Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von einer Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) japans unterstützt, einem Stipendium für junge Wissenschaftlerforschung (Nr. 18K18157, 16K21034) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) bis M.M., und Grant-in-Aid von MEXT bis K.K. (Nr. 17H06417, 17H06413).

1. Herstellung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, nach der Tröpfchenübertragungsmethode
<ol><li>Bereiten Sie Lipid-Lagerlösungen von 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC, 10 mM, 1 ml) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Biotinyl(Polyethylenglycol)-2000] (Biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) in Chloroform/ Methanollösung (2/1, v/v) und lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C.</li>
	<li>Herstellung einer lipidhaltigen Öllösung
	<ol>
<li>Gießen Sie 20 l der POPC-L?...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb von GVs. Bei dieser einfachen Methode werden GVs gebildet, die Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene enthalten, indem die Tröpfchenübertragungsmethode verwendet wird. Im Vergleich zu anderen Ansätzen zur Gewinnung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, hat diese Methode zwei Vorteile: (i) es ist leicht zu entwickeln, und (ii) ein kleines Volumen (2 l) der Probenlösung ist erforderlich, um die GVs vorzubereiten. D...

Die Kultur der Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene hat zunehmend Beachtung gefunden. Die Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb eines begrenzten Raumes kann bakterielle Funktionen wie phänotypische Variabilität1,2,3,4, Zellverhalten5, 6 , 7 , 8 , 9und Antibiotikaresistenz10,11. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in Kulturtechniken kann die Kultur einzelner Bakterien auf engstem Raum erreicht werden, z. B. in einem Well-Chip4,7,8, Geltröpfchen12,13 , und Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen5,11. Um das Verständnis oder die Nutzung einzelner Bakterienzellen zu fördern, sind weitere technische Entwicklungen der Kultivierungstechniken erforderlich.
Vesikel, die die biologische Zellmembran imitieren, sind kugelförmige Kompartimente, die aus amphiphilen Molekülen bestehen und verschiedene Materialien aufnehmen können. Vesikel werden nach Größe klassifiziert und umfassen kleine Vesikel (SVs, Durchmesser < 100 nm), große Vesikel (LVs, <1 m) und Riesenbläschen (GVs, >1 m). SVs oder LVs werden aufgrund ihrer Affinität zur biologischen Zellmembran14häufig als Arzneimittelträger eingesetzt. GVs wurden auch als Reaktorsystem für den Bau von Protozellen15 oder künstlicheZellen16verwendet. Die Verkapselung biologischer Zellen inGVs wurde 17,18berichtet, und somit zeigen GVs in Kombination mit dem Reaktorsystem Potenzial als Zellkultursystem.
Hier beschreiben wir zusammen mit einem Video von experimentellen Verfahren, wie VVs als neuartige Zellkulturgefäße verwendet werden können19. GVs, die Bakterien enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode20 hergestellt und dann auf einer unterstützten Membran auf einem Deckglas immobilisiert. Wir nutzten dieses System, um das Bakterienwachstum auf einzelzelliger Ebene in GVs in Echtzeit zu beobachten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

Wir haben eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzelliger Ebene in Riesigen Vesikeln (GVs) entwickelt. Bakterielle Zellkultur ist wichtig für das Verständnis der Funktion von Bakterienzellen in der natürlichen Umgebung. Aufgrund des technologischen Fortschritts können verschiedene bakterielle Zellfunktionen auf einzelzeller Ebene auf engstem Raum aufgedeckt werden. GVs sind kugelförmige mikrogroße Kompartimente, die aus amphiphilen Lipidmolekülen bestehen und verschiedene Materialien, einschließlich Zellen, aufnehmen können. In dieser Studie wurde eine einzelne Bakterienzelle durch die Tröpfchenübertragungsmethode in 10–30 m GVs eingekapselt und die GVs, die Bakterienzellen enthielten, auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat immobilisiert. Unsere Methode ist nützlich, um das Echtzeitwachstum einzelner Bakterien in GVs zu beobachten. Wir kultivierten Escherichia coli (E. coli) Zellen als Modell innerhalb von GVs, aber diese Methode kann an andere Zelltypen angepasst werden. Unsere Methode kann in den Bereichen Mikrobiologie, Biologie, Biotechnologie und Synthetische Biologie eingesetzt werden.

