Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Los autores le gustaría reconocer las fuentes de financiación de los institutos nacionales de salud (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Las líneas de cáncer de pulmón de células pequeñas (SHP77 y H82) fueron un regalo generoso de los doctores John Minna y Adi Gazdar del centro médico del sudoeste de UT.

1. preparación y almacenamiento del búfer
<ol><li>Preparar 50 ml de 1x stock-/DNase-Free NP-40 lisis buffer (Tris-HCl 10 mm [pH 8,0], 1 mm MgCl2, 1 mm ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoetanol, y 0,1 mm 4- clorhidrato de fluoruro de Bencenosulfonilo (AEBSF)). Este búfer puede ser alicitado y almacenado a-20 ° c para su uso futuro. Evitar el congelamiento/descongelación de ciclos para obtener una lisis óptima de las célul...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

La medición de la actividad de la telomerasa es fundamental para una plétora de temas de investigación, incluyendo, pero no limitado a, cáncer, biología de los telómeros, envejecimiento, medicina regenerativa y diseño de fármacos basados en la estructura. Las RNP de telomerasa son muy abundantes, incluso en las células cancerosas, lo que hace que la detección y el estudio de esta enzima sean desafiantes. En este documento, describimos los procedimientos paso a paso para el nuevo ensayo ddTRAP desarrollado para ...

Los telómeros son complejos de ADN-proteína dinámicos en los extremos de los cromosomas lineales. Los telómeros humanos se componen de una serie de repeticiones hexamericas de 5 '-TTAGGGn que varían en longitud entre 12 – 15 kilobases (KB) al nacer1. La telomerasa humana, la enzima ribonucleoproteína que mantiene los telómeros, se identificó por primera vez en los lisados de las células de la Hela (línea de células cancerosas)2. Juntos, los telómeros y la telomerasa desempeñan un papel importante en un espectro de procesos biológicos como la protección del genoma, la regulación génica y la inmortalidad de las células cancerosas3,4,5,6.
La telomerasa humana se compone principalmente de dos componentes clave, a saber, la transcriptasa inversa de telomerasa y el ARN de telomerasa (hTERT y hTERC, respectivamente). La Subunidad proteica, hTERT, es el componente catalíticamente activo de la transcriptasa inversa de la enzima telomerasa. La plantilla de ARN, hTERC, proporciona telomerasa con la plantilla para extender y/o mantener los telómeros. La mayoría de los tejidos somáticos humanos no tienen actividad de telomerasa detectable. La incapacidad de ADN polimerasa para extender el final de la hebra de ADN rezagado junto con la falta de telomerasa conduce a la reducción progresiva de los telómeros después de cada ronda de división celular. Estos fenómenos conducen al acortamiento de los telómeros en la mayoría de las células somáticas hasta que alcanzan una longitud de corta duración, donde las células entran en un estado de senescencia replicativa. El número máximo de veces que una célula puede dividirse es dictado por su longitud de telómeros y este bloque a la división celular continua se piensa para prevenir la progresión a la oncogénesis7. Las células cancerosas son capaces de superar la senescencia replicativa inducida por el telómero y continúan proliferando utilizando telomerasa para mantener sus telómeros. Aproximadamente el 90% de los cánceres activan la telomerasa, lo que hace que la actividad de la telomerasa sea sumamente importante en la detección y el tratamiento del cáncer.
El desarrollo del ensayo TRAP en la década de 1990 fue instrumental en la identificación de los componentes necesarios de la enzima telomerasa, así como para la medición de la telomerasa en una amplia gama de células y tejidos, tanto normales como cancerosos. El ensayo original de PCR basado en gel utilizó sustratos de ADN etiquetados radioactivamente para detectar la actividad de la telomerasa. En 2006, el ensayo se adaptó a una forma no radioactiva utilizando sustratos con la etiqueta fluorescencia8,9. Mediante el uso de sustratos etiquetados con fluorescencia, los usuarios pudieron visualizar los productos de extensión de telomerasa como bandas en un gel exponiéndolo a la longitud de onda de excitación correcta. La sensibilidad del ensayo TRAP y su capacidad para detectar la actividad de la telomerasa en los lisados de células crudas ha hecho de este ensayo el método más ampliamente utilizado para la detección de la actividad de la telomerasa. Sin embargo, el ensayo TRAP tiene limitaciones. El ensayo está basado en gel, por lo que es difícil realizar las réplicas necesarias en estudios de moderado a alto rendimiento, y por lo tanto, rara vez se logra un análisis estadístico adecuado. Además, el ensayo basado en gel es difícil de cuantificar de forma fiable debido a la incapacidad de detectar menos de dos diferencias en la actividad de la telomerasa entre las muestras. La superación de estas dos limitaciones es fundamental para que los ensayos de actividad enzimática, como el TRAP, se trasladen a la configuración clínica o de la industria para detectar la actividad de la telomerasa en muestras de pacientes o en estudios de diseño de fármacos.
La PCR digital se desarrolló inicialmente en 1999 como un medio para convertir la naturaleza exponencial y analógica de la PCR en un ensayo lineal y digital10. La PCR digital por gota (ddPCR) es la innovación más reciente de la metodología de PCR digital original. La PCR digital por gota surgió con la llegada de microfluidos avanzados y química de emulsión de aceite en agua para generar de forma fiable gotas estables e igualmente de tamaño. A diferencia de la PCR a base de gel e incluso cuantitativa (qPCR), la ddPCR genera una cuantificación absoluta del material de entrada. La clave de ddPCR es la generación de ~ 20.000 reacciones individuales mediante la partición de muestras en gotas. Después de la PCR de punto final, el lector de gotas escanea cada gota en una forma similar al CITOMETRO-flujo, contando, dimensionando y registrando la presencia o ausencia de fluorescencia en cada gota individual (es decir, ausencia o presencia de los amplicones PCR en cada gota). Luego, utilizando la distribución de Poisson, las moléculas de entrada se estiman en base a la relación de gotas positivas con el número total de gotas. Este número representa una estimación del número de moléculas de entrada en cada PCR. Además, la ddPCR se realiza y se analiza en una placa de pozo de 96 que permite al usuario ejecutar muchas muestras, así como realizar réplicas biológicas y técnicas para un análisis estadístico adecuado. Como resultado, hemos combinado la potente cuantificación y la naturaleza de rendimiento moderado de ddPCR con el ensayo TRAP para desarrollar el ensayo ddTRAP11. Este ensayo está diseñado para que los usuarios estudien y cuantifiquen enérgicamente la actividad de la telomerasa absoluta a partir de las muestras biológicas11,12. La sensibilidad del ddTRAP permite la cuantificación de la actividad de la telomerasa a partir de muestras limitadas y preciosas, incluyendo mediciones de una sola célula. Además, los usuarios también pueden estudiar los efectos de las manipulaciones de telomerasa y/o fármacos con cuantificación absoluta de menos de dos cambios (~ 50% diferencias). El ddTRAP es la evolución natural del ensayo TRAP en la naturaleza digital y de mayor rendimiento de los experimentos de laboratorio modernos y los entornos clínicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

El protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) es el ensayo más ampliamente utilizado para detectar la actividad de la telomerasa dentro de una muestra determinada. El método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite mediciones robustas de la actividad enzimática de la mayoría de los lisatos celulares. El TRAP basado en gel con imprimadores con etiquetas fluorescentemente limita el rendimiento de la muestra, y la capacidad de detectar diferencias en las muestras está restringida a dos pliegues o mayores cambios en la actividad enzimática. El TRAP digital de gota, ddTRAP, es un enfoque altamente sensible que ha sido modificado a partir del ensayo TRAP tradicional, permitiendo al usuario realizar un análisis robusto en 96 muestras por corrida y obtener la cuantificación absoluta de los productos de DNA (extensión de telomerasa ) dentro de cada PCR. Por lo tanto, el ensayo ddTRAP recientemente desarrollado supera las limitaciones del ensayo TRAP tradicional basado en gel y proporciona un enfoque más eficiente, preciso y cuantitativo para medir la actividad de la telomerasa en entornos clínicos y de laboratorio.

Usando el ddTRAP, la actividad de telomerasa se midió en un panel celular que consta de las siguientes líneas celulares (figura 1): cáncer de pulmón de células no pequeñas (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 y H2887), cáncer de pulmón de células pequeñas (H82 y SHP77) y telomerasa negativa fibroblastos (BJ). 1 millón pellets de células fueron lisados en tampón NP-40, y las reacciones de extensión de telomerasa se realizaron en triplicados biológic...

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Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Hemos convertido con éxito el ensayo estándar de protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) que se empleara en las reacciones de la cadena de polimerasa digital de gotas. Este nuevo ensayo, llamado ddTRAP, es más sensible y cuantitativo, lo que permite una mejor detección y análisis estadístico de la actividad de la telomerasa dentro de varias células humanas.

TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

El ensayo ddTRAP proporciona la capacidad de obtener una medición sensible, robusta y altamente cuantitativa de la actividad enzimática de la telomerasa en las células. La capacidad de ejecutar hasta 96 muestras por ejecución de forma mediana nos ofrece una gran ventaja. Podemos ejecutar los controles y réplicas para un análisis estadístico adecuado de los datos recopilados.Inmediatamente antes de la eleje de la célula, descongele una alícuota congelada del búfer de lelisis NP-40. Una vez descongelado, coloque el tampón de lelisis sobre hielo. Añadir inhibidor de la proteasa de PMSF al tampón de la lelisis NP-40 para alcanzar una concentración final de 0,2 milimolares.Luego, agregue 40 microlitros del tampón de lysis al tubo que contiene un pellet celular para alcanzar una equivalencia celular de 25.000 células por microlitro. Pipetee suavemente el izado hacia arriba y hacia abajo para romper las celdas. Trate de evitar hacer burbujas.Deje que las células se licen sobre hielo durante 30 minutos. A vórtice suavemente el licate cada 10 minutos para evitar que se formen racimos de desechos celulares. Durante la lelisis celular, prepare una mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga para la reacción de extensión de la telomerasa y guárdelo en hielo.Después de la lelisis celular, pipeta 48 microlitros de extensión master se mezclan en cada tubo PCR. Añadir dos microlitros de izado diluido a cada tubo pcR para alcanzar una equivalencia celular final de 50 células por microlitro, y continuar la reacción de extensión de la telomerasa según el manuscrito. Prepare una mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga para el ddTRAP y manténgalo a temperatura ambiente.Pipetear 19,8 microlitros de ddPCR mezcla maestra en cada tubo PCR. Añadir 2,2 microlitros de la solución de reacción de extensión anterior a cada tubo, dejando un volumen total de 22 microlitros. Para configurar el cartucho de generación de gotas, primero cargue 20 microlitros de la solución preparada en el pozo de muestras centrales en el cartucho.Toque suavemente el lado del cartucho para mover cualquier burbuja a la parte superior de la solución. Todos los pozos del cartucho deben cargarse con muestra antes de cargar el aceite. A continuación, cargue 70 microlitros de aceite de generación de gotas en el pozo de aceite izquierdo.Fije la junta en su lugar atándola a los extremos del cartucho y coloque el cartucho cargado y montado en el generador de gotas. El generador muestra una luz verde sólida para informar que el cartucho se coloca correctamente. Después de 60 a 90 segundos, cuando la luz del generador deja de parpadear, el ciclo se completa.Ahora retire el cartucho. Retire suavemente la junta del cartucho. Utilice una pipeta multicanal para pipetear aproximadamente 40 microlitros de las gotas recién generadas desde el pozo derecho en una placa PCR de 96 pozos.Selle la placa con sellos de placa PCR de papel de aluminio una vez que todas las muestras se cargan en la placa de 96 pocillos para evitar la evaporación. A continuación, cargue la placa de 96 pozos en un termociclador para realizar la reacción PCR. Para empezar, cargue la placa de 96 pozos en el lector de gotas.Oriente la placa correctamente para que la muestra A1 coincida con la del soporte. Abra el software asociado con el lector de gotas. Haga doble clic en el primer pozo, A01, para abrir la pantalla del editor de pozos de muestra.Haga clic en Experimento y seleccione el tipo de ensayo que se utilizará en el menú desplegable. Seleccione QX200 ddPCR EvaGreen Supermix como el método de detección correcto. Haga clic en Aplicar en la parte inferior derecha de la pantalla del editor de pozos para guardar la configuración definida por el usuario en todos los pozos resaltados.A continuación, haga clic en Destino en la pantalla del editor de pozos y haga clic en el menú desplegable Destino para seleccionar el control desconocido, de referencia o sin plantilla para definir el tipo de muestra. En la sección Nombre de ejemplo, etiquete todos los ejemplos y haga clic en Aplicar. Haga clic en Ejecutar para leer la placa.Seleccione Columnas o Filas en la pantalla Opciones de ejecución cuando se le solicite informar sobre la orientación en la que se debe leer la placa. Determine el número de gotas aceptadas para cada muestra haciendo doble clic en los pozos individuales o encabezados de columna y fila para proporcionar una tabla de información. Para el ddTRAP, las muestras con 10.000 o más gotas aceptadas son válidas para su posterior análisis.Resalte los pozos que representan réplicas de muestra y muestras de NTC. Establezca manualmente el umbral para las muestras haciendo clic en el icono para establecer umbrales en la parte inferior izquierda de la pantalla. En este protocolo, la actividad de la telomerasa se midió en un panel celular compuesto por nueve líneas celulares de cáncer de pulmón y fibroblastos negativos de telomerasa.Se estableció un umbral en alrededor de 2.000 de amplitud de fluorescencia para las tres réplicas biológicas para SHP77, H2887 y NTC. Las gotas positivas tenían una intensidad de fluorescencia alrededor de 6.000 de amplitud de fluorescencia, que formaban una población clara en la parte superior, y se separaban de las gotas negativas alrededor de 1.100 amplitudes de fluorescencia. Los productos de extensión total de telomerasa por equivalente celular entre todas las muestras se estimaron a partir de la concentración medida de los ácidos nucleicos, lo que representa la actividad de la telomerasa en las líneas de cáncer de pulmón.Cualquier contaminación por ARNase durante los pasos de la lesis o de la reacción de extensión destruirá la actividad enzimática de la telomerasa, ya que es un complejo ribonucleoproteína. ddTRAP se puede seguir con ddPCR en los niveles de expresión de hTERT mRNA en la célula. Los dos conjuntos de datos nos permiten correlacionar la expresión de hTERT con la actividad de la telomerasa y profundizar en posibles mecanismos reguladores de la telomerasa, como el empalme alternativo.Podemos explorar las manipulaciones a factores de empalme específicos y sus efectos en la actividad de la telomerasa. Actualmente, estamos diseñando moduladores de empalme de oligonucleótidos como fármacos potenciales dirigidos a la actividad telomerasa.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital de la reacción en cadena de polimerasa para la variación genética en un paciente de la poliposis adenomatosa familiar esporádico con el formato de Chip en tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Análisis digital de inmunomanchado de ZW10 Interacción de proteínas en tejidos pulmonares humanos

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

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Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

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Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

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Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...