Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne erkjenne finansieringskilder fra National Institutes of Health (NIH) (NCI-r00-CA197672-01A1). Små celle lungekreft linjer (SHP77 og H82) var en generøs gave fra DRS. John Minna og Adi Gazdar fra UT Southwestern Medical Center.

1. buffer klargjøring og lagring
<ol><li>Forbered 50 mL av 1x lager RNase-/DNase-free NP-40 lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1% [Vol/Vol] NP-40, 10% [Vol/Vol] glyserol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoethanol, og 0,1 mm 4- benzenesulfonyl fluor hydrochloride (AEBSF)). Denne bufferen kan aliquoted og oppbevares ved-20 ° c for fremtidig bruk. Unngå fryse/tine sykluser for å oppnå en optimal lyse celler.</li>
	<li>Forbered 50 mL 10x lager RNase...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

Målingen av telomerase aktivitet er avgjørende for en mengde forsknings temaer, inkludert, men ikke begrenset til, kreft, telomere biologi, aldring, regenererende medisin og struktur BAS ert legemiddel design. Telomerase RNPs er lave rikelig, selv i kreftceller, noe som gjør oppdagelsen og studiet av dette enzymet utfordrende. I denne utredningen, beskrev vi trinn-for-trinn prosedyrer for den nyutviklede ddTRAP analysen til robust kvantifisere telomerase aktivitet i cellene. Ved å kombinere den tradisjonelle telomera...

