Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et førende initiativ for fremragende unge forskere (LEADER, nr. 16812285) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) i Japan, et tilskud-i-støtte til unge videnskabsmænd forskning (no. 18K18157, 16K21034) fra Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) til M.M., og tilskuds-in-Aid fra MEXT til K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).

1. klargøring af GVs indeholdende bakterieceller ved droplet overførselsmetoden
<ol><li>Forbered lipid stamopløsninger af 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholin (POPC, 10 mM, 1 mL) og 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[biotinyl (polyethylenglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) i chloroform/ methanol-opløsning (2/1, v/v), og opbevar bestanden ved-20 °C.</li>
	<li>Fremstilling af en olie opløsning indeholdende lipid
	<ol>
<li>20 μL af POPC-opløsningen og 4 μL af b...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Her beskriver vi en metode til dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau i GVs. Denne enkle metode indebærer at danne GVS indeholdende bakterieceller på enkelt celleniveau ved hjælp af dråbe overførselsmetoden. Sammenlignet med andre tilgange til opnåelse af GVs indeholdende bakterieceller, denne metode har to fordele: (i) det er let at udvikle, og (II) en lille mængde (2 μL) af prøven opløsning er nødvendig for at forberede GVs. Dråbe overførings metoden20 til klargøring af ...

Kulturen af bakterieceller på enkelt celleniveau har fået stigende opmærksomhed. Dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau inde i et lukket rum kan belyse bakterielle funktioner som fænotypiske variabilitet1,2,3,4, celle adfærd5, 6 , 7 , 8 , 9og antibiotikaresistens10,11. På grund af de seneste fremskridt inden for kultur teknikker, kan kulturen af enkelte bakterier opnås inde i et lukket rum, såsom i en brønd-chip4,7,8, gel dråbe12,13 og vand-i-olie (W/O) dråbe5,11. For at fremme forståelsen eller udnyttelsen af enkelte bakterieceller er der behov for yderligere tekniske udviklinger af dyrkningsteknikker.
Vesikler, der efterligner den biologiske celle membran er sfæriske rum bestående af amphifilic molekyler og kan holde forskellige materialer. Vesikler klassificeres efter størrelse og omfatter små vesikler (SVs, diameter < 100 nm), store vesikler (LVs, < 1 μm) og gigantiske vesikler (GVs, > 1 μm). SVs eller LVs er almindeligt anvendt som lægemiddelbærere på grund af deres affinitet til den biologiske celle membran14. GVs er også blevet brugt som et reaktor system til opførelse af protoceller15 eller kunstige celler16. Indkapsling af biologiske celler i GVS er blevet rapporteret17,18, og dermed GVS viser potentiale som et cellekultursystem, når det kombineres med reaktor systemet.
Her, sammen med en video af eksperimentelle procedurer, vi beskriver, hvordan GVs kan bruges som nye celle-kultur fartøjer19. GVS indeholdende bakterier blev lavet af dråbe Transfer metode20 og blev derefter immobiliseret på en understøttet membran på et cover glas. Vi brugte dette system til at observere bakterievækst på enkelt celleniveau inde i GVs i realtid.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

Vi udviklede en metode til dyrkning af bakterieceller på enkelt celleniveau inde i gigantiske vesikler (GVs). Bakteriel cellekultur er vigtigt for at forstå funktionen af bakterieceller i det naturlige miljø. På grund af teknologiske fremskridt kan forskellige bakteriecelle funktioner afsløres på enkelt celleniveau inde i et lukket rum. GVS er sfæriske mikro-størrelse rum består af amfifile lipid molekyler og kan holde forskellige materialer, herunder celler. I dette studie blev en enkelt bakteriecelle indkapslet i 10 – 30 μm GVS ved dråbe overførselsmetoden, og GVS indeholdende bakterieceller blev immobiliseret på en understøttet membran på et glas substrat. Vores metode er nyttig til at observere real-time vækst af enkelte bakterier inde i GVs. Vi dyrkede Escherichia coli (E. coli) celler som en model inde i GVS, men denne metode kan tilpasses andre celletyper. Vores metode kan anvendes inden for videnskab og industri inden for mikrobiologi, biologi, bioteknologi og syntetisk biologi.

