Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
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Ce travail a été soutenu par une initiative de premier plan pour d'excellents jeunes chercheurs (LEADER, no 16812285) du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sports et de la Technologie (MEXT) du Japon, une subvention d'aide pour la recherche sur les jeunes scientifiques (No. 18K18157, 16K21034) de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) à M.M., et Grant-in-Aid de MEXT à K.K. (No. 17H06417, 17H06413).

1. Préparation de véhicules uvraux contenant des cellules bactériennes par la méthode de transfert de gouttelettes
<ol><li>Préparer des solutions de stock lipidique de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) et 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotine-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en chloroforme/ solution de méthanol (2/1, v/v) et stocker le bouillon à -20 oC.</li>
	<li>Préparation d'une solution d'huile contenant des lipides</...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Ici, nous décrivons une méthode pour cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur des VÉHICULES lourds. Cette méthode simple consiste à former des GV contenant des cellules bactériennes au niveau unicellulaire en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes. Par rapport à d'autres approches pour l'obtention de VÉHICULES uvrifs contenant des cellules bactériennes, cette méthode présente deux avantages : (i) elle est facile à développer, et (ii) un petit volume (2 l) de la ...

La culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire a reçu une attention croissante. Cultiver des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur d'un espace confiné peut élucider des fonctions bactériennes telles que la variabilité phénotypique1,2,3,4, comportement cellulaire5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9, et résistance aux antibiotiques10,11. En raison des progrès récents dans les techniques de culture, la culture des bactéries simples peut être réalisée à l'intérieur d'un espace confiné, comme dans un puits-puce4,7,8, gouttelette de gel12,13 , et gouttelette d'eau dans l'huile (W/O)5,11. Pour promouvoir la compréhension ou l'utilisation de cellules bactériennes uniques, d'autres développements techniques des techniques de culture sont nécessaires.
Les vésicules qui imitent la membrane cellulaire biologique sont des compartiments sphériques composés de molécules amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux. Les vésicules sont classées en fonction de leur taille et comprennent les petites vésicules (SVs, diamètre et 100 nm), les grandes vésicules (LV, 'lt;1 'm) et les vésicules géantes (GV, 'gt;1 'm). Les SV ou LVs sont couramment utilisés comme porteurs de médicaments en raison de leur affinité avec la membrane cellulaire biologique14. Les GV ont également été utilisés comme système de réacteur pour la construction de protocellules15 ou de cellules artificielles16. L'encapsulation des cellules biologiques dans les GV a été rapportée17,18, et donc les GV montrent le potentiel comme un système de culture cellulaire lorsqu'il est combiné avec le système de réacteur.
Ici, avec une vidéo des procédures expérimentales, nous décrivons comment les GV peuvent être utilisés comme nouveaux navires de culture cellulaire19. Les GV contenant des bactéries ont été fabriqués par la méthode de transfert de gouttelettes20 et ont ensuite été immobilisés sur une membrane supportée sur un verre de couverture. Nous avons utilisé ce système pour observer la croissance bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des VÉHICULES électriques en temps réel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

Nous avons mis au point une méthode de culture des cellules bactériennes au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes (GV). La culture cellulaire bactérienne est importante pour comprendre la fonction des cellules bactériennes dans l'environnement naturel. En raison des progrès technologiques, diverses fonctions de cellules bactériennes peuvent être révélées au niveau d'une seule cellule à l'intérieur d'un espace confiné. Les VÉHICULES sont des compartiments sphériques de microtaille composée de molécules lipidiques amphiphiles et peuvent contenir divers matériaux, y compris des cellules. Dans cette étude, une seule cellule bactérienne a été encapsulée en 10 à 30 millions de véhicules par la méthode de transfert de gouttelettes et les GV contenant des cellules bactériennes ont été immobilisés sur une membrane supportée sur un substrat de verre. Notre méthode est utile pour observer la croissance en temps réel des bactéries simples à l'intérieur des VÉHICULES lourds. Nous avons cultivé des cellules Escherichia coli (E. coli) comme modèle à l'intérieur des GV, mais cette méthode peut être adaptée à d'autres types de cellules. Notre méthode peut être utilisée dans les domaines scientifiques et industriels de la microbiologie, de la biologie, de la biotechnologie et de la biologie synthétique.

Nous présentons une méthode simple pour générer des GV contenant des cellules bactériennes uniques en utilisant la méthode de transfert de gouttelettes (Figure 1). La figure 1a montre une image schématique des précipitations des VÉHICULES uvraux contenant des bactéries. Les gouttelettes W/O contenant des bactéries sont transférées à travers l'interface eau-huile (monocouche lipidique) par centrifugation pour former ...

