Name: droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Yazarlar Sağlık Ulusal Enstitüleri (NıH) (CCI-R00-CA197672-01A1) fon kaynaklarını kabul etmek istiyorum. Küçük hücreli akciğer kanseri hatları (SHP77 ve H82), UT Southwestern Tıp Merkezi 'nden DRS. John Minna ve adi Gazdar 'dan cömert bir hediyeydi.

1. tampon hazırlama ve depolama
<ol><li>Hazırlamak 50 mL 1x stok RNase-/DNase-ücretsiz NP-40 liziz tampon (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm ethylenediaminetetraasetic ASIT (EDTA), 1% [Vol/Vol] NP-40, 10% [Vol/Vol] gliserol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoetanol, ve 0,1 mm 4- benzenesulfonil fluorid hidroklorür (AEBSF)). Bu tampon, gelecekteki kullanım için-20 °C ' de saklanır. Hücrelerin optimum liziz elde etmek için dondurmak/çözülme döngüleri kaçının.</li>
	<li>Hazırlamak 50 mL 10...

<ol>
	<li>Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+telomere+sequence+loss+in+human+leukocytes+varies+with+age.">The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).</li><li>Morin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+telomere+terminal+transferase+enzyme+is+a+ribonucleoprotein+that+synthesizes+TTAGGG+repeats.">The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.</a> Cell. 59 (3), 521-529 (1989).</li><li>de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+telomeres+solve+the+end-protection+problem.">How telomeres solve the end-protection problem.</a> Science. 326 (5955), 948-952 (2009).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+telomeres+and+telomerase+in+cancer.">Role of telomeres and telomerase in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).</li><li>Kim, W., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+telomere+regulation+of+gene+expression:+Telomere+looping+and+telomere+position+effect+over+long+distances+(TPE-OLD).">Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD).</a> Differentiation. 99, 1-9 (2018).</li><li>Robin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+position+effect:+regulation+of+gene+expression+with+progressive+telomere+shortening+over+long+distances.">Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances.</a> Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).</li><li>Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+immortalization:+role+of+telomeres+and+telomerase.">Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase.</a> Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).</li><li>Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+human+telomerase+activity.">Enhanced detection of human telomerase activity.</a> DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).</li><li>Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonradioactive+detection+of+telomerase+activity+using+the+telomeric+repeat+amplification+protocol.">Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).</li><li>Huang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maintenance+of+Telomere+Length+in+CD28++T+Cells+During+T+Lymphocyte+Stimulation.">The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).</li><li>Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddTRAP:+A+Method+for+Sensitive+and+Precise+Quantification+of+Telomerase+Activity.">ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity.</a> Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).</li></ol>

Telomeraz aktivitesinin ölçümü, kanser, telomer biyolojisi, yaşlanma, rejeneratif tıp ve yapı bazlı ilaç tasarımı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, araştırma konularının bir bolluk için önemlidir. Telomeraz RNPs düşük bol, kanser hücrelerinde bile, algılama ve bu enzim zorlu çalışma yapma. Bu yazıda, yeni geliştirilen ddTRAP tahlili için adım adım prosedürleri, hücrelerde telomeraz aktivitesini sağlam bir şekilde ölçmek için tarif ettik. Geleneksel telomeraz uzatma reaks...

Telomerler Doğrusal kromozomların ucunda Dinamik DNA-protein kompleksler. İnsan telomerleri bir dizi oluşur 5 '-TTAGGGn hexameric tekrarlar arasında uzunluğu değişmektedir 12 – 15 kiloüsler (KB) Doğum1. İnsan telomeraz, telomerleri tutan Ribonükleoprotein enzim, ilk hela hücresi endoglikozidazları (kanser hücresi hattı)2tespit edildi. Birlikte, telomerler ve telomeraz genom koruması, gen düzenlemesi ve kanser hücresi ölümsüzlüğü3,4,5,6gibi biyolojik süreçlerin bir spektrumunda önemli bir rol oynamaktadır.
İnsan telomeraz öncelikle iki anahtar bileşenden oluşur, yani telomeraz ters transkriptaz ve telomeraz RNA (hTERT ve hterc, sırasıyla). Protein subunit, hTERT, telomeraz enziminin katalytik olarak aktif ters transcriptaz bileşenidir. RNA şablonu olan hTERC, telomerleri uzatmak ve/veya sürdürmek için şablonla telomeraz sağlar. Çoğu insan somatik dokularda algılanamayan telomeraz aktivitesi vardır. DNA polimeraz, telomeraz eksikliği ile birlikte DNA 'nın gecikme ipliğinin sonunu uzatmak için yetersizlik hücresel bölme her turda sonra telomerlerin ilerici kısaltma yol açar. Bu olayların en somatik hücrelerde kısaltılması telomer neden onlar bir kritik kısaltılmış uzunluğa ulaşıncaya kadar, bu nedenle hücreler çoğaltarak bir devlet girin. Bir hücrenin bölünebilir maksimum sayısı onun telomer uzunluğu tarafından dikte edilir ve bu blok devam hücre bölünmesi için onkatıltı ilerlemesi önlemek için düşünülmektedir7. Kanser hücreleri telomer kaynaklı çoğaltıcı yaşlanma aşmak ve telomerler korumak için telomeraz kullanarak Proliferasyona devam edebiliyoruz. Kanserlerin yaklaşık% 90 ' i telomeraz etkinleþtirmek, hem kanser tespiti hem de tedavisinde telomeraz aktivitesini eleştirel olarak önemli hale getirmektedir.
1990 ' lardaki TRAP tahlili 'nin geliştirilmesi, telomeraz enziminin gerekli bileşenlerinin tanımlanması ve hem normal hem de kanserli geniş bir hücre ve dokularda telomeraz ölçümü için de yararlı oldu. Orijinal jel tabanlı PCR tahlil telomeraz etkinliğini algılamak için radyoaktif etiketli DNA substratlar kullandı. 2006 yılında, tahlil floresan etiketli substratlar kullanarak radyoaktif olmayan bir forma adapte edildi8,9. Floresan etiketli substratlar kullanarak, kullanıcılar doğru uyarılma dalga boyu açığa tarafından bir jel bantları olarak telomeraz uzatma ürünleri görselleştirmek başardık. Trap tahlil ve ham hücre endoglikozidazları içinde telomeraz etkinliğini algılamak için yeteneğini hassasiyeti bu tahlil telomeraz aktivite algılama için en yaygın kullanılan yöntemi yaptı. Ancak, TRAP tahlil sınırlamaları vardır. Tahlil jel tabanlı, zor orta yüksek verimlilik çalışmaları için gerekli çoğaltır gerçekleştirmek için yapma, ve böylece, uygun istatistiksel analiz nadiren elde edilir. Ayrıca, jel bazlı tahlil, numuneler arasında telomeraz aktivitesinde iki kat farklılıkları daha az tespit edilememesi nedeniyle güvenilir bir şekilde ölçmek zordur. Bu iki sınırlamaların üstesinden gelmek, hasta örneklerinde veya ilaç tasarım çalışmalarında telomeraz aktivitesinin algılanması için klinik veya endüstri ayarlarına geçmek için TRAP gibi enzimatik aktivite açısından önemlidir.
Dijital PCR başlangıçta bir doğrusal ve dijital tahlil10içine PCR üstel ve analog doğası dönüştürmek için bir araç olarak 1999 yılında geliştirilmiştir. Droplet dijital PCR (ddPCR) orijinal dijital PCR metodolojisi en son yenilik. Damlacık dijital PCR, güvenilir ve eşit boyutta damlacıklar oluşturmak için gelişmiş mikrofluidikler ve yağ-in-su emülsiyon Kimya gelişiyle ilgili olarak geldi. Jel bazlı ve hatta nicel PCR (qPCR) ' den farklı olarak, ddPCR giriş malzemesinin mutlak ölçülmesini üretir. DdPCR anahtarı nesil olduğunu ~ 20.000 bireysel reaksiyonlar örnekleri damlacıklar bölümleme tarafından. Son nokta PCR aşağıdaki, damlacık okuyucu her damlacık bir akış-cytometer benzeri moda, sayma, boyutlandırma, ve (yani, yok veya her damlalar içinde PCR amplikonlar varlığı) floresans varlığı veya yokluğu kayıt tarar. Sonra, Poisson dağıtımı kullanarak, giriş molekülleri damlacıklar toplam sayısına pozitif damlacıklar oranına göre tahmin edilir. Bu sayı, her PCR 'de giriş moleküllerinin sayısını tahmin eder. Ayrıca, ddPCR, kullanıcının birçok numuneyi çalıştırmasına izin veren ve uygun istatistiksel analizler için biyolojik ve teknik çoğaltır gerçekleştiren bir 96-Well plaka üzerinde gerçekleştirilir ve analiz edilir. Sonuç olarak, biz ddtrap tahlil11geliştirmek için tuzak tahlil ile ddpcr güçlü kantifikasyon ve orta verim doğası kombine ettik. Bu tahlil, kullanıcıların biyolojik örneklerden mutlak telomeraz etkinliğini incelemek ve sağlamlaştırmak için tasarlanmıştır11,12. DdTRAP hassasiyeti, tek hücreli ölçümler dahil olmak üzere sınırlı ve değerli örneklerden telomeraz aktivitesinin ölçülmesini sağlar. Ayrıca, kullanıcılar aynı zamanda telomeraz manipülasyonları ve/veya ilaçlar (~ 50% farklılıklar) iki kat değişikliklerden daha az mutlak kantifikasyon etkileri araştırabilirsiniz. DdTRAP modern laboratuar deneyleri ve klinik ayarları dijital ve daha yüksek verim doğası içine TRAP tahlil doğal evriminin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td>RnAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfact- Amps NP-40</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ultrapure Glycerol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15514011</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>516732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free H20</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM dNTP mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R72501</td>
			<td>2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9640G</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EGTA pH 8.0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td>RNAse/DNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACX (Revers) Primer</td>
			<td>Integrated DNA Technology (IDT)</td>
			<td>Custom Primer (HPLC Purified)</td>
			<td>5&#39;- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin walled (250 ul) PCR grade tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>strips, plates, tubes etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twin-Tec 96 Well Plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Eppendorf 951020362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piercable foil heat seal</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator cartidges (DG8)</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet generator gasket</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermocycler T100</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1864001 and 1864003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

droplet digital trap (ddtrap): adaptation of the telomere repeat amplification protocol to droplet digital polymerase chain reaction

Telomer tekrar amplifikasyon Protokolü (TRAP), verilen bir örnek içinde telomeraz etkinliğini algılamak için en yaygın olarak kullanılan tahlil olduğunu. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı yöntem en hücre Lysates enzim aktivitesinin sağlam ölçümleri için izin verir. Floresan etiketli astar ile jel tabanlı TRAP örnek verimi sınırlar ve numuneler farklılıkları tespit yeteneği enzim aktivitesinde iki kat veya daha büyük değişiklikler ile sınırlıdır. Damlacık dijital tuzak, ddtrap, geleneksel Trap tahlil değiştirilmiş bir son derece hassas bir yaklaşımdır, kullanıcının çalıştırmak başına 96 örnekleri üzerinde sağlam bir analiz yapmak ve DNA mutlak kantifikasyon elde sağlayan (telomeraz uzatma ürünleri ) her PCR içinde giriş. Bu nedenle, yeni geliştirilen ddTRAP tahlil geleneksel jel tabanlı TRAP tahlil sınırlamaları üstesinden gelir ve laboratuar ve klinik ayarları içinde telomeraz etkinliğini ölçmek için daha verimli, doğru ve nicel bir yaklaşım sağlar.

DdTRAP kullanarak, telomeraz aktivite aşağıdaki hücre hatları oluşan bir hücre panelinde ölçüldü (Şekil 1): küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, ve H2887), küçük hücreli akciğer kanseri (H82 ve SHP77), ve telomeraz-negatif fibroblastlar (BJ). 1.000.000 hücre granül NP-40 tampon içinde lysed ve telomeraz uzatma reaksiyonları biyolojik triplicates yapılmıştır. Ortak ve son derece önerilen negatif...