Vi præsenterer en simpel metode til generering af GVS indeholdende enkelte bakterieceller ved hjælp af dråbe overførselsmetoden (figur 1). Figur 1a viser et skematisk billede af udfældningen af GVS indeholdende bakterier. W/O dråber indeholdende bakterier overføres på tværs af olie-vand (lipid monolayer) grænseflade ved centrifugering til at danne GVs. Forskellen i tæthed mellem saccharose (indre vandig opløsning) og ...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Bakteriecelle kultur på enkelt celleniveau inde i gigantiske vesikler

Vi demonstrerer en enkelt cellekultur af bakterier inde i gigantiske vesikler (GVs). GVS indeholdende bakterieceller blev fremstillet ved dråbe overførselsmetoden og blev immobiliseret på en understøttet membran på et glas substrat for direkte observation af bakterievækst. Denne fremgangsmåde kan også tilpasses andre celler.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Denne protokol giver et middel til dyrkning af bakterieceller på encellet niveau inde i gigantiske vesikler. Det er nemt at udvikle de gigantiske vesikler, og kun en meget lille mængde prøveløsning er nødvendig for at forberede vesiklerne. Demonstration af proceduren vil være Yuri Ota, en ph.d.-kandidat fra vores laboratorium.Begynd med at tilføje 20 mikroliter frisklavet POPC-opløsning og fire mikroliter frisklavet biotin-PEG-DSPE-opløsning til et glashætteglas. Fordamp det organiske opløsningsmiddel ved luftstrøm, indtil der dannes en lipidfilm. Placer filmen i en ekssiccator i en time for helt at fordampe det organiske opløsningsmiddel.Derefter tilsættes 200 mikroliter mineralsk olie til hætteglasset. Dæk åbningen af hætteglasset med plast paraffin film, og sonikere hætteglasset indhold i et ultralydbad på 120 watt i mindst en time. For en lille vesicle forberedelse, skabe en lipid film, som netop vist, og tilsæt 200 mikroliter af 200 millimeter glukose i LB medium til filmen.Derefter sonikere filmen på 120 watt i mindst en time, efterfulgt af ekstrudering af den resulterende gigantiske vesikler i små vesikler ved hjælp af en mini ekstruder og en polycarbonat membran med en 100-nanometer pore størrelse. For bakteriecelleforkultur skal E.coli vaccineres fra en LB-plade til milliliter LB-medium for en overnatningskultur ved 37 grader Celsius. Næste morgen overføres 20 mikroliter af kulturens supernatant til 1,98 milliliter frisk LB-medium for yderligere to timers kultur.Ved inkubationens afslutning kontrolleres den optiske massetæthed ved 600 nanometer eller OD 600-værdien af prækulturopløsningen på et spektrofotometer. Der skal anvendes en forkulturløsning med en OD 600 på 1 til 1,5. Bland derefter forkulturløsningen med frisklavet saccharoseopløsning og frisk LB-medium, ifølge tabel et.For kæmpe vesicle dannelse, tilsæt 50 mikroliter af en frisklavet ydre vandig opløsning af gigantiske vesikler til en 1,5 milliliter låg plastrør. Forsigtigt lag 150 mikroliter af lipid-holdige olieopløsning over den ydre vandige opløsning af gigantiske vesikler. Den resulterende opløsning inkuberes i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur, før det kontrolleres, at olie- og vandopløsningernes grænseflade er flad.For vand- og oliebakterielle celle, der indeholder dråbedannelse, tilsættes to mikroliter af en frisklavet indre vandig opløsning af gigantiske vesikler til 50 mikroliter af den sonikerede lipidholdige olieopløsning i et 0,6 milliliterpaltede plastrør. Bank derefter på røret for at emulgere de to komponenter. Dernæst skal du bruge en pipette til at tilføje 50 mikroliter vand og olie dråbe opløsning til grænsefladen af olie og vandig opløsning, og sediment den bakterielle celle-holdige gigantiske vesikler ved centrifugering.Derefter aspirere det øverste olielag og indsamle de gigantiske vesikler. For at forberede et håndlavet kammer, bore