Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da un'iniziativa leader per eccellenti giovani ricercatori (LEADER, n. 16812285) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone, un Grant-in-Aid per la ricerca sui giovani scienziati (n. 18K18157, 16K21034) dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) a M.M., e Grant-in-Aid da MEXT a K.K. (n. 17H06417, 17H06413).

1. Preparazione di GV contenenti cellule batteriche con il metodo di trasferimento goccia
<ol><li>Preparare soluzioni di riserva lipididiche di 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in cloroformio/ soluzione di metanolo (2/1, v/v) e conservare il brodo a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparazione di una soluzione di olio contenente lipidi
	<ol>
<li>Versa...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Qui, descriviamo un metodo per coltivare le cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno dei GV. Questo semplice metodo prevede la formazione di GV contenenti cellule batteriche a livello di singola cellula utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole. Rispetto ad altri approcci per ottenere GV contenenti cellule batteriche, questo metodo presenta due vantaggi: (i) è facile da sviluppare e (ii) è necessario un piccolo volume (2 -L) della soluzione campione per preparare i GV. Il metodo di trasfe...

La coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula ha ricevuto una crescente attenzione. Coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di uno spazio ristretto può chiarire le funzioni batteriche come la variabilità fenotipica1,2,3,4, il comportamento cellulare5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9, e resistenza agli antibiotici10,11. A causa dei recenti progressi nelle tecniche di coltura, la coltura di singoli batteri può essere raggiunta all'interno di uno spazio confinato, come in un pozzo4,7,8, goccia di gel12,13 e gocciolatore acqua in olio (W/O)5,11. Per promuovere la comprensione o l'utilizzo di singole cellule batteriche, sono necessari ulteriori sviluppi tecnici delle tecniche di coltivazione.
Le vescicole che imitano la membrana cellulare biologica sono compartimenti sferici costituiti da molecole anfifile e possono contenere vari materiali. Le vesciche sono classificate in base alle dimensioni e includono piccole vesciche (SV, diametro < 100 nm), grandi vescicle (LV, <1 m) e vescicle giganti (GV, >1 m). SV o LV sono comunemente utilizzati come portatori di droga a causa della loro affinità con la membrana cellulare biologica14. I GV sono stati utilizzati anche come sistema di reattori per la costruzione di protocelle15 o cellule artificiali16. L'incapsulamento di cellule biologiche in GV è stato segnalato17,18, e quindi i GV mostrano il potenziale come sistema di coltura cellulare quando combinati con il sistema del reattore.
Qui, insieme a un video di procedure sperimentali, descriviamo come i GV possono essere utilizzati come nuovi vasi di coltura cellulare19. I GV contenenti batteri sono stati realizzati con il metodo di trasferimento delle goccioline20 e sono stati poi immobilizzati su una membrana supportata su un vetro di copertura. Abbiamo usato questo sistema per osservare la crescita batterica a livello di singola cellula all'interno dei GV in tempo reale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

Abbiamo sviluppato un metodo per coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti (GV). La coltura delle cellule batteriche è importante per comprendere la funzione delle cellule batteriche nell'ambiente naturale. A causa dei progressi tecnologici, varie funzioni delle cellule batteriche possono essere rivelate a livello di singola cellula all'interno di uno spazio confinato. I GV sono compartimenti sferici di micro-dimensioni composti da molecole lipidiche anfifili e possono contenere vari materiali, comprese le cellule. In questo studio, una singola cellula batterica è stata incapsulata in 10-30 GV con il metodo di trasferimento delle goccioline e i Env contenenti cellule batteriche sono stati immobilizzati su una membrana supportata su un substrato di vetro. Il nostro metodo è utile per osservare la crescita in tempo reale di singoli batteri all'interno dei GV. Abbiamo coltivato cellule di Escherichia coli (E. coli) come modello all'interno di GV, ma questo metodo può essere adattato ad altri tipi di cellule. Il nostro metodo può essere utilizzato nei campi scientifici e industriali della microbiologia, della biologia, della biotecnologia e della biologia sintetica.

Presentiamo un metodo semplice per generare GV contenenti singole cellule batteriche utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole (Figura 1). La figura 1a mostra un'immagine schematica della precipitazione di GV contenenti batteri. Le goccioline W/O contenenti batteri vengono trasferite attraverso l'interfaccia olio-acqua (strato di lipidi) dalla centrifugazione per formare i GV. La differenza di densità tra il saccaros...

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Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicoli giganti

Dimostriamo la coltura unicellulare di batteri all'interno di vescicoli giganti (GV). I GV contenenti cellule batteriche sono stati preparati con il metodo di trasferimento delle goccioline e sono stati immobilizzati su una membrana sostenuta su un substrato di vetro per l'osservazione diretta della crescita batterica. Questo approccio può anche essere adattabile ad altre cellule.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Questo protocollo fornisce un mezzo per coltivare cellule batteriche a livello di una singola cellula all'interno di vescicole giganti. È facile sviluppare le vescicole giganti e per preparare le vescicole è necessario solo un volume molto piccolo di soluzione campione. A dimostrare la procedura sarà Yuri Ota, dottorando del nostro laboratorio.Inizia aggiungendo 20 microlitri di soluzione POPC appena preparata e quattro microlitri di soluzione biotina-PEG-DSPE appena preparata a una fiala di vetro. Evaporare il solvente organico per flusso d'aria fino a formare un film lipidico. Mettere il film in un essiccatore per un'ora per evaporare completamente il solvente organico.Quindi aggiungere 200 microlitri di olio minerale al flaconcino. Coprire l'apertura del flaconcino con pellicola di paraffina di plastica e sonicare il contenuto del flaconcino in un bagno ad ultrasuoni a 120 watt per almeno un'ora. Per una piccola preparazione di vescicola, creare un film lipidico, come appena dimostrato, e aggiungere 200 microlitri di glucosio di 200 millimetri nel mezzo LB al film.Quindi sonicare il film a 120 watt per almeno un'ora, seguito dall'estrusione delle vescicole giganti risultanti in piccole vescicole usando un mini estrusore e una membrana in policarbonato con una dimensione dei pori di 100 nanometri. Per la precoltura delle cellule batteriche, inoculare E.coli da una piastra LB in millilitri di mezzo LB per una coltura notturna a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, trasferire 20 microlitri del supernatante della coltura a 1,98 millilitri di mezzo LB fresco per altre due ore di coltura.Al termine dell'incubazione, controllare la densità ottica a 600 nanometri, o valore OD 600, della soluzione pre-coltura su uno spettrofotometro. Deve essere utilizzata una soluzione pre-coltura con OD 600 da uno a 1,5. Quindi mescolare la soluzione pre-coltura con soluzione di saccarosio preparata al momento e mezzo LB fresco, secondo la tabella uno.Per la formazione di vescicole giganti, aggiungere 50 microlitri di una soluzione acquosa esterna preparata al momento di vescicole giganti a un tubo di plastica lidded da 1,5 millilitri. Strato delicato 150 microlitri della soluzione di olio contenente lipidi sulla soluzione acquosa esterna di vescicole giganti. Incubare la soluzione risultante per 10-15 minuti a temperatura ambiente, prima di verificare che l'interfaccia dell'olio e delle soluzioni acquose sia piatta.Per le cellule batteriche dell'acqua e dell'olio contenenti formazione di goccioline, aggiungere due microlitri di una soluzione acquosa interna appena preparata di vescicole giganti a 50 microlitri della soluzione di olio sonicato contenente lipidi in un tubo di plastica lidded da 0,6 millilitri. Quindi, toccare il tubo per emulsionare i due componenti. Successivamente, utilizzare una pipetta per aggiungere 50 microlitri di acqua e soluzione di goccioline di olio all'interfaccia dell'olio e della soluzione acquosa e sedimentare le vescicole giganti contenenti cellule batteriche mediante centrifugazione.Quindi aspirare lo strato superiore di olio e raccogliere le vescicole giganti. Per preparare una camera fatta a mano, praticare un foro di sette millimetri con un punzone cavo su una guarnizione a doppia faccia da 10 per 10 per un millimetro, quindi incollare la guarnizione a doppia faccia su un vetro di copertura da 30 per 40 millimetri. Per preparare una membrana bistrato supportata, aggiungere 30 microlitri della piccola soluzione di vescicola al foro della camera fatta a mano.Incubare le vescicole a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente il foro due volte con 20 microlitri di mezzo LB, integrati con glucosio da 200 millimiller. Per immobilizzare vescicole giganti sulla membrana bistrato del sostenitore, introdurre 10 microlitri di neutravidina nella soluzione di vescicola gigante acquosa esterna al foro per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente il foro due volte con 20 microlitri di mezzo LB, integrati con glucosio da 200 millimiller, e aggiungere l'intero volume di soluzione vescicolare gigante al foro nella camera. Quindi sigillare il foro con un vetro di copertura da 18 a 18 millimetri. Per monitorare la crescita batterica all'interno delle vescicole giganti, selezionare l'obiettivo 40X su un microscopio invertito e posizionare la camera sul sistema di stadio di riscaldamento del microscopio.Quindi incubare le vescicole giganti contenenti cellule batteriche nella camera in condizioni statiche per sei ore a 37 gradi Celsius, catturando e registrando immagini della crescita delle cellule batteriche ogni 30 minuti, con la telecamera scientifica complementare a semiconduttore di ossido di metallo. Le vescicole giganti contenenti cellule batteriche in genere variano da 10 a 30 micrometri. Per entrambe le dimensioni delle vescicole giganti, le cellule E.coli subiscono processi di allungamento e divisione, con alcune cellule E.coli che crescono fino a raggiungere un numero molto elevato di cellule durante il periodo di osservazione di sei ore.La frequenza relativa delle vescicole giganti contenenti un singolo livello cellulare è circa il 10% delle vescicole giganti ottenute, e le vescicole giganti incapsulate a livello di singola cellula sono circa il 50% delle vescicole giganti contenenti cellule batteriche. La stabilità dell'interfaccia olio-acqua è importante per ottenere vescicole giganti contenenti cellule batteriche. Fare attenzione ad aspirare l'olio con attenzione prima della correzione gigante della vescicola.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di singole vescicole giganti. Il nostro metodo di coltura batterica è un nuovo strumento in microbiologia per coltivare batteri ambientali sconosciuti per ottenere o analizzare i loro prodotti metabolici.

Research

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