Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Os autores gostariam de reconhecer fontes de financiamento dos institutos nacionais de saúde (NIH) (NCI-r00-CA197672-01A1). As linhas de câncer de pulmão de pequenas células (SHP77 e H82) foram um presente generoso dos Drs. John Minna e Adi Gazdar do UT Southwestern Medical Center.

1. preparação e armazenamento do tampão
<ol><li>Prepare 50 ml de 1x estoque RNase-/DNase-Free NP-40 lysis buffer (10 mm Tris-HCl [pH 8,0], 1 mm MgCl1,2mm etilenodiaminotetracético ácido (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-Mercaptoetanol e 0,1 mm 4- cloridrato de fluoreto de benzenesulfonilo (AEBSF)). Este tampão pode ser aliquotado e armazenado em-20 ° c para o uso futuro. Evite ciclos de congelamento/descongelação para obter uma lise ideal das células.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

A medida da atividade da telomerase é crítica a uma pletora de tópicos da pesquisa que incluem, mas não limitado a, cancro, biologia do telomere, envelhecimento, medicina regenerativa, e projeto estrutura-baseado da droga. Telomerase RNPs são de baixa abundância, mesmo em células cancerosas, fazendo a detecção e estudo desta enzima desafiador. Neste artigo, nós descrevemos os procedimentos passo a passo para o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP para quantificar robustamente a atividade do telomerase nas...

Telômeros são complexos de proteína de DNA dinâmicos nas extremidades dos cromossomas lineares. Os telômeros humanos são compostos de uma matriz de 5 '-TTAGGGn repetições hexamérica que variam de comprimento entre 12 – 15 kilobases (KB) ao nascimento1. A telomerase humana, a enzima ribonucleoproteína que mantém os telómeros, foi identificada pela primeira vez em lisados de células HeLa (linha celular cancerosa)2. Juntos, telómeros e telomerase desempenham um papel importante em um espectro de processos biológicos, como proteção do genoma, regulação gênica e imortalidade de células cancerosas3,4,5,6.
O telomerase humano é compreendido primeiramente de dois componentes chaves, a saber o transcriptase reverso do telomerase e o RNA do telomerase (hTERT e hTERC, respectivamente). O subunit da proteína, hTERT, é o componente reverso catalètica ativo do transcriptase da enzima do telomerase. O molde do RNA, hTERC, fornece o telomerase com o molde para estender e/ou manter telômeros. A maioria dos tecidos somáticos humanos não têm atividade de telomerase detectável. A incapacidade de DNA polimerase para estender o fim da costa retardada de DNA, juntamente com a falta de telomerase leva ao encurtamento progressivo de telômeros após cada rodada de divisão celular. Estes fenômenos conduzem ao encurtamento do telomere em a maioria de pilhas somáticas até que alcancem um comprimento crìtica encurtado, por meio de que as pilhas entram em um estado da senescência replicativa. O número máximo de vezes que uma célula pode dividir é ditada pelo comprimento do telômero e este bloco para a continuação da divisão celular é pensado para prevenir a progressão para a oncogênese7. As células cancerosas são capazes de superar a senescência replicativa induzida por telômeros e continuam a proliferar utilizando a telomerase para manter seus telómeros. Aproximadamente 90% dos cânceres ativam a telomerase, tornando a atividade de telomerase extremamente importante na detecção e tratamento do câncer.
O desenvolvimento do ensaio TRAP na década de 1990 foi fundamental na identificação dos componentes necessários da enzima telomerase, bem como para a mensuração da telomerase em uma ampla gama de células e tecidos, tanto normais quanto cancerosas. O ensaio de PCR baseado em gel original utilizou substratos de DNA rotulados radioativamente para detectar atividade de telomerase. Em 2006, o ensaio foi adaptado para uma forma não radioativa usando substratos fluorescenterotulados8,9. Usando substratos fluorescente etiquetados, os usuários puderam Visualizar os produtos da extensão do telomerase como as faixas em um gel expondo o ao comprimento de onda correto da excitação. A sensibilidade do ensaio TRAP e sua capacidade de detectar atividade de telomerase em lisados de células brutas fez deste ensaio o método mais utilizado para a detecção de atividade de telomerase. No entanto, o ensaio TRAP tem limitações. O ensaio é baseado em gel, dificultando a realização das repetições necessárias em estudos de moderada a alta produtividade, e assim, a análise estatística adequada raramente é alcançada. Além disso, o ensaio baseado em gel é difícil de quantificar de forma confiável devido à incapacidade de detectar menos de duas diferenças na atividade de telomerase entre as amostras. Superar essas duas limitações é fundamental para ensaios de atividade enzimática, como o TRAP, para se deslocar para as configurações clínicas ou da indústria para a detecção de atividade de telomerase em amostras de pacientes ou estudos de projeto de drogas.
O PCR de Digitas foi desenvolvido inicialmente no 1999 como meios converter a natureza exponencial e análoga do PCR em um ensaio linear e digital10. O PCR digital do droplet (ddPCR) é a inovação a mais recente da metodologia digital original do PCR. O PCR digital da gota veio aproximadamente com o advento do microfluídica avançado e da química da emulsão do óleo-em-água para gerar confiantemente gotas estáveis e ingualmente feitas medida. Ao contrário do PCR gel-based e mesmo quantitativo (qPCR), ddPCR gera a quantificação absoluta do material da entrada. A chave para ddPCR é a geração de ~ 20.000 reações individuais por particionamento de amostras em gotas. Após o PCR do ponto final, o leitor da gota examina cada gota em um fluxo-cytometer-como a forma, contando, dimensionando, e registrando a presença ou a ausência de fluorescência em cada gota individual (isto é, ausência ou presença de amplicons do PCR em cada gota). Em seguida, usando a distribuição de Poisson, as moléculas de entrada são estimadas com base na proporção de gotas positivas para o número total de gotículas. Este número representa uma estimativa do número de moléculas de entrada em cada PCR. Além disso, o ddPCR é executado e analisado em uma placa do 96-well que permita que o usuário execute muitas amostras, assim como executa réplicas biológicas e técnicas para a análise estatística apropriada. Em conseqüência, nós combinamos a natureza poderosa da quantificação e da moderado-taxa de ddPCR com o ensaio da armadilha para desenvolver o ensaio de ddTRAP11. Este ensaio é projetado para que os usuários estudem e quantifiquem de forma robusta a atividade de telomerase absoluta a partir de amostras biológicas11,12. A sensibilidade do ddTRAP permite a quantificação da atividade de telomerase de amostras limitadas e preciosas, incluindo medições de células únicas. Além disso, os usuários também podem estudar os efeitos de manipulações de telomerase e/ou drogas com quantificação absoluta de menos de duas alterações (~ 50% de diferenças). O ddTRAP é a evolução natural do ensaio TRAP na natureza digital e de maior rendimento de experimentos laboratoriais modernos e ambientes clínicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

O protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) é o ensaio o mais extensamente usado para detectar a atividade do telomerase dentro de um dado uma amostra. A reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseou o método permite medidas robustas da atividade de enzima da maioria de lysates da pilha. A armadilha baseada em gel com primers com rótulo fluorescente limita a taxa de transferência da amostra, e a capacidade de detectar diferenças nas amostras é restrita a duas vezes ou mais alterações na atividade enzimática. A armadilha digital da gota, ddTRAP, é uma aproximação altamente sensível que seja modificada do ensaio tradicional da armadilha, permitindo que o usuário realize uma análise robusta em 96 amostras por a execução e obtenha a quantificação absoluta do ADN (produtos da extensão do telomerase ) de entrada dentro de cada PCR. Conseqüentemente, o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP supera as limitações do ensaio tradicional gel-baseado da armadilha e fornece uma aproximação mais eficiente, exata, e quantitativa para medir a atividade do telomerase dentro do laboratório e das configurações clínicas.

Usando o ddtrap, a atividade da telomerase foi medida em um painel da pilha que consiste nas seguintes linhas de pilha (Figura 1): cancro de pulmão da pilha CPNPC (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, e H2887), cancro de pulmão pequeno da pilha (H82 e SHP77), e telomerase-negativo fibroblastos (BJ). 1 milhão pelotas de células foram lisadas em tampão NP-40, e as reações de extensão de telomerase foram realizadas em triplicatos biológicos. Um controle neg...

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Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Nós convertemos com sucesso o ensaio padrão do protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) a ser empregado em reações Chain digitais do polymerase da gota. Este novo ensaio, chamado ddTRAP, é mais sensível e quantitativo, permitindo uma melhor detecção e análise estatística da atividade de telomerase dentro de várias células humanas.

ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

O ensaio ddTRAP fornece a capacidade de obter uma medição sensível, robusta e altamente quantitativa da atividade enzimática telomerase nas células. A capacidade de executar até 96 amostras por corrida em uma moda de rendimento médio nos oferece uma grande vantagem. Podemos executar os controles e réplicas para análise estatística adequada sobre os dados coletados.Imediatamente antes do lising celular, descongele uma alíquota congelada do tampão de lise NP-40. Uma vez descongelado, coloque o tampão de lise no gelo. Adicione o inibidor de protease PMSF ao tampão de lise NP-40 para atingir uma concentração final de 0,2 mililitro.Em seguida, adicione 40 microliters do tampão de lise ao tubo contendo uma pelota celular para atingir uma equivalência celular de 25.000 células por microliter. Pipeta suavemente o lise para cima e para baixo, a fim de quebrar as células. Tente evitar fazer bolhas.Deixe as células lise no gelo por 30 minutos. Vórtice suavemente o lysate a cada 10 minutos para evitar que aglomerados de detritos celulares se formem. Durante a lise celular, prepare uma mistura mestra em um tubo de microcentrifuge para a reação de extensão de telomerase, e armazene no gelo.Após a lise celular, pipetas 48 microliters de extensão mestre se misturam em cada tubo PCR. Adicione dois microliters de diluído em cada tubo PCR para alcançar uma equivalência celular final de 50 células por microliter, e continue a reação de extensão de telomerase de acordo com o manuscrito. Prepare uma mistura mestra em um tubo de microcentrifuuagem para o ddTRAP, e mantenha-o em temperatura ambiente.Pipeta 19,8 microliters de ddPCR master mix em cada tubo PCR. Adicione 2,2 microliters da solução de reação de extensão anterior a cada tubo, deixando um volume total de 22 microliters. Para configurar o cartucho de geração de gotículas, primeiro carregue 20 microliters da solução preparada para a amostra média bem no cartucho.Toque suavemente na lateral do cartucho para mover quaisquer bolhas para a parte superior da solução. Todos os poços do cartucho devem ser carregados com amostra antes do óleo de carregamento. Em seguida, carregue 70 microliters de óleo de geração de gotículas no poço de óleo esquerdo.Fixar a junta no lugar amarrando-a nas extremidades do cartucho e coloque o cartucho carregado e montado no gerador de gotículas. O gerador mostra uma luz verde sólida para informar que o cartucho está bem colocado. Após 60 a 90 segundos, quando a luz do gerador pára de piscar, o ciclo está completo.Agora remova o cartucho. Remova suavemente a junta do cartucho. Use uma pipeta multicanal para pipetar aproximadamente 40 microliters das gotículas recém-geradas do poço direito em uma placa PCR de 96 poços.Aqueça a placa com selos de placa pcr de alumínio uma vez que todas as amostras são carregadas na placa de 96 poços para evitar a evaporação. Em seguida, carregue a placa de 96 poços em um termociclador para executar a reação do PCR. Para começar, carregue a placa de 96 poços no leitor de gotículas.Oriente a placa corretamente para que a amostra A1 corresponda à do suporte. Abra o software associado ao leitor de gotas. Clique duas vezes no primeiro poço, A01, para abrir a tela do editor do poço de amostra.Clique em Experimentar e selecione o tipo de ensaio a ser usado no menu suspenso. Selecione QX200 ddPCR EvaGreen Supermix como o método de detecção correto. Clique em Aplicar no lado inferior direito da tela do editor do poço para salvar as configurações definidas pelo usuário em todos os poços destacados.Em seguida, clique em Segmentar na tela do editor do poço e clique no menu suspenso do Target para selecionar controle desconhecido, de referência ou sem modelo para definir o tipo de amostra. Na seção Nome da amostra, rotule todas as amostras e clique em Aplicar. Clique em Executar para ler a placa.Selecione colunas ou linhas na tela Opções de execução quando solicitado a informar sobre a orientação em que a placa deve ser lida. Determine o número de gotículas aceitas para cada amostra clicando duas vezes nos poços ou cabeçalhos de coluna e linha individuais para fornecer uma tabela de informações. Para o ddTRAP, amostras com gotículas aceitas de 10.000 ou mais são válidas para análise posterior.Destaque os poços que representam réplicas de amostras e amostras de NTC. Defina manualmente o limiar das amostras clicando no ícone para definir limiares no canto inferior esquerdo da tela. Neste protocolo, a atividade de telomerase foi medida em um painel celular composto por nove linhas celulares de câncer de pulmão e fibroblastos telomerase-negativos.Um limiar foi estabelecido em torno de 2.000 amplitude de fluorescência para todas as três réplicas biológicas para SHP77, H2887 e NTC. Gotículas positivas tiveram uma intensidade de fluorescência em torno de 6.000 amplitude de fluorescência, que formaram uma população clara no topo, e separadas de gotículas negativas em torno de 1.100 amplitude de fluorescência. Os produtos de extensão de telomerase totais por célula equivalente entre todas as amostras foram estimados a partir da concentração medida dos ácidos nucleicos, o que representa a atividade telomerase nas linhas de câncer de pulmão.Qualquer contaminação de RNase durante as etapas de reação de lise ou extensão destruirá a atividade enzimática telomerase, uma vez que é um complexo de ribonucleoproteína. ddTRAP pode ser acompanhado com ddPCR nos níveis de expressão mRNA hTERT na célula. Os dois conjuntos de dados nos permitem correlacionar a expressão do hTERT com a atividade de telomerase e aprofundar-se em potenciais mecanismos regulatórios de telomerase, como emendas alternativas.Podemos explorar manipulações para fatores específicos de emenda e seus efeitos sobre a atividade de telomerase. Atualmente, estamos projetando moduladores de oligonucleotídeos como potenciais medicamentos voltados para a atividade de telomerase.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Análise de fragmentos de restrição de terminal modificada para quantificar o comprimento de Telomere usando a hibridação em gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Pesquisa do câncer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

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