en syv-millimeter hul med en hul punch på en 10 med 10 med en millimeter dobbelt-faced forsegling, derefter indsætte dobbelt-faced forsegling på en 30 af 40 millimeter dække glas. For at forberede en understøttet tolagsmembran tilsættes 30 mikroliter af den lille vesicleopløsning til hullet i det håndlavede kammer.Inkuber vesiklerne ved stuetemperatur i 30 minutter. Ved slutningen af inkubationen vaskes hullet forsigtigt to gange med 20 mikroliter LB-medium suppleret med 200 millimillerglukose. At immobilisere gigantiske vesikler på supporter bi-lag membran, indføre 10 mikroliter af neutravidin i ydre vandige gigantiske vesicle løsning på hullet for en 15 minutters inkubation ved stuetemperatur.Ved slutningen af inkubationen, forsigtigt vaske hullet to gange med 20 mikroliter LB medium, suppleret med 200 millimiller glukose, og tilsæt hele mængden af gigantiske vesicle opløsning til hullet i kammeret. Derefter forsegle hullet med en 18 af 18 millimeter dækglas. For at overvåge bakterievæksten i de gigantiske vesikler skal du vælge 40X-målet på et omvendt mikroskop og placere kammeret på mikroskopvarmesystemet.Derefter inkubere den bakterielle celle-holdige gigantiske vesikler i kammeret under statiske forhold i seks timer ved 37 grader Celsius, indfange og optage billeder af den bakterielle cellevækst hver 30 minutter, med den videnskabelige komplementære metaloxid halvleder kamera. Giant vesicles indeholder bakterieceller typisk varierer i størrelse fra 10 til 30 mikrometer. For begge størrelser af gigantiske vesikler gennemgår E.coli-cellerne forlængelses- og divisionsprocesser, hvor nogle E.coli-celler vokser til et meget stort antal celler i løbet af den seks timer lange observationsperiode.Den relative hyppighed af gigantiske vesikler, der indeholder et enkelt celleniveau, er ca. 10% af de opnåede gigantiske vesikler, og de gigantiske vesikler indkapslet ved enkeltcelleniveau er ca. 50% af de gigantiske vesikler, der indeholder bakterieceller. Stabiliteten af olie-vand interface er vigtigt for at opnå gigantiske vesikler, der indeholder bakterieceller. Pas på at aspirere olien omhyggeligt, før den gigantiske vesicle korrektion.Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man kultur bakterieceller på enkelt celle niveau inden for de enkelte gigantiske vesikler. Vores bakteriekultur metode er et nyt værktøj i mikrobiologi til dyrkning ukendte miljømæssige bakterier til at opnå eller analysere deres metaboliske produkter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Formering af<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Vurdering bakteriel invasion af hjerteceller i kultur og hjerte kolonisering i inficerede mus ved hjælp af Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation og Multi-fænotypisk High-indhold Screening af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Udvikling og Identifikation af en roman underpopulation af human neutrofil-afledte Giant fagocytter<em&gt; In vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Kvantificering af intracellulære vækst inde makrofager er en holdbar og pålidelig metode til vurdering af virulens i Leishmania parasitter

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Ved hjælp af en bakteriel patogen til sonden for cellulære og organismens-niveau vært svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolering af enkelt intracellulære bakterielle samfund genereret fra en Murine Model af urinvejsinfektion for Downstream encellede analyse

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høj overførselshastighed Shigella-specifikke bakteriedræbende Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Elektrofysiologiske optagelser af enkelt celle Ionstrømme under veldefinerede forskydnings belastninger

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...