Telomerer er dynamiske DNA-protein komplekser i endene av lineære kromosomer. Human telomerer er sammensatt av et utvalg av 5 '-TTAGGGn hexameric repetisjoner som varierer i lengde mellom 12-15 kilobases (KB) ved fødselen1. Human telomerase, den ribonucleoprotein enzym som opprettholder telomerer, ble først identifisert i HeLa celle lysater (kreftcelle linje)2. Sammen telomerer og telomerase spille en viktig rolle i et spekter av biologiske prosesser som Genova beskyttelse, gen regulering, og kreftcelle udødelighet3,4,5,6.
Human telomerase består hovedsakelig av to viktige komponenter, nemlig telomerase Reverse transkriptase og telomerase RNA (hTERT og hTERC, henholdsvis). Proteinet delenhet, hTERT, er katalytisk aktiv revers transkriptase komponent av telomerase enzymet. RNA-malen, hTERC, gir telomerase med malen for å utvide og/eller vedlikeholde telomerer. De fleste menneskelige somatiske vev har ingen synlig telomerase aktivitet. Manglende evne til DNA polymerase å forlenge slutten av henger strand av DNA sammen med mangelen på telomerase fører til progressiv forkortelse av telomerer etter hver runde av cellulære divisjon. Disse fenomener føre til telomere forkortelse i de fleste somatiske celler til de når en kritisk forkortet lengde, der cellene inn i en tilstand av replicative senescence. Maksimalt antall ganger en celle kan dele er diktert av sin telomere lengde og denne blokken til fortsatt celledeling antas å hindre progresjon til oncogenesis7. Kreftceller er i stand til å overvinne telomere-indusert replicative senescence og fortsette å spre ved å utnytte telomerase å opprettholde sin telomerer. Ca 90% av kreft aktivere telomerase, noe som gjør telomerase aktivitet kritisk viktig i både kreft deteksjon og behandling.
Utviklingen av TRAP-analysen på 1990-tallet var medvirkende til identifisering av de nødvendige komponentene av telomerase enzym, så vel som for måling av telomerase i et bredt spekter av celler og vev, både normal og kreft. Den opprinnelige gel-baserte PCR-analysen brukte radioaktivt merket DNA-underlag for å oppdage telomerase aktivitet. I 2006 ble analysen tilpasset en radioaktivt form ved hjelp av fluorescensmerkete merket underlag8,9. Ved å bruke fluorescensmerkete merket underlag, brukerne var i stand til å visualisere telomerase forlengelse produkter som band på en gel ved å utsette det til riktig eksitasjon bølgelengde. Følsomheten av TRAP analysen og dens evne til å oppdage telomerase aktivitet i råolje celle lysater har gjort denne analysen den mest brukte metoden for telomerase aktivitet deteksjon. Imidlertid har TRAP-analysen begrensninger. Analysen er gel-basert, noe som gjør det vanskelig å utføre de nødvendige replikerer i moderat til høy gjennomstrømming studier, og dermed riktig statistisk analyse er sjelden oppnådd. Videre er gel-basert analysen vanskelig å kvantifisere pålitelig på grunn av manglende evne til å oppdage mindre enn todelt forskjeller i telomerase aktivitet mellom prøvene. Overvinne disse to begrensningene er avgjørende for enzymatisk aktivitet analyser som TRAP å flytte til kliniske eller industri innstillinger for påvisning av telomerase aktivitet i pasientprøver eller narkotika design studier.
Digital PCR ble opprinnelig utviklet i 1999 som et middel til å konvertere den eksplosive og analoge karakteren til PCR til en lineær og digital analyse10. Dråpe Digital PCR (ddPCR) er den nyeste innovasjonen av den opprinnelige digitale PCR-metodikken. Dråpe Digital PCR kom med bruk av avansert materialer og olje-i-vann emulsjon kjemi for å pålitelig generere stabile og like store dråper. I motsetning til gel-basert og selv kvantitativ PCR (qPCR), ddPCR genererer absolutt kvantifisering av input materiale. Nøkkelen til ddPCR er generering av ~ 20 000 individuelle reaksjoner ved å partisjonere prøvene i dråper. Etter ende punkts PCR, skanner dråpe leseren hver dråpe i en Flow-flowcytometer mote, telling, dimensjonering, og registrerer tilstedeværelsen eller fraværet av fluorescens i hvert enkelt dråpe (dvs. fravær eller tilstedeværelsen av PCR-amplicons i hver dråpe). Deretter, ved hjelp av Poisson-fordelingen, anslås inn data molekyler basert på forholdet mellom positive dråper og totalt antall dråper. Dette tallet representerer et anslag over antall inn data molekyler i hver PCR. Videre er ddPCR utført og analysert på en 96-brønn plate som gjør det mulig for brukeren å kjøre mange prøver, samt utføre biologiske og tekniske replikerer for riktig statistisk analyse. Som et resultat, har vi kombinert den kraftige kvantifisering og moderat gjennomstrømming natur ddPCR med TRAP analysen å utvikle ddTRAP analysen11. Denne analysen er utformet for brukere å studere og robust kvantifisere absolutt telomerase aktivitet fra biologiske prøver11,12. Følsomheten til ddTRAP tillater kvantifisering av telomerase aktivitet fra begrensede og dyrebare prøver, inkludert enkelt celle målinger. Videre, brukernes kanne likeledes studere effektene av telomerase manipulasjoner og/eller medikamenter med absolutt kvantifisering av mindre enn todelt endre (~ 50% forskjellene). Den ddTRAP er den naturlige utviklingen av TRAP analysen i den digitale og høyere gjennomstrømming natur moderne laboratorieeksperimenter og kliniske innstillinger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

Den telomere gjenta forsterkning protokollen (TRAP) er den mest brukte analysen for å oppdage telomerase aktivitet innenfor en gitt en prøve. Den polymerase kjedere reaksjonen (PCR)-baserte metoden gjør det mulig for robuste målinger av enzym aktivitet fra de fleste celle lysater. Den gel-baserte TRAP med fluorescensmerkete merket primere begrenser sample gjennomstrømning, og evnen til å oppdage forskjeller i prøvene er begrenset til to fold eller større endringer i enzym aktivitet. Dråpe Digital TRAP, ddTRAP, er en svært følsom tilnærming som har blitt modifisert fra den tradisjonelle TRAP analysen, slik at brukeren kan utføre en robust analyse på 96 prøver per kjøre og få absolutt kvantifisering av DNA (telomerase forlengelse produkter ) inn data i hver PCR. Den nyutviklede ddTRAP-analysen overvinner derfor begrensningene til den tradisjonelle gel-baserte TRAP-analysen og gir en mer effektiv, nøyaktig og kvantitativ tilnærming til måling av telomerase aktivitet innenfor laboratorie-og kliniske miljøer.

Ved hjelp av ddTRAP ble telomerase aktivitet målt i et celle panel bestående av følgende cellelinjer (figur 1): nonsmall celle lungekreft (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 og H2887), liten celle lungekreft (H82 og SHP77), og telomerase-negativ fibroblaster (BJ). 1 000 000 celle pellets ble lysert i NP-40 buffer, og telomerase forlengelses reaksjoner ble utført i biologiske triplicates. En vanlig og sterkt anbefalt negativ kontroll er "NTC", den no-mal kont...

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Vi klarte å konvertere standard telomere gjenta forsterkning protokollen (TRAP) analysen skal benyttes i dråpe Digital polymerase kjedereaksjoner. Denne ny analysen, alarmert ddTRAP, er flere følsom og kvantitativ, tillater for bedre oppdagelsen og statistisk analyse av telomerase aktivitet innen forskjellige Human celler.

Dråpe Digital TRAP (ddTRAP): tilpasning av telomere gjenta forsterkning protokoll til dråpe Digital polymerase Kjedere reaksjon

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

DdTRAP-analysen gir muligheten til å oppnå en følsom, robust og svært kvantitativ måling av telomerase enzymatisk aktivitet i celler. Muligheten til å kjøre opp til 96 prøver per kjøring på en middels gjennomstrømning måte gir oss en stor fordel. Vi kan kjøre kontrollene og replikerer for riktig statistisk analyse av dataene som samles inn.Umiddelbart før cellelysing, tine en frossen aliquot av NP-40 lysis buffer. Når den er tint, plasser lysisbufferen på isen. Legg PMSF proteasehemmer til NP-40 lysis buffer for å nå en endelig konsentrasjon på 0,2 millimolar.Deretter legger du til 40 mikroliter av lysisbufferen til røret som inneholder en cellepellet for å nå en celleekvivalens på 25 000 celler per mikroliter. Pipette lysatet forsiktig opp og ned for å bryte opp cellene. Prøv å unngå å lage bobler.La cellene lyse på is i 30 minutter. Virvle forsiktig lysatet hvert 10. Under cellelysen, lag en hovedblanding i et mikrocentrifugerør for telomeraseforlengelsesreaksjonen, og lagre på is.Etter cellelysen blandes pipette 48 mikroliter av forlengelsesmaster i hvert PCR-rør. Tilsett to mikroliter fortynnet lysate til hvert PCR-rør for å nå en endelig celleekvivalens på 50 celler per mikroliter, og fortsett telomeraseforlengelsesreaksjonen i henhold til manuskriptet. Forbered en masterblanding i et mikrocentrifugerør for ddTRAP, og hold den ved romtemperatur.Pipette 19,8 mikroliter ddPCR master blanding i hvert PCR rør. Tilsett 2,2 mikroliter av den forrige forlengelsesreaksjonsløsningen til hvert rør, og la et totalt volum på 22 mikroliter. For å sette opp dråpegenereringskassetten, legg først 20 mikroliter av den tilberedte oppløsningen inn i den midterste prøven godt i sylinderampullen.Trykk forsiktig på siden av sylinderampullen for å flytte eventuelle bobler til toppen av oppløsningen. Alle brønner i sylinderampullen må lastes med prøve før du laster olje. Deretter laster du 70 mikroliter dråpegenereringsolje inn i venstre oljebrønn.Fest pakningen på plass ved å feste den til endene av sylinderampullen, og plasser den lastede og monterte patronen i dråpegeneratoren. Generatoren viser et solid grønt lys for å informere om at patronen er riktig plassert. Etter 60 til 90 sekunder, når generatorlampen slutter å blinke, er syklusen fullført.Ta ut patronen. Fjern pakningen forsiktig ut av sylinderampullen. Bruk en flerkanals pipette til å pipette ca. 40 mikroliter av de nylig genererte dråpene fra høyre brønn til en 96-brønns PCR-plate.Varm tetningsplaten med aluminiumsfolie PCR plate tetninger når alle prøvene er lastet i 96-brønns plate for å hindre fordampning. Deretter legger du 96-brønnsplaten i en termocycler for å utføre PCR-reaksjonen. For å begynne, legg 96-brønnplaten inn i dråpeleseren.Orienter platen riktig slik at A1-prøven stemmer overens med holderens. Åpne programvaren som er knyttet til dråpeleseren. Dobbeltklikk den første brønnen, A01, for å åpne eksempelbrønnredigeringsskjermen.Klikk på Eksperiment, og velg analysetypen som skal brukes, fra rullegardinmenyen. Velg QX200 ddPCR EvaGreen Supermix som riktig deteksjonsmetode. Klikk på Bruk nederst til høyre på brønnredigeringsskjermen for å lagre de brukerdefinerte innstillingene på alle de uthevede brønnene.Deretter klikker du på Mål i brønnredigeringsskjermen, og klikker på Mål-rullegardinmenyen for å velge enten ukjent, referanse eller ingen malkontroll for å definere typen eksempel. Merk alle eksemplene i Eksempelnavn-delen, og klikk bruk. Klikk Kjør for å lese platen.Velg enten Kolonner eller Rader i skjermbildet Kjørealternativer når du blir bedt om å informere om retningen platen skal leses i. Bestem antall godkjente dråper for hvert utvalg ved å dobbeltklikke på de enkelte brønnene eller kolonne- og radoverskriftene for å gi en informasjonstabell. For ddTRAP er prøver med 10 000 eller flere aksepterte dråper gyldige for videre analyse.Fremhev brønnene som representerer prøve replikeringer og NTC-prøver. Angi terskelen for prøvene manuelt ved å klikke på ikonet for å angi terskler nederst til venstre på skjermen. I denne protokollen ble telomeraseaktivitet målt i et cellepanel bestående av ni cellelinjer av lungekreft og telomerase-negative fibroblaster.En terskel ble satt til rundt 2000 fluorescens amplitude for alle tre biologiske repliker for SHP77, H2887, og NTC. Positive dråper hadde en fluorescens intensitet rundt 6000 fluorescens amplitude, som dannet en klar befolkning på toppen, og atskilt fra negative dråper rundt 1100 fluorescens amplitude. De totale telomeraseforlengelsesproduktene per celleekvivalenter mellom alle prøvene ble estimert fra den målte konsentrasjonen av nukleinsyrene, som representerer telomeraseaktiviteten i lungekreftlinjer.Enhver RNase forurensning under lysis eller forlengelse reaksjon trinn vil ødelegge telomerase enzymatisk aktivitet siden det er en ribonucleoprotein kompleks. ddTRAP kan følges opp med ddPCR på hTERT mRNA uttrykksnivåer i cellen. De to datasettene gjør det mulig for oss å korrelere uttrykk for hTERT med telomeraseaktivitet og grave dypere inn i potensielle telomerase regulatoriske mekanismer som alternativ spleising.Vi kan utforske manipulasjoner til spesifikke skjøtefaktorer og deres effekter på telomeraseaktivitet. For tiden designer vi oligonukleotidspleisingsmodulatorer som potensielle legemidler rettet mot telomeraseaktivitet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Modifisert Terminal Restriksjonsfragmentanalyse for kvantifisering av telomer lengde ved bruk av in-gel hybridisering

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Telle proteiner i enkeltceller med adresserbare slippverktøy Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Oppdagelsen av en CDH1 sjeldne transkripsjon Variant i fersk-frosne magekreft vev av Chip-baserte digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analyse av Immunostaining av ZW10 samspill protein i Human Lung vev

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Betydelig sluttpunkt og proliferativ markører å vurdere liten intestinal skaden og tilpasning benytter en musen modell av kjemoterapi-indusert mukositt

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Kreftfremkallende Gene Fusion Detection bruke forankret multiplex polymerase Kjedere reaksjon etterfulgt av neste generasjon sekvensering

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse av lungemetastase etter lateral hale-vene injeksjon av tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digital romlig profilering for karakterisering av mikromiljøet i voksen type diffust infiltrerende gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...