Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en ledende initiativ for Excellent unge forskere (LEADER, no. 16812285) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan, en Grant-in-Aid for unge forsker forskning (nr. 18K18157, 16K21034) fra Japan Society for fremme av Science (JSP) til M.M., og Grant-in-Aid fra MEXT til K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).

1. utarbeidelse av GVs som inneholder bakterielle celler av dråpe overføringsmetoden
<ol><li>Forbered lipid lager løsninger på 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) og 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleneglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) i kloroform/ løsningen (2/1, v/v) og lagre aksjen ved-20 ° c.</li>
	<li>Fremstilling av en lipid-inneholdende olje løsning
	<ol>
<li>Hell 20 μL av POPC-løsningen og 4 μL av bioti...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Her beskriver vi en metode for dyrking av bakterieceller på enkelt cellenivå inne i GVs. Denne enkle metoden innebærer forming GVs inneholder bakterielle celler på enkelt cellenivå ved hjelp av dråpe overføringsmetoden. Sammenlignet med andre tilnærminger for å skaffe GVs som inneholder bakterieceller, har denne metoden to fordeler: (i) det er lett å utvikle seg, og (II) et lite volum (2 μL) av prøve løsningen er nødvendig for å klargjøre GVs. Dråpe overføringsmetoden20 for frems...

Kulturen av bakterielle celler på ett cellenivå har fått økende oppmerksomhet. Dyrking bakterieceller på enkelt cellenivå inne i et trangt sted kan belyse bakterie funksjoner som fenotypiske variasjon1,2,3,4, celle adferd5, 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9, og antibiotikaresistens10,11. På grunn av nylige fremskritt innen kultur teknikker, kan kulturen i enkelt bakterier oppnås inne i et trangt sted, for eksempel i en brønn-chip4,7,8, gel dråpe12,13 og vann-i-olje (W/O) dråpe5,11. For å fremme forståelse eller utnyttelse av enkelt bakterielle celler, er ytterligere tekniske utviklingen av dyrking teknikker nødvendig.
Blemmer som etterligner den biologiske cellemembranen er sfæriske avdelinger bestående av amfifile molekyler og kan holde ulike materialer. Blemmer er klassifisert i henhold til størrelse og inