Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי יוזמה מובילה לחוקרים צעירים מצוינים (מנהיג, No. 16812285) ממשרד החינוך, התרבות, ספורט, מדע וטכנולוגיה (MEXT) של יפן, מענק סיוע למחקר מדען צעיר (No. 18K18157, 16K21034) מחברה יפן לקידום המדע (JSPS) ל M.M., ו גרנט-עזרה מ-MEXT ל-K.K. (No. 17H06417, 17H06417).

1. הכנת GVs המכיל תאים חיידקיים על ידי שיטת העברת Droplet
<ol><li>הכנת פתרונות מניות ליפיד של 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC, 10 מ"מ, 1 מ ל) ו-1, 2-distearoyl-sn-גליקו-3-פוספולאטאנאמין-N-[ביוטיקסיל (פוליאתילן)-2000] (biotin-יתד-DSPE, 0.1 מ"מ, 1 מ ל) בכלורופורם/ מתנול פתרון (2/1, v/v) ולאחסן את המניה ב-20 ° c.</li>
	<li>הכנת תמיס?...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

כאן, אנו מתארים שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא אחד בתוך GVs. שיטה פשוטה זו כרוכה ביצירת GVs המכיל תאים חיידקיים ברמה תא יחיד באמצעות שיטת ה-droplet העברה. לעומת גישות אחרות להשגת GVs המכיל תאים חיידקיים, שיטה זו יש שני יתרונות: (אני) זה קל לפתח, ו (ii) נפח קטן (2 μL) של פתרון לדוגמה נדרש כדי להכין את G...

התרבות של תאים חיידקיים ברמה תא אחד קיבל את תשומת הלב הגוברת. התאים חיידקי בקטריאלי ברמת תא בודד בתוך שטח מוגבל יכול להבהיר פונקציות חיידקיים כגון השונות פנוטימית1,2,3,4, התנהגות התא5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9, ו עמידות לאנטיביוטיקה10,11. בגלל ההתקדמות האחרונה בטכניקות התרבות, ניתן להשיג את התרבות של חיידקים בודדים בתוך מקום מוגבל, כגון שבב היטב4,7,8, ג'ל droplet12,13 , והמים בשמן (W/O) droplet5,11. כדי לקדם הבנה או ניצול של תאים חיידקיים בודדים, יש צורך בהתפתחויות טכניות נוספות של טכניקות טיפוח.
שלפוחיות המחקים את קרום התא הביולוגי הן תאים כדוריים המורכב ממולקולות אמפיפיליות ויכולות להכיל חומרים שונים. שלפוחיות מסווגים לפי גודל וכוללות שלפוחיות קטנות (SVs, קוטר < 100 ננומטר), שלפוחיות גדולות (LVs, < 1 μm), ושלפוחיות ענק (GVs, > 1 μm). SVs או LVs משמשים בדרך כלל כנשאים לתרופות בשל הזיקה לקרום התא הביולוגי14. GVs יש גם שימש כמערכת הכור עבור הבנייה של פרוטותאים15 או מלאכותי תאים16. כימוס של תאים ביולוגיים לתוך gvs דווח17,18, ולכן gvs להראות פוטנציאל כמערכת תרבות התא כאשר בשילוב עם מערכת הכור.
כאן, יחד עם וידאו של הליכים ניסיוניים, אנו מתארים כיצד GVs יכול לשמש ככלי תרבות התא הרומן19. GVs המכילים חיידקים נעשו על ידי שיטת ה-droplet העברת20 והיו מקיבוע על קרום נתמך על זכוכית כיסוי. השתמשנו במערכת זו כדי להתבונן בגידול חיידקי ברמה של תא בודד בתוך GVs בזמן אמת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