Wir stellen eine einfache Methode zur Generierung von GVs vor, die einzelne Bakterienzellen mit der Tröpfchenübertragungsmethode enthalten (Abbildung 1). Abbildung 1a zeigt ein schematisches Bild der Ausfällung von GVs, die Bakterien enthalten. W/O-Tröpfchen, die Bakterien enthalten, werden durch Zentrifugation über die Öl-Wasser-Schnittstelle (Lipid-Monolayer) zu GVs übertragen. Der Dichteunterschied zwischen Saccharose (...

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Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel

Wir zeigen die einzellige Kultur von Bakterien in riesigen Vesikeln (GVs). GVs, die Bakterienzellen enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode hergestellt und auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat zur direkten Beobachtung des Bakterienwachstums immobilisiert. Dieser Ansatz kann auch an andere Zellen angepasst werden.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Dieses Protokoll bietet ein Mittel zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelliger Ebene in riesigen Vesikeln. Es ist einfach, die riesigen Vesikel zu entwickeln, und nur ein sehr kleines Volumen an Probenlösung ist erforderlich, um die Vesikel vorzubereiten. Demonstriert wird das Verfahren von Juri Ota, einem Doktoranden aus unserem Labor.Beginnen Sie mit 20 Mikroliter frisch zubereiteter POPC-Lösung und vier Mikroliter frisch zubereiteter Biotin-PEG-DSPE-Lösung zu einer Glasdurchstechflasche. Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom, bis sich ein Lipidfilm bildet. Legen Sie den Film für eine Stunde in einen Trockenbau, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen.Dann 200 Mikroliter Mineralöl in die Durchstechflasche geben. Die Öffnung der Durchstechflasche mit Kunststoffparaffinfolie abdecken und den Fläschcheninhalt in einem Ultraschallbad mindestens eine Stunde lang mit 120 Watt beschallen. Für eine kleine Vesikelzubereitung einen Lipidfilm erstellen, wie gerade gezeigt, und fügen Sie 200 Mikroliter 200 Millimeter Glukose in LB Medium in den Film.Dann beschallen Sie den Film mit 120 Watt für mindestens eine Stunde, gefolgt von der Extrusion der resultierenden Riesenbläschen in kleine Vesikel mit einem Miniextruder und einer Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 100 Nanometern. Für bakterielle Zellpräkultur, impfen E.coli von einer LB-Platte in Milliliter LB Medium für eine Nachtkultur bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen 20 Mikroliter des Überstandes der Kultur für weitere zwei Stunden Kultur auf 1,98 Milliliter frisches LB-Medium übertragen.Überprüfen Sie am Ende der Inkubation die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600-Wert der Vorkulturlösung auf einem Spektralphotometer. Es sollte eine vorkulturelle Lösung mit einem OD 600 von einem bis 1,5 verwendet werden. Dann mischen Sie die Vorkulturlösung mit frisch zubereiteter Saccharoselösung und frischem LB-Medium, so Tabelle eins.Für die riesige Vesikelbildung 50 Mikroliter einer frisch zubereiteten äußeren wässrigen Lösung von Riesenbläschen zu einem 1,5 Milliliter-Kunststoffrohr hinzufügen. 150 Mikroliter der fetthaltigen Öllösung vorsichtig über die äußere wässrige Lösung von Riesenbläschen schichten. Inkubieren Sie die resultierende Lösung für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie überprüfen, ob die Schnittstelle des Öls und wässrige Lösungen flach ist.Für Wasser und Öl Bakterienzelle enthalten Tropfen Bildung, fügen Sie zwei Mikroliter einer frisch zubereiteten inneren wässrigen Lösung von riesigen Vesikel zu 50 Mikroliter der beschallten lipidhaltigen Öllösung in einem 0,6 Milliliter Deckel Kunststoffrohr. Tippen Sie dann auf das Rohr, um die beiden Komponenten zu emulgieren. Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um 50 Mikroliter Wasser und Öltröpfchenlösung an die Schnittstelle des Öls und der wässrigen Lösung zu legen, und sedimentieren Sie die bakteriellen zellhaltigen Riesenbläschen durch Zentrifugation.Dann die obere Ölschicht ansaugen und die riesigen Vesikel sammeln. Um eine handgefertigte Kammer vorzubereiten, bohren Sie ein Sieben-Millimeter-Loch mit einem Hohlstanz auf eine 10 mal 10 mal 10 mal einen Millimeter doppelseitige Dichtung, und fügen Sie dann die doppelseitige Dichtung auf ein 30 mal 40 Millimeter-Deckglas ein. Um eine unterstützte Zweischichtmembran vorzubereiten, fügen Sie 30 Mikroliter der kleinen Vesikellösung in das Loch der handgefertigten Kammer ein.Inkubieren Sie die Vesikel bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Am Ende der Inkubation, waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 Mikroliter LB Medium, ergänzt mit 200 Millimiller Glukose. Um riesige Vesikel auf der Unterstützenden Zweischichtmembran zu immobilisieren, führen Sie 10 Mikroliter Neutravidin in äußere wässrige Riesenbläschenlösung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in das Loch ein.Am Ende der Inkubation, waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 MikroliterLB-Medium, ergänzt mit 200 Millimiller Glukose, und fügen Sie das gesamte Volumen der riesigen Vesikellösung in das Loch in der Kammer. Dann versiegeln Sie das Loch mit einem 18 mal 18 Millimeter-Abdeckungsglas. Um das Bakterienwachstum innerhalb der riesigen Vesikel zu überwachen, wählen Sie das 40-fache Objektiv auf einem invertierten Mikroskop aus, und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop-Heizbühnensystem.Dann inkubieren Sie die bakteriellen zellhaltigen Riesenbläschen in der Kammer unter statischen Bedingungen für sechs Stunden bei 37 Grad Celsius, wobei Sie alle 30 Minuten Bilder des Bakterienzellwachstums mit der wissenschaftlich komplementären Metalloxid-Halbleiterkamera aufnehmen und aufzeichnen. Riesige Vesikel, die Bakterienzellen enthalten, haben in der Regel eine Größe von 10 bis 30 Mikrometern. Bei beiden Größen von Riesenbläschen durchlaufen die E.coli-Zellen Dehnungs- und Divisionsprozesse, wobei einige E.coli-Zellen während des sechsstündigen Beobachtungszeitraums zu einer sehr großen Anzahl von Zellen anwachsen.Die relative Häufigkeit von Riesenvesikeln, die eine einzelne Zellebene enthalten, beträgt etwa 10% der erhaltenen Riesenbläschen, und die riesigen Vesikel, die auf der Ebene der Einzelzellen verkapselt sind, sind etwa 50% der riesigen Vesikel, die Bakterienzellen enthalten. Die Stabilität der Öl-Wasser-Schnittstelle ist wichtig für die Gewinnung von riesigen Vesikeln, die Bakterienzellen enthalten. Achten Sie darauf, das Öl sorgfältig vor der riesigen Vesikelkorrektur zu aspirieren.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bakterielle Zellen auf einzelzelliger Ebene innerhalb einzelner Riesenbläschen kultiviert. Unsere Bakterielle Kulturmethode ist ein neues Werkzeug in der Mikrobiologie, um unbekannte Umweltbakterien zu kultivieren, um ihre Stoffwechselprodukte zu erhalten oder zu analysieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Ausbreitung von<em&gt; Homalodisca coagulata Virus-01</em&gt; Über<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Zellkultur

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolierung der einzelnen intrazelluläre bakterielle Gemeinschaften erzeugt aus einem Mausmodell der urinausscheidende Fläche Infektion nachgelagerten Einzeller Analysezwecken

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...