Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Författarna skulle vilja erkänna finansiering källor från de nationella instituten för hälsa (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Små cell lung cancer linjer (SHP77 och H82) var en generös gåva från DRS. John Minna och ADI Gazdar från UT Southwestern Medical Center.

1. förberedelse och förvaring av buffert
<ol><li>Bered 50 mL 1x lager RNase-/DNase-fri NP-40-lyseringsbuffert (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1mm etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 1% [Vol/Vol] NP-40, 10% [Vol/Vol] glycerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-merkaptoetanol och 0,1 mm 4- benzensulfonylfluorid hydroklorid (AEBSF)). Denna buffert kan vara Ali citerad och lagras vid-20 ° c för framtida bruk. Undvik frys/Tina cykler för att få en optimal Lys av celler.</li>
	<li>Förbered 50 mL 10x lager RNase-/D...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

Mätningen av telomeras aktivitet är kritisk till en uppsjö av forsknings ämnen inklusive, men inte begränsat till, cancer, telomerbiologi, åldrande, regenerativ medicin, och strukturbaserad läkemedels design. Telomerase RNPs är låg riklig, även i cancer celler, vilket gör upptäckten och studiet av detta enzym utmanande. I detta dokument beskrev vi steg-för-steg-procedurer för den nyutvecklade ddTRAP-analysen för att kraftfullt kvantifiera telomerasaktiviteten i cellerna. Genom att kombinera den traditionel...

