼ酵素の必要な成分の同定、ならびに正常および癌性の両方の細胞および組織の広い範囲におけるテロメラーゼの測定に役立った。元のゲルベース PCR アッセイは、テロメラーゼの活性を検出するために放射能標識された DNA 基質を使用しました。2006では、アッセイは、蛍光標識された基材8、9を用いて非放射性形態に適応した。蛍光標識された基質を使用することにより、ユーザーは正しい励起波長に曝露することによってテロメラーゼ伸長製品をゲル上のバンドとして可視化することができました。トラップアッセイの感度と、粗細胞溶解物中のテロメラーゼ活性を検出する能力は、このアッセイをテロメラーゼ活性検出に最も広く使用されている方法にしました。しかし、TRAP アッセイには限界があります。このアッセイはゲルベースであるため、適度な高スループットの試験では必要とされる反復を行うことが困難であり、適切な統計分析はほとんど達成されません。さらに、ゲルベースのアッセイは、サンプル間のテロメラーゼ活性の2倍未満の差を検出できないため、確実に定量化することが困難である。これら2つの制限を克服することは、患者のサンプルまたは薬物設計研究におけるテロメラーゼの活性を検出するための臨床または業界の設定に移動するトラップなどの酵素活性アッセイにとって重要である。
デジタル PCR は、PCR の指数的およびアナログ的性質を線形およびデジタルアッセイ10に変換する手段として、1999年に最初に開発されました。液滴デジタル PCR (ddPCR) は、元のデジタル PCR の方法論の最新の技術革新です。液滴デジタル PCR は確実に安定した、同じ大きさの液滴を生成するために、高度なマイクロ流体と水中油エマルジョン化学の出現によって来ました。ゲルベースであっても定量 PCR (qPCR) とは異なり、ddPCR は入力材料の絶対定量を生成します。DdPCR の鍵は、サンプルを液滴に分割することによって、〜2万の個々の反応を生成することです。エンドポイント PCR に続いて、液滴読み取り装置は、フローサイトメーターのような方法で各液滴をスキャンし、カウント、サイジング、および個々の液滴における蛍光の有無 (すなわち、各液滴における PCR アンプリコンの存在または不在) を記録する。次いで、ポアソン分布を用いて、液滴の総数に対する正の液滴の比率に基づいて入力分子が推定される。この数値は、各 PCR における入力分子数の推定値を表します。さらに、ddPCR は、ユーザーが多くのサンプルを実行することを可能にし、適切な統計分析のために生物学的および技術的な複製を行うことができる96ウェルプレート上で実行され、分析します。その結果、ddPCR の強力な定量と中程度のスループットの性質をトラップアッセイと組み合わせて、ddTRAP アッセイ11を開発しました。このアッセイは、生物学的試料11,12からの絶対的なテロメラーゼ活性を研究し、確実に定量化するためにユーザが設計されています。DdTRAP の感受性は単一細胞の測定を含む限られた、貴重なサンプルからのテロメラーゼの活動の定量化を可能にする。さらに, ユーザーは、2倍未満の変化 (〜 50% の差) の絶対定量とテロメラーゼの操作および/または薬物の効果を研究することができます。DdTRAP は現代実験室の実験および臨床設定のデジタルおよびより高い効率の性質にトラップの試金の自然な進化である。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

テロメア反復増幅プロトコル (TRAP) は、所与のサンプル内のテロメラーゼ活性を検出するために最も広く使用されているアッセイです。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法は、ほとんどの細胞溶解物からの酵素活性のロバストな測定を可能にします。蛍光標識されたプライマーを用いたゲルベースのトラップはサンプルのスループットを制限し、サンプルの差を検出する能力は酵素活性の2倍以上の変化に制限される。液滴のデジタルトラップ、ddTRAP は従来のトラップの試金から変更された非常に敏感なアプローチであり、ユーザーが実行ごとの96サンプルの強い分析を行い、DNA の絶対定量化を得ることを可能にする (テロメラーゼの延長プロダクト) は、各 PCR 内で入力します。従って、新しく開発された ddTRAP の試金は従来のゲルベースのトラップの試金の限界を克服し、実験室および臨床設定内のテロメラーゼの活動を測定するためにより有効で、正確な、量的なアプローチを提供する。

DdTRAP を用いて、テロメラーゼの活性を、以下の細胞株からなる細胞パネルで測定した (図 1): nonsmall 細胞肺癌 (H2882、H1299、Calu6、H920、A549、および H2887)、小細胞肺癌 (H82 および SHP77)、およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞 (BJ)。100万細胞ペレットを NP −40バッファーで溶解し、テロメラーゼ伸長反応を生物学的 triplicates で行った。一般的で強く推?...