פיתחנו שיטה עבור תאים חיידקיים culturing ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק (GVs). התרבות התא חיידקי חשוב להבנת הפונקציה של תאים חיידקיים בסביבה הטבעית. בגלל ההתקדמות הטכנולוגית, ניתן לגלות פונקציות שונות של תאים חיידקיים במפלס התא היחיד בתוך מרחב סגור. GVs הם תאים מיקרו בגודל כדורי מורכב מולקולות השומנים האמפיפילי והוא יכול להכיל חומרים שונים, כולל תאים. במחקר זה, תא חיידקי בודד הועבר 10 – 30 יקרומטר gvs על ידי שיטת העברת droplet ו-gvs המכיל תאים חיידקיים היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע הזכוכית. השיטה שלנו היא שימושית להתבוננות בצמיחה בזמן אמת של חיידקים בודדים בתוך GVs. אנו מתורבתים Es, האנתכיה קולי (E. coli) תאים כמודל בתוך gvs, אבל שיטה זו ניתן להתאים לסוגי תאים אחרים. ניתן להשתמש בשיטה שלנו בתחומי המדע והתעשייה של מיקרוביולוגיה, ביולוגיה, ביוטכנולוגיה וביולוגיה סינתטית.

אנו מציגים שיטה פשוטה ליצירת GVs המכיל תאים חיידקיים בודדים באמצעות שיטת ה-droplet העברה (איור 1). איור 1a מראה תמונה סכמטית של המשקעים של gvs המכילים חיידקים. W/O טיפות המכילים חיידקים מועברים על פני מי השמן (מונאולד מונואולייר) ממשק ידי צנטריפוגה כ...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

אנו מדגימים תרבות תא יחיד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק (GVs). GVs המכיל תאים חיידקיים הוכנו על ידי שיטת העברת droplet היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע זכוכית להתבוננות ישירה של גידול חיידקי. גישה זו עשויה להיות גם הסתגלות לתאים אחרים.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

פרוטוקול זה מספק אמצעי לפולחן תאים חיידקיים ברמת התא הבודד בתוך וריים ענקיים. קל לפתח את הויקטים הענקיים, ורק נפח קטן מאוד של פתרון מדגם נדרש כדי להכין את הווסיקים. הדגמת ההליך תהיה יורי אוטה, מועמד לדוקטורט מהמעבדה שלנו.התחל על ידי הוספת 20 microliters של פתרון POPC מוכן טרי וארבעה microliters של פתרון ביוטין-PEG-DSPE מוכן טרי לבקבוקון זכוכית. להתאדות את הממס האורגני על ידי זרימת אוויר עד סרט השומנים נוצר. מניחים את הסרט ב desiccator במשך שעה אחת כדי להתאדות לחלוטין את הממס האורגני.לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטרים של שמן מינרלי לבקבוקון. מכסים את פתיחת הבקבוקון עם סרט פרפין פלסטיק, ו sonicate את תכולת הבקבוקון באמבטיה קולית ב 120 וואט לפחות שעה אחת. להכנת קבוצה קטנה, ליצור סרט השומנים, כפי שהוכח רק, ולהוסיף 200 microliters של 200 מילימטר גלוקוז במדיום LB לסרט.לאחר מכן sonicate הסרט ב 120 וואט לפחות שעה, ואחריו הבלטה של שלפוחיות ענק וכתוצאה מכך לתוך שלפוחיות קטנות באמצעות extruder מיני קרום פוליקרבונט עם גודל נקבובית 100 ננומטר. עבור תא חיידקי טרום תרבות, לחסן E.coli מצלחת LB למיליליטרים של מדיום LB לתרבות לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, להעביר 20 microliters של העל-טבעי של התרבות ל 1.98 מיליליטר של מדיום LB טרי עבור שעתיים נוספות של תרבות.בסוף הדגירה, בדוק את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר, או OD 600 ערך, של פתרון טרום תרבות על ספקטרופוטומטר. יש להשתמש בפתרון טרום-תרבותי עם OD 600 של אחד עד 1.5. לאחר מכן מערבבים את הפתרון טרום תרבות עם פתרון סוכרוז מוכן טרי בינוני LB טרי, על פי שולחן אחד.להיווצרות וריסקים ענקיים, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פתרון מימי טרי של וריסקים ענקיים לצינור פלסטיק מרופד 1.5 מיליליטר. בעדינות שכבה 150 microliters של תותבת שמן המכיל שומנים מעל הפתרון הממימי החיצוני של יידים ענקיים. הדגירה את הפתרון וכתוצאה מכך במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, לפני הבדיקה כדי להבטיח כי הממשק של השמן ופתרונות מים הוא שטוח.לתא חיידקי מים ושמן המכיל היווצרות טיפות, הוסיפו שני מיקרוליטרים של פתרון מימי פנימי שהוכן טרי של ורידים ענקיים ל-50 מיקרוליטרים של תותבת השמן המכילה שומנים מחוסנים בצינור פלסטיק שטוף 0.6 מיליליטר. לאחר מכן, הקש על הצינור כדי לחקות את שני הרכיבים. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים של תותב טיפות מים ושמן לממשק של השמן והתסיסה המים, ולמשחות את ורידים ענקיים המכילים תאים חיידקיים על ידי צנטריפוגה.לאחר מכן שאפו את שכבת השמן העליונה ואספו את הווסיקים הענקיים. כדי להכין תא בעבודת יד, לקדוח חור שבעה מילימטר עם אגרוף חלול על 10 על ידי 10 על ידי חותם כפול פנים מילימטר אחד, ולאחר מכן להדביק את החותם דו פנים על 30 על ידי 40 מילימטר כיסוי זכוכית. להכנת קרום דו שכבתי נתמך, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תותב הווסקל הקטן לחור של התא בעבודת יד.הדגירה את הווסיקים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, בעדינות לשטוף את החור פעמיים עם 20 microliters של בינוני LB, בתוספת 200 מילימילר גלוקוז. כדי לשתק ורידים ענקיים על קרום דו שכבתי תומך, להציג 10 microliters של neutravidin בתווית ורידים ענקית מים החיצוני לחור עבור דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף בעדינות את החור פעמיים עם 20 microliters של בינוני LB, בתוספת 200 מילימילר גלוקוז, ולהוסיף את כל נפח של פתרון וריסק ענק לחור בתא. ואז לאטום את החור עם 18 על 18 מילימטר כיסוי זכוכית. כדי לנטר את צמיחת החיידקים בתוך וקסיקים ענקיים, בחר את המטרה 40X על מיקרוסקופ הפוך, והצב את התא על מערכת שלב חימום מיקרוסקופ.לאחר מכן הדגירה את ורי ענק המכיל תא חיידקי בתא בתנאים סטטיים במשך שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס, לכידת והקלטה תמונות של צמיחת תא חיידקי כל 30 דקות, עם המצלמה המדעית משלימה תחמוצת מתכת מוליכים למחצה. וריסקים ענקיים המכילים תאים חיידקיים נעים בדרך כלל בין 10 ל -30 מיקרומטר. עבור שני הגדלים של גירויים ענקיים, תאי ה- E.coli עוברים תהליכי התארכות וחלוקה, כאשר כמה תאי E.coli גדלים למספר גדול מאוד של תאים במהלך תקופת התצפית של שש שעות.התדירות היחסית של זרעי ענק המכילים רמת תא יחיד היא כ-10% מהוווסתים הענקיים המתקבלים, והווסיקלס הענקיים המובלים ברמת התא הבודד הם כ-50% מהוויים הענקיים המכילים תאי חיידקים. היציבות של ממשק מי השמן חשובה להשגת ערכות ענק המכילות תאי חיידקים. יש לדאוג שאפו את השמן בזהירות לפני תיקון וריד ענק.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לתרבת תאים חיידקיים ברמת התא הבודד בתוך וריים ענקיים בודדים. שיטת התרבות החיידקית שלנו היא כלי חדש במיקרוביולוגיה לגידול חיידקים סביבתיים לא ידועים כדי להשיג או לנתח את המוצרים המטבוליים שלהם.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

רביה של<em&gt; וירוס-01 coagulata Homalodisca</em&gt; דרך<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; תרבות תא

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes<em&gt; במבחנה</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...