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Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Culture cellulaire bactérienne au niveau unicellulaire à l'intérieur des vésicules géantes

Nous démontrons la culture unicellulaire des bactéries à l'intérieur des vésicules géantes (GM). Les GV contenant des cellules bactériennes ont été préparés par la méthode de transfert de gouttelettes et ont été immobilisés sur une membrane soutenue sur un substrat en verre pour l'observation directe de la croissance bactérienne. Cette approche peut également être adaptable à d'autres cellules.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Ce protocole fournit un moyen de culture des cellules bactériennes au niveau d’une seule cellule à l’intérieur des vésicules géantes. Il est facile de développer les vésicules géantes, et seul un très petit volume de solution d’échantillon est nécessaire pour préparer les vésicules. Yuri Ota, doctorant de notre laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par ajouter 20 microlitres de solution POPC fraîchement préparée et quatre microlitres de solution biotine-PEG-DSPE fraîchement préparée à un flacon de verre. Évaporer le solvant organique par flux d’air jusqu’à ce qu’un film lipidique soit formé. Placez le film dans un dessiccateur pendant une heure pour évaporer complètement le solvant organique.Ajouter ensuite 200 microlitres d’huile minérale au flacon. Couvrir l’ouverture du flacon de film de paraffine en plastique et sonifier le contenu du flacon dans un bain ultrasonique à 120 watts pendant au moins une heure. Pour une petite préparation vésicule, créer un film lipidique, comme il vient de le démontrer, et ajouter 200 microlitres de glucose de 200 millimètres dans le milieu LB au film.Puis sonicate le film à 120 watts pendant au moins une heure, suivie par l’extrusion des vésicules géantes résultantes en petites vésicules à l’aide d’un mini extrure et une membrane en polycarbonate avec une taille pore de 100 nanomètres. Pour la pré-culture des cellules bactériennes, inoculer E.coli à partir d’une plaque LB en millilitres de moyenne LB pour une culture nocturne à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, transférez 20 microlitres du supernatant de la culture à 1,98 millilitres de milieu LB frais pour deux heures supplémentaires de culture.À la fin de l’incubation, vérifiez la densité optique à 600 nanomètres, ou valeur OD 600, de la solution de pré-culture sur un spectrophotomètre. Une solution pré-culture avec un OD 600 de un à 1,5 doit être utilisée. Mélangez ensuite la solution pré-culture avec une solution de saccharose fraîchement préparée et un milieu LB frais, selon le premier tableau.Pour la formation de vésicules géantes, ajouter 50 microlitres d’une solution aqueuse extérieure fraîchement préparée de vésicules géantes à un tube en plastique liquéfié de 1,5 millilitre. Superposez délicatement 150 microlitres de la solution d’huile contenant des lipides sur la solution aqueuse externe des vésicules géantes. Incuber la solution résultante pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, avant de vérifier pour s’assurer que l’interface de l’huile et des solutions aqueuse est plate.Pour la cellule bactérienne d’eau et d’huile contenant la formation de gouttelettes, ajoutez deux microlitres d’une solution aqueuse intérieure fraîchement préparée des vésicules géantes à 50 microlitres de la solution d’huile lipidique sonicated dans un tube en plastique liquéfié de 0,6 millilitre. Ensuite, appuyez sur le tube pour émulsionner les deux composants. Ensuite, utilisez une pipette pour ajouter 50 microlitres de solution de gouttelette d’eau et d’huile à l’interface de l’huile et de la solution aqueuse, et sédimentez les vésicules géantes contenant des cellules bactériennes par centrifugation.Aspirez ensuite la couche d’huile supérieure et recueillez les vésicules géantes. Pour préparer une chambre faite à la main, percer un trou de sept millimètres avec un poinçon creux sur un joint à double face de 10 x 10 par un millimètre, puis coller le joint à double face sur un verre de couverture de 30 x 40 millimètres. Pour préparer une membrane à deux couches soutenue, ajouter 30 microlitres de la petite solution vésicule au trou de la chambre faite à la main.Incuber les vésicules à température ambiante pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, laver délicatement le trou deux fois avec 20 microlitres de LB moyen, complété par du glucose de 200 millimiller. Pour immobiliser les vésicules géantes sur la membrane bicouque supporteuse, introduisez 10 microlitres de neutravidine dans la solution externe de vésicule géante aqueuse au trou pendant une incubation de 15 minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, laver délicatement le trou deux fois avec 20 microlitres de LB moyen, complété par du glucose de 200 millimiller, et ajouter tout le volume de solution vésicule géante au trou dans la chambre. Ensuite, sceller le trou avec un verre de couverture de 18 par 18 millimètres. Pour surveiller la croissance bactérienne dans les vésicules géantes, sélectionnez l’objectif 40X sur un microscope inversé et placez la chambre sur le système de chauffage au microscope.Puis incuber les vésicules géantes contenant des cellules bactériennes dans la chambre dans des conditions statiques pendant six heures à 37 degrés Celsius, capturer et enregistrer des images de la croissance des cellules bactériennes toutes les 30 minutes, avec la caméra semi-conducteur d’oxyde métallique complémentaire scientifique. Les vésicules géantes contenant des cellules bactériennes varient généralement en taille de 10 à 30 micromètres. Pour les deux tailles de vésicules géantes, les cellules E.coli subissent des processus d’allongement et de division, certaines cellules E.coli se développent à un très grand nombre de cellules au cours de la période d’observation de six heures.La fréquence relative des vésicules géantes contenant un seul niveau cellulaire est d’environ 10% des vésicules géantes obtenues, et les vésicules géantes encapsulées au niveau d’une seule cellule sont environ 50% des vésicules géantes contenant des cellules bactériennes. La stabilité de l’interface huile-eau est importante pour obtenir des vésicules géantes contenant des cellules bactériennes. Prenez soin d’aspirer l’huile soigneusement avant la correction vésicule géante.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de la culture des cellules bactériennes au niveau d’une seule cellule dans les vésicules géantes individuelles. Notre méthode de culture bactérienne est un nouvel outil de microbiologie pour la culture de bactéries environnementales inconnues pour obtenir ou analyser leurs produits métaboliques.

Research

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