Telomerer är dynamiska DNA-proteinkomplex i ändarna av linjära kromosomer. Humana telomerer består av en matris av 5 '-TTAGGGn hexameric repetitioner som varierar i längd mellan 12-15 kilobases (KB) vid födseln1. Human telomeras, det ribonukleoprotein-enzym som upprätthåller telomererna, identifierades först i HeLa celllysat (cancer cellinjen)2. Tillsammans spelar telomerer och telomeras en viktig roll i ett spektrum av biologiska processer såsom genomskydd, gen reglering och cancer cells odödlighet3,4,5,6.
Human telomeras består huvudsakligen av två viktiga komponenter, nämligen telomeras omvänt transkriptas och telomeras RNA (hTERT respektive hTERC). Proteinet subunit, hTERT, är katalytiskt aktiv omvänt transkriptase komponenten i telomeras enzymet. RNA-mallen, hTERC, ger telomeras med mallen för att utvidga och/eller underhålla telomerer. De flesta humana somatiska vävnader har ingen detekterbar telomerasaktivitet. Oförmågan hos DNA-polymeras att förlänga slutet av den släpar strängen av DNA tillsammans med avsaknaden av telomeras leder till en progressiv förkortning av telomerer efter varje runda av cellulära Division. Dessa fenomen leder till telomerförkortning i de flesta somatiska celler tills de når en kritiskt förkortad längd, varvid cellerna kommer in i ett tillstånd av replikativ senescens. Det maximala antalet gånger en cell kan dela styrs av dess telomerlängd och detta block till fortsatt cell delning tros förhindra progression till onkogenes7. Cancer celler kan övervinna telomer-inducerad replikativ senescens och fortsätta att förökar sig genom att använda telomeras att bibehålla sina telomerer. Cirka 90% av cancer aktivera telomeras, vilket gör telomeras aktivitet kritiskt viktigt i både cancer upptäckt och behandling.
Utvecklingen av TRAP-analysen på 1990-talet bidrog till identifieringen av de nödvändiga komponenterna i telomerasenzymet, liksom för mätning av telomeras i ett brett spektrum av celler och vävnader, både normala och cancerösa. Den ursprungliga gel-baserade PCR-test som används radioaktivt märkt DNA-substrat för att upptäcka telomeras aktivitet. I 2006, var analysen anpassas till en icke-radioaktiv form med fluorescensmarkerade märkta substrat8,9. Genom att använda fluorescensmarkerade märkt substrat, användare kunde visualisera telomeras förlängningen produkter som band på en gel genom att utsätta den för rätt excitation våglängd. Känsligheten hos trap-analysen och dess förmåga att detektera telomerasaktivitet i råa celllysater har gjort detta test till den mest använda metoden för att upptäcka telomeras-aktiviteter. TRAP-analysen har dock begränsningar. Analysen är gel-baserad, vilket gör det svårt att utföra de nödvändiga replikaten i måttlig till hög genom strömning studier, och därför är korrekt statistisk analys sällan uppnås. Dessutom är den gelbaserade analysen svår att kvantifiera på grund av oförmågan att upptäcka mindre än dubbla skillnader i telomerasaktivitet mellan proverna. Att övervinna dessa två begränsningar är avgörande för enzymatiska aktivitet analyser såsom trap att flytta till kliniska eller industri inställningar för detektion av telomeras aktivitet i patientprover eller studier läkemedels design.
Digital PCR utvecklades initialt i 1999 som ett sätt att omvandla den exponentiella och analoga karaktären av PCR till en linjär och digital analys10. Droplet Digital PCR (ddPCR) är den senaste innovationen av den ursprungliga digitala PCR-metodiken. Droplet Digital PCR kom omkring med tillkomsten av avancerade mikrofluidik och olja-i-vatten emulsion kemi för att tillförlitligt generera stabila och lika stora droppar. Till skillnad från gelbaserad och även kvantitativ PCR (qPCR) genererar ddPCR absolut kvantifiering av indatamaterialet. Nyckeln till ddPCR är att generera ~ 20 000 individuella reaktioner genom att partitionera proverna i droppar. Efter punkt PCR skannar DROPP läsaren varje droppe i en flödescytometerliknande mode, räknar, dimensionering och registrerar närvaron eller frånvaron av fluorescens i varje enskild droppe (dvs. frånvaro eller förekomst av PCR-amplikoner i varje droplet). Sedan, med Poissons fördelning, beräknas ingångs molekylerna utifrån förhållandet mellan positiva droppar och det totala antalet droppar. Detta tal representerar en uppskattning av antalet ingångs molekyler i varje PCR. Dessutom är ddPCR utförs och analyseras på en 96-brunn platta som gör det möjligt för användaren att köra många prover, samt utföra biologiska och tekniska replikat för ordentlig statistisk analys. Som ett resultat har vi kombinerat den kraftfulla kvantifiering och måttlig-genomflöde karaktär ddPCR med TRAP-analysen för att utveckla ddTRAP-analysen11. Denna analys är utformad för användare att studera och kraftfullt kvantifiera absolut telomeras aktivitet från biologiska prover11,12. Känsligheten hos ddTRAP gör det möjligt att kvantifiera telomerasaktiviteten från begränsade och värdefulla prover, inklusive encellig mätning. Dessutom, användare kan också studera effekterna av telomeras manipulationer och/eller droger med absolut kvantifiering av mindre än två förändringar (~ 50% skillnader). Den ddTRAP är den naturliga utvecklingen av TRAP-analysen i den digitala och högre genom strömning karaktär moderna laboratorie experiment och kliniska inställningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

Den telomer upprepa amplifiering protokoll (trap) är den mest använda analysen för att upptäcka telomeras aktivitet inom ett givet ett prov. Polymeras kedje reaktion (PCR)-baserad metod möjliggör robusta mätningar av enzym aktivitet från de flesta celllysater. Den gel-baserade trap med fluorescensmarkerade märkt primers begränsar prov genom strömning, och förmågan att upptäcka skillnader i prover är begränsad till två gånger eller större förändringar i enzym aktivitet. Droplet Digital TRAP, ddTRAP, är ett mycket känsligt tillvägagångs sätt som har modifierats från den traditionella TRAP-analysen, vilket gör det möjligt för användaren att utföra en robust analys på 96 prover per körning och få absolut kvantifiering av DNA (Telomerase extension produkter ) inom varje PCR-ingång. Därför övervinner den nyutvecklade ddTRAP-analysen begränsningarna hos den traditionella gel-baserade TRAP-analysen och ger en mer effektiv, noggrann och kvantitativ metod för att mäta telomerasaktiviteten inom laboratorie-och kliniska miljöer.

