Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een toonaangevend initiatief voor uitstekende jonge onderzoekers (LEADER, No. 16812285) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan, een subsidie-in-Aid voor onderzoek jonge wetenschappers (nr. 18K18157, 16K21034) van Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) tot M.M., en subsidie-in-Aid van MEXT naar K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).

1. bereiding van Gv's die bacteriële cellen bevatten door middel van de overdrachtsmethode druppel
<ol><li>Bereid lipide stamoplossingen van 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) en 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleenglycol)-2000] (Biotine-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in chloroform/ methanoloplossing (2/1, v/v) en bewaar de kolf bij-20 °C.</li>
	<li>Bereiding van een lipide-bevattende olie oplossing
	<ol>
<li>Giet 20 μL van de POPC-oplossin...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Hier beschrijven we een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen GVs. Deze eenvoudige methode omvat het vormen van gv's met bacteriële cellen op het eencellige niveau door gebruik te maken van de druppel overdrachtsmethode. Vergeleken met andere benaderingen voor het verkrijgen van Gv's die bacteriële cellen bevatten, heeft deze methode twee voordelen: (i) het is gemakkelijk te ontwikkelen en (II) een klein volume (2 μL) van de monsteroplossing is nodig om de GVs te bereiden. De d...

De cultuur van bacteriële cellen op het eencellige niveau heeft steeds meer aandacht gekregen. Het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau in een besloten ruimte kan een verheldende werking van bacteriële functies zoals fenotypische variabiliteit1,2,3,4, Celgedrag5, 6 , 7 , 8 , 9, en antibioticaresistentie10,11. Door de recente ontwikkelingen in cultuur technieken kan de cultuur van enkele bacteriën worden bereikt in een besloten ruimte, zoals in een goed-chip4,7,8, gel druppel12,13 en water-in-olie (W/O) druppel5,11. Om het begrip of gebruik van enkele bacteriële cellen te bevorderen, zijn verdere technische ontwikkelingen van teelttechnieken nodig.
Blaasjes die de biologische celmembraan nabootsen zijn sferische compartimenten bestaande uit amfifiele moleculen en kunnen verschillende materialen vasthouden. Blaasjes zijn geclassificeerd op grootte en omvatten kleine blaasjes (SVs, diameter < 100 nm), grote blaasjes (LVs, < 1 μm), en reuzen blaasjes (GVs, > 1 μm). SVs of Lv's worden vaak gebruikt als medicijn dragers vanwege hun affiniteit met het biologische celmembraan14. Gv's zijn ook gebruikt als een reactor systeem voor de bouw van protocellen15 of kunstmatige cellen16. Inkaping van biologische cellen in GVS is gemeld17,18, en dus GVS tonen potentieel als een celkweek systeem in combinatie met het reactor systeem.
Hier beschrijven we samen met een video van experimentele procedures hoe Gv's kunnen worden gebruikt als nieuwe celkweek schepen19. Gv's met bacteriën werden gemaakt door de druppel overdrachtsmethode20 en werden vervolgens geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een afdekglas. We gebruikten dit systeem om bacteriële groei op het eencellige niveau binnen GVs in real-time te observeren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

We ontwikkelden een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen gigantische blaasjes (GVS). Bacteriële celcultuur is belangrijk voor het begrijpen van de functie van bacteriële cellen in de natuurlijke omgeving. Vanwege de technologische vooruitgang kunnen verschillende bacteriële celfuncties op het eencellige niveau in een besloten ruimte worden onthuld. Gv's zijn sferische micro-sized compartimenten samengesteld uit amfifiele lipide moleculen en kan verschillende materialen, met inbegrip van cellen houden. In deze studie werd een enkele bacteriële cel ingekapseld in 10 – 30 μm GVs door de druppel overdrachtmethode en werden de Gv's die bacteriële cellen bevatten geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat. Onze methode is nuttig voor het observeren van de real-time groei van enkele bacteriën binnen GVs. We gekweekte Escherichia coli (E. coli) cellen als een model binnen GVS, maar deze methode kan worden aangepast aan andere celtypen. Onze methode kan worden gebruikt in de wetenschap en industriële gebieden van microbiologie, biologie, biotechnologie, en synthetische biologie.

We presenteren een eenvoudige methode voor het genereren van GVs met enkele bacteriële cellen met behulp van de druppel methode (Figuur 1). Figuur 1a toont een schematisch beeld van de neerslag van GVS die bacteriën bevatten. W/O druppels met bacteriën worden overgebracht over de olie-water (lipide monolayer) interface door centrifugeren te vormen GVs. Het verschil in dichtheid tussen sucrose (binnenste waterige oplossing) en ...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes

We demonstreren eencellige cultuur van bacteriën in gigantische blaasjes (GVS). Gv's met bacteriële cellen werden bereid door de druppel overdrachtsmethode en werden geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat voor directe observatie van bacteriële groei. Deze aanpak kan ook worden aangepast aan andere cellen.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Dit protocol biedt een middel voor het kweken van bacteriële cellen op eencellig niveau in gigantische vikjes. Het is gemakkelijk om de gigantische akeltjes te ontwikkelen, en slechts een zeer klein volume van monster oplossing is nodig om de vesikels voor te bereiden. Het aantonen van de procedure zal Yuri Ota zijn, een promovendus uit ons laboratorium.Begin met het toevoegen van 20 microliter vers bereide POPC-oplossing en vier microliter vers bereide biotine-PEG-DSPE-oplossing aan een glazen flacon. Verdamp het organische oplosmiddel door de luchtstroom tot een lipidefilm wordt gevormd. Plaats de film een uur in een desiccator om het organische oplosmiddel volledig te verdampen.Voeg vervolgens 200 microliter minerale olie toe aan de flacon. Bedek de opening van de flacon met plastic paraffinefilm en sonische de flacon inhoud in een ultrasoon bad op 120 watt voor ten minste een uur. Voor een kleine vesicle voorbereiding, maak een lipide film, zoals net aangetoond, en voeg 200 microliter van 200 millimeter glucose in LB medium aan de film.Vervolgens sonicate de film op 120 watt voor ten minste een uur, gevolgd door extrusie van de resulterende gigantische vikjes in kleine vikjes met behulp van een mini-extruder en een polycarbonaat membraan met een 100-nanometer porie grootte. Voor bacteriële cel pre-cultuur, inenting E.coli van een LB plaat in milliliters van LB medium voor een nachtelijke cultuur op 37 graden Celsius. De volgende ochtend, overdracht 20 microliters van de cultuur supernatant naar 1,98 milliliter verse LB medium voor een extra twee uur cultuur.Controleer aan het einde van de incubatie de optische dichtheid op 600 nanometer, of OD 600-waarde, van de pre-cultuuroplossing op een spectrofotometer. Een pre-cultuur oplossing met een OD 600 van een tot 1,5 moet worden gebruikt. Meng vervolgens de pre-culture oplossing met vers bereide sacharoseoplossing en vers LB-medium, volgens tabel één.Voor gigantische vesiclevorming voegt u 50 microliter van een vers bereide buitenste waterige oplossing van reuzenluisjes toe aan een plastic buis van 1,5 milliliter deksel. Voorzichtig laag 150 microliters van de lipide-bevattende olie-oplossing over de buitenste waterige oplossing van gigantische vikjes. Broed de resulterende oplossing gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur uit, voordat u controleert of de interface van de olie en waterige oplossingen vlak is.Voor water en olie bacteriële cel met druppelvorming, voeg twee microliters van een vers voorbereide innerlijke waterige oplossing van gigantische vikjes tot 50 microliter van de sonicated lipide-bevattende olie-oplossing in een 0,6 milliliter deksel plastic buis. Tik vervolgens op de buis om de twee componenten te emulgeren. Gebruik vervolgens een pipet om 50 microliters water- en oliedruppeloplossing toe te voegen aan de interface van de olie en waterige oplossing, en sediment de bacteriële celbevattende reuzenvratten door centrifugatie.Dan aspirate de bovenste olielaag en het verzamelen van de gigantische ageletjes. Om een handgemaakte kamer voor te bereiden, boor een gat van zeven millimeter met een holle punch op een 10 bij 10 bij 10 bij een millimeter dubbel-faced afdichting, dan plak de dubbele-faced afdichting op een 30 bij 40 millimeter deksel glas. Om een ondersteund bi-layer membraan voor te bereiden, voeg 30 microliter van de kleine blaasoplossing toe aan het gat van de handgemaakte kamer.Broed de apen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aan het einde van de incubatie was het gat voorzichtig twee keer met 20 microliters LB-medium, aangevuld met 200 millimillerglucose. Om gigantische blaasjes op het bilaagse membraan te immobiliseren, introduceert u 10 microliters neutravidin in buitenste waterige reuzensysicleoplossing voor een 15 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, voorzichtig wassen het gat twee keer met 20 microliters van LB medium, aangevuld met 200 millimiller glucose, en voeg het hele volume van gigantische blaasoplossing aan het gat in de kamer. Sluit het gat vervolgens af met een afdekglas van 18 bij 18 millimeter. Om bacteriële groei binnen de reuzenluisjes te monitoren, selecteert u de 40X-doelstelling op een omgekeerde microscoop en plaatst u de kamer op het microscoopverwarmingsfasesysteem.Vervolgens broeden de bacteriële cel-bevattende gigantische vikjes in de kamer onder statische omstandigheden gedurende zes uur op 37 graden Celsius, het vastleggen en registreren van beelden van de bacteriële cel groei om de 30 minuten, met de wetenschappelijke complementaire metaaloxide halfgeleider camera. Giant vesicles met bacteriële cellen variëren meestal in grootte van 10 tot 30 micrometer. Voor beide maten reuzensyikles ondergaan de E.coli-cellen rek- en delingsprocessen, waarbij sommige E.coli-cellen gedurende de observatieperiode van zes uur tot een zeer groot aantal cellen groeien.De relatieve frequentie van reuzensikjes met een enkelcellig niveau is ongeveer 10% van de verkregen reuzensikjes, en de reuzenvezels die op het eencellige niveau zijn ingekapseld, zijn ongeveer 50% van de reuzenvikjes die bacteriële cellen bevatten. De stabiliteit van de olie-water interface is belangrijk voor het verkrijgen van gigantische akeltjes met bacteriële cellen. Zorg ervoor dat de olie voorzichtig aanzuigen voordat de gigantische blaascorrectie.Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe bacteriële cellen cultuur op het niveau van de eencellige binnen individuele reuzenvikjes. Onze bacteriële cultuur methode is een nieuw instrument in de microbiologie voor het kweken van onbekende milieubacteriën te verkrijgen of te analyseren hun metabole producten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Voortplanting van<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Beoordeling van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en hartkolonisatie bij geïnfecteerde muizen met listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Ontwikkeling en Identificatie van een nieuw subpopulatie van Human neutrofielen afgeleide Giant Fagocyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Elektrofysiologische opnames van eencellige ionen stromen onder welomschreven afschuif spanning

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...