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Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

我々は正常に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応に採用される標準的なテロメア反復増幅プロトコル (TRAP) アッセイを変換しました。DdTRAP と呼ばれるこの新しいアッセイは、より高感度で定量的であり、様々なヒト細胞内のテロメラーゼ活性のより良い検出および統計分析を可能にします。

液滴デジタルトラップ (ddTRAP): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

ddTRAPアッセイは、細胞内のテロメラーゼ酵素活性の高感度、堅牢、高定量的測定を得る能力を提供します。中スループット方式で 1 回あたり最大 96 サンプルを実行できることで、大きな利点があります。収集されたデータに対して適切な統計分析を行うコントロールと複製を実行できます。細胞をライシングする直前に、NP-40リシスバッファーの凍結アリコートを解凍する。解凍したら、氷の上にリシスバッファーを置きます。PMSFプロテアーゼ阻害剤をNP-40リシスバッファーに加え、0.2ミリモルの最終濃度に到達します。次いで、細胞ペレットを含むチューブに40マイクロリットルのライシスバッファーを加え、1マイクロリットル当たり25,000細胞の細胞同等値に達する。細胞を開くために、ライセートを上下に軽くピペットします。泡を作らないようにしてください。細胞を氷の上で30分間氷上でライスします。細胞デブリのクラスターが形成されるのを防ぐために、10分ごとにlysateを穏やかに渦を起させます。細胞のリシスの間に、テロメラーゼ伸長反応のためのマイクロ遠心分離管でマスターミックスを準備し、氷の上に保存する。細胞のリシスの後、延長マスターのピペット48マイクロリットルが各PCRチューブに混合する。各PCRチューブに希釈したライセートを2マイクロリットル加え、1マイクロリットル当たり50細胞の最終的な細胞同等性に達し、原稿に従ってテロメラーゼ伸展反応を継続する。ddTRAP用のマイクロ遠心分離管でマスターミックスを準備し、室温に保ちます。ピペット19.8マイクロリットルのddPCRマスターは、各PCRチューブに混合します。各チューブに2.2マイクロリットルの伸張反応液を加える、 22マイクロリットルの総容積を残す。液滴生成カートリッジをセットアップするには、まず準備した溶液の20マイクロリットルをカートリッジの中のサンプルウェルに積み込みます。カートリッジの側面を軽くタップして、泡を溶液の上部に移動します。カートリッジのすべてのウェルは、オイルをロードする前にサンプルを積み込む必要があります。その後、70マイクロリットルの液滴発生油を左油によく積み込む。ガスケットをカートリッジの端にテザリングして所定の位置に固定し、装填および組み立てられたカートリッジを液滴発生器に挿入します。発電機はカートリッジが正しく置かけられていることを知らせる固体緑色のライトを示す。60~90秒後、発電機のライトが点滅を止めると、サイクルが完了します。カートリッジを取り外します。カートリッジからガスケットをそっと取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、新たに生成された液滴を右から96ウェルPCRプレートに約40マイクロリットルのピペットで送ります。すべてのサンプルを96ウェルプレートにロードすると、蒸発を防ぐために、アルミニウム箔PCRプレートシールでプレートを熱シールします。次に、96ウェルプレートをサーモサイクラーにロードして、PCR反応を行います。まず、96ウェルプレートを液滴リーダーにロードします。A1サンプルがホルダーのサンプルと一致するようにプレートを正しく向けます。ドロップレットリーダーに関連付けられているソフトウェアを開きます。最初のウェル A01 をダブルクリックして、サンプルウェルエディター画面を開きます。[実験]をクリックし、ドロップダウン メニューから使用するアッセイの種類を選択します。正しい検出方法として QX200 ddPCR エヴァグリーン スーパーミックスを選択します。ウェルエディタ画面の右下にある[適用]をクリックして、ハイライト表示されたすべてのウェルにユーザ定義設定を保存します。次に、ウェルエディタ画面で[ターゲット]をクリックし、[ターゲット]ドロップダウンメニューをクリックして、不明、参照、またはテンプレートなしのいずれかのコントロールを選択してサンプルの種類を定義します。[サンプル名]セクションで、すべてのサンプルにラベルを付け、[適用]をクリックします。[実行] をクリックしてプレートを読み上げました。プレートの読み取り方向を知らせるプロンプトが表示されたら、[実行オプション]画面で[列]または[行]を選択します。個々のウェルまたは列と行のヘッダーをダブルクリックして、情報のテーブルを提供することで、各サンプルの許容される液滴の数を決定します。ddTRAP の場合、10,000 個以上の液滴を含むサンプルは、さらなる分析に有効です。サンプル複製と NTC サンプルを表すウェルを強調表示します。画面左下のしきい値を設定するためのアイコンをクリックして、サンプルのしきい値を手動で設定します。このプロトコルでは、テロメラーゼ活性は、肺癌およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞の9つの細胞株からなる細胞パネルで測定した。SHP77、H2887、およびNTCの3つの生物学的複製すべてに対して、約2,000の蛍光振幅に閾値を設定しました。陽性液滴は、6,000の蛍光振幅の周りに蛍光強度を有し、上部に明確な集団を形成し、1,100の蛍光振幅の周りの負の液滴から分離した。全てのサンプル間の細胞当たりの全テロメラーゼ伸展産物は、肺癌株におけるテロメラーゼ活性を表す核酸の測定濃度から推定した。リソヌクレオ蛋白質複合体であるため、リシスまたは拡張反応ステップ中のRNase汚染は、テロメラーゼ酵素活性を破壊します。ddTRAPは、細胞内のhTERT mRNA発現レベルに対するddPCRをフォローアップすることができる。2つのデータセットにより、hTERTの発現をテロメラーゼ活性と相関させ、代替スプライシングなどの潜在的なテロメラーゼ調節機構を深く掘り下げることが可能になります。特定のスプライシング因子の操作とテロメラーゼ活性への影響を調べることができます。現在、テロメラーゼ活性を標的とする潜在的な薬剤としてオリゴヌクレオチドスプライシングモジュレーターを設計しています。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

In-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

ヒト肺組織におけるZW10相互作用タンパク質の免疫染色のデジタル解析

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

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