Med hjälp av ddTRAP mättes telomerasaktiviteten i en cell panel bestående av följande cellinjer (figur 1): Icke-småcellig lung cancer (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 och H2887), småcellig lung cancer (H82 och SHP77) och telomeras-negativa fibroblaster (BJ). 1 000 000 cell pellets lyserades i NP-40 buffert, och telomeras förlängning reaktioner utfördes i biologiska triplicates. En vanlig och starkt rekommenderad negativ kontroll är "NTC", ingen mall...

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Vi konverterade framgångs rikt standarden telomer upprepa amplifiering protokoll (trap) assay som skall användas i droplet Digital polymeras kedje reaktioner. Denna nya analys, som kallas ddtrap, är känsligare och kvantitativa, vilket möjliggör bättre detektion och statistisk analys av telomeras aktivitet inom olika mänskliga celler.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): anpassning av telomere upprepa amplifiering protokoll till droplet Digital polymerase kedje reaktion

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

DDTRAP-analysen ger möjlighet att erhålla en känslig, robust och mycket kvantitativ mätning av telomeras enzymatisk aktivitet i celler. Möjligheten att köra upp till 96 prover per körning i en medelhög genomströmning mode erbjuder oss en stor fördel. Vi kan köra kontrollerna och replikat för korrekt statistisk analys på de insamlade uppgifterna.Omedelbart före celllysering, tina en fryst alikvot av NP-40 lysbuffert. När du tinat, placera lysbufferten på is. Lägg till PMSF proteashämmare till NP-40 lysbufferten för att nå en slutlig koncentration på 0,2 millimolar.Lägg sedan till 40 mikroliter av lysbufferten till röret som innehåller en cellpellets för att nå en cellekvivalens på 25, 000 celler per mikroliter. Försiktigt pipettera lysate upp och ner för att bryta upp cellerna. Försök att undvika att göra bubblor.Låt cellerna att lysa på is i 30 minuter. Virvel försiktigt lysate var 10 minuter för att förhindra kluster av cell skräp bildas. Under cellen lys, förbereda en master mix i en mikrocentrifug röret för telomeras förlängning reaktion, och lagra på is.Efter cellen lysis, pipett 48 mikroliter av förlängning master blanda in i varje PCR-rör. Tillsätt två mikroliter av utspädd lysate till varje PCR-rör för att nå en slutlig cellekvivalens på 50 celler per mikroliter, och fortsätt telomerasförlängningsreaktionen enligt manuskriptet. Förbered en master mix i ett mikrocentrifugrör för ddTRAP, och håll den i rumstemperatur.Pipett 19,8 mikroliter av ddPCR master mix i varje PCR-rör. Lägg till 2,2 mikroliter av den tidigare utvidgningsreaktionslösningen till varje rör, vilket ger en total volym på 22 mikroliter. För att ställa in droppet generation patronen, först ladda 20 mikroliter av den beredda lösningen i mitten prov väl i patronen.Knacka försiktigt på sidan av patronen för att flytta eventuella bubblor till toppen av lösningen. Cylinderampullens alla brunnar måste vara laddade med prov före lastning av olja. Sedan, ladda 70 mikroliter av droppe generation olja i vänster olja väl.Säkra packningen på plats genom att tjudra den till patronens ändar, och placera den laddade och hopmonterade patronen i droppgeneratorn. Generatorn visar en fast grön lampa för att informera patronen är placerad ordentligt. Efter 60 till 90 sekunder, när generatorlampan slutar blinka, är cykeln klar.Ta nu bort patronen. Ta försiktigt bort packningen från patronen. Använd en flerkanalig pipett för att pipettera cirka 40 mikroliter av de nygenererade dropparna från höger långt in i en 96-väl PCR-platta.Värm täta plattan med aluminiumfolie PCR-plattan tätningar när alla prover är laddade i 96-brunnsplattan för att förhindra avdunstning. Sedan, ladda 96-väl plattan i en thermocycler att utföra PCR reaktion. Till att börja, ladda 96-brunns plattan i droppläsaren.Orientera plattan ordentligt så att A1-provet stämmer överens med hållarens. Öppna programvaran som är associerad med droplet-läsaren. Dubbelklicka på den första brunnen, A01, för att öppna skärmen för provväldigitor.Klicka på Experiment och välj vilken typ av analys som ska användas på den nedrullningsbara menyn. Välj QX200 ddPCR EvaGreen Supermix som rätt identifieringsmetod. Klicka på Använd i den nedre högra sidan av brunnsredigerarskärmen för att spara de användardefinierade inställningarna till alla de markerade brunnarna.Klicka därefter på Mål i brunnsredigerarens skärm och klicka på mål-rullgardinsmenyn för att välja antingen okänd, referens eller ingen mallkontroll för att definiera typ av prov. I avsnittet Exempelnamn märker du alla exemplen och klickar på Använd. Klicka på Kör om du vill läsa plattan.Välj antingen Kolumner eller Rader i skärmen Kör alternativ när du uppmanas att informera om orienteringen plattan ska läsas i. Bestäm antalet accepterade droppar för varje prov genom att dubbelklicka på de enskilda brunnarna eller kolumn- och radrubrikerna för att tillhandahålla en tabell med information. För ddTRAP gäller prover med 10, 000 eller fler accepterade droppar för vidare analys.Markera brunnarna som representerar provreplikat och NTC-prover. Ställ in tröskel för proverna manuellt genom att klicka på ikonen för inställning av tröskelvärden längst ned till vänster på skärmen. I detta protokoll mättes telomerasaktivitet i en cellpanel bestående av nio cellinjer av lungcancer och telomerasnegativa fibroblaster.En tröskel sattes till omkring 2, 000 fluorescence amplitud för alla tre biologiska replikat för SHP77, H2887 och NTC. Positiva droppar hade en fluorescensintensitet runt 6, 000 fluorescens amplitud, som bildade en tydlig befolkning på toppen, och separat från negativa droppar runt 1, 100 fluorescence amplitud. De totala telomerasförlängningsprodukterna per cellekvivalent mellan alla proverna uppskattades från den uppmätta koncentrationen av nukleinsyrorna, som representerar telomerasaktiviteten i lungcancerlinjer.Någon RNase kontaminering under lysis eller förlängning reaktionsstegen kommer att förstöra telomeras enzymatisk aktivitet eftersom det är ett ribonukleoprotein komplex. ddTRAP kan följas upp med ddPCR på hTERT mRNA-uttrycksnivåer i cellen. De två datamängderna gör det möjligt för oss att korrelera uttryck av hTERT med telomerasaktivitet och gräva djupare i potentiella telomerasregleringsmekanismer såsom alternativ splitsning.Vi kan utforska manipulationer till specifika splitsningsfaktorer och deras effekter på telomerasaktivitet. För närvarande är vi utforma oligonukleotide splitsar modulatorer som potentiella läkemedel som riktar telomeras aktivitet.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Modifierad terminalbegränsningsfragmentanalys för kvantifiering av telomerlängd med användning av in-gel-hybridisering

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Räknar protein i enstaka celler med adresserbara Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Upptäckt av en CDH1 sällsynta avskrift Variant i färskfryst magsäckscancer vävnader av Chip-baserade digitala PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitala polymeras Chain Reaction Assay för den genetiska variationen i en sporadisk familjär adenomatös polypos Patient med formatet Chip-i-ett-rör

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analys av immunofärgning av ZW10 interagerande protein i mänskliga lung vävnader

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Viktiga endpoints och proliferativa markörer för att bedöma liten tarm skada och anpassning med hjälp av en musmodell av kemoterapi-inducerad mukosit

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Onkogen Gene fusion detektion med förankrade multiplex Polymerase kedjereaktion följt av nästa generations sekvensering

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analys av lungmetastasering efter lateral svansveninjektion av tumörceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Digital rumslig profilering för karakterisering av mikromiljön i vuxentyp som diffust infiltrerar gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...