Watch this Scientific Journal Video about Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Biz başarıyla standart telomer tekrar amplifikasyon Protokolü (Trap) tahlil damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonları istihdam edilecek dönüştürülür. Bu yeni tahlil, ddTRAP denilen, daha hassas ve niceliksel, daha iyi algılama ve çeşitli insan hücreleri içinde telomeraz aktivite istatistiksel analiz için izin.

Damlacık dijital tuzak (ddTRAP): telomere tekrar amplifikasyon protokolünün droplet dijital polimeraz zincir reaksiyonuna adaptasyon

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

DdTRAP analizi, hücrelerdeki telomeraz enzimatik aktivitesinin hassas, sağlam ve yüksek nicel ölçümlerini elde etme olanağı sağlar. Orta iş yapma lı bir modada her çalışan için 96 örneğe kadar çalışma yeteneği bize büyük bir avantaj sunuyor. Toplanan veriler üzerinde uygun istatistiksel analiz için kontrolleri ve kopyaları çalıştırabiliriz.Hücre lising hemen önce, NP-40 lysis tampon dondurulmuş bir aliquot çözültün. Çözüldükten sonra, buz üzerinde lysis tampon yerleştirin. 0.2 milimolar nihai konsantrasyonulaşmak için NP-40 lysis tampon PMSF proteaz inhibitörü ekleyin.Daha sonra, mikrolitre başına 25.000 hücre denkliği ulaşmak için bir hücre pelet içeren tüp için lysis tampon 40 mikrolitre ekleyin. Hücreleri açmak için yavaşça yukarı ve aşağı lysate pipet. Kabarcıklar yapmaktan kaçınmaya çalışın.Hücrelerin 30 dakika boyunca buzüzerinde lyse izin verin. Hücre enkaz kümelerinin oluşmasını önlemek için her 10 dakikada bir lysate'yi yavaşça girdaplayın. Hücre lisis sırasında, telomeraz uzatma reaksiyonu için bir mikrosantrifüj tüp bir ana karışımı hazırlamak ve buz üzerinde saklayın.Hücre lisisinden sonra, her PCR tüpüne 48 mikrolitre uzatma ana sıcalığı karıştırılır. Her PCR tüpüne iki mikrolitre seyreltilmiş lysate ekleyerek mikrolitre başına 50 hücreden oluşan son hücre eşdeğerliğine ulaşın ve el yazmasına göre telomeraz uzatma reaksiyonuna devam edin. DdTRAP için mikrosantrifüj tüp bir ana karışımı hazırlayın ve oda sıcaklığında tutun.Pipet 19.8 mikrolitre ddPCR ana karışımı her PCR tüpüne. Her tüpe önceki uzatma reaksiyonçözeltisinin 2,2 mikrolitresini ekleyerek toplam 22 mikrolitre hacim bırakarak. Damlacık üretim kartuşunu kurmak için, hazırlanan çözeltinin 20 mikrolitresini kartuştaki orta numuneye yükleyin.Herhangi bir kabarcıkları çözeltinin üstüne taşımak için kartuşun yan tarafına hafifçe dokunun. Kartuşun tüm kuyuları yağ yüklemeden önce numune ile yüklenmelidir. Daha sonra, sol yağ kuyusu içine damlacık üretimi yağ 70 mikrolitre yükleyin.Contayı kartuşun ucuna bağlayarak yerinde sabitle ve dolu ve monte edilmiş kartuşun damlatıcı jeneratörüne yerleştirin. Jeneratör kartuş düzgün yerleştirilir bilgilendirmek için katı bir yeşil ışık gösterir. 60 ila 90 saniye sonra, jeneratör ışığı yanıp sönmeyi durdurduğunda, döngü tamamlanır.Şimdi kartuşunu çıkarın. Contayı kartuştan yavaşça çıkarın. 96 kuyulu bir PCR plaka içine sağ kuyudan yeni üretilen damlacıkların yaklaşık 40 mikrolitre pipet için çok kanallı pipet kullanın.Buharlaşmayı önlemek için tüm numuneler 96 kuyulu plakaya yüklendikten sonra plakayı alüminyum folyo PCR plaka mühürleriyle ısıtın. Daha sonra, PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için 96-iyi plakayı bir termocycler'a yükleyin. Başlamak için, 96-kuyu plaka damlacık okuyucu içine yükleyin.Plakayı, A1 örneğinin tutucununkiyle eşleşin şekilde düzgün bir şekilde yönlendirin. Damlacık okuyucuyla ilişkili yazılımı açın. Örnek iyi editör ekranını açmak için ilk kuyu olan A01'e çift tıklayın.Deneme'yi tıklatın ve açılır menüden kullanılacak deneme türünü seçin. Doğru algılama yöntemi olarak QX200 ddPCR EvaGreen Supermix'i seçin. Kullanıcı tanımlı ayarları vurgulanan tüm kuyulara kaydetmek için kuyu düzenleyicisi ekranının sağ alt tarafında Uygula'yı tıklatın.Ardından, kuyu düzenleyicisi ekranında Hedef'e tıklayın ve örnek türünü tanımlamak için bilinmeyen, başvuru veya şablonsuz denetimi seçmek için Hedef açılır menüsünü tıklatın. Örnek Ad bölümünde, tüm örnekleri etiketleyin ve Uygula'yı tıklatın. Plakayı okumak için Çalıştır'ı tıklatın.Plakanın okunması gereken yönlendirme hakkında bilgi almak istendiğinde Çalışma Seçenekleri ekranındaki Sütunlar veya Satırlar'ı seçin. Bir bilgi tablosu sağlamak için tek tek kuyulara veya sütuna ve satır üstbilgilerine çift tıklayarak her örnek için kabul edilen damlacıkların sayısını belirleyin. ddTRAP için, 10, 000 veya daha fazla kabul görmüş damlacıklı numuneler daha fazla analiz için geçerlidir.Örnek kopyalarını ve NTC örneklerini temsil eden kuyuları vurgulayın. Ekranın sol alt kısmındaki eşikleri ayarlamak için simgeye tıklayarak örneklerin eşiğini el ile ayarlayın. Bu protokolde telomeraz aktivitesi dokuz hücre hattından oluşan bir hücre panelinde akciğer kanseri ve telomeraz-negatif fibroblastlardan oluşan bir hücre panelinde ölçüldü.SHP77, H2887 ve NTC için her üç biyolojik kopya için de yaklaşık 2.000 floresan genliği olarak bir eşik belirlenmiştir. Pozitif damlacıkların floresan yoğunluğu 6.000 civarında, üstte net bir popülasyon oluşturmuş ve 1,100 floresan genliği civarındaki negatif damlacıklardan ayrıdır. Tüm numuneler arasındaki hücre eşdeğeri başına toplam telomeraz uzatma ürünleri, akciğer kanseri hatlarındaki telomeraz aktivitesini temsil eden nükleik asitlerin ölçülen konsantrasyonundan tahmin edilebilmektedir.Lysis veya uzatma reaksiyonu sırasında herhangi bir RNase kontaminasyonu ribonükleoprotein kompleksi olduğu için telomeraz enzimatik aktivitesini yok edecektir. ddTRAP hücredeki hTERT mRNA ekspresyon düzeylerinde ddPCR ile takip edilebilir. İki veri seti, hTERT'nin ekspresyonunu telomeraz aktivitesi ile ilişkilendirmemize ve alternatif birleştirme gibi potansiyel telomeraz düzenleyici mekanizmaları daha derinlemesine araştırmamıza olanak tanır.Belirli birleştirme faktörlerinin manipülasyonlarını ve bunların telomeraz aktivitesi üzerindeki etkilerini inceleyebiliriz. Şu anda telomeraz aktivitesini hedefleyen potansiyel ilaçlar olarak oligonükleotid birleştirme modülatörleri tasarlıyoruz.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Insan akciğer dokularında ZW10 etkileşim protein Immünoster dijital Analizi

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Kemoterapiye bağlı Mukozinin fare modelini kullanarak küçük bağırsak yaralanmasını ve uyarlamasını değerlendirmek için önemli uç noktalar ve proliferatif Işaretçiler

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak Onkojenik gen füzyon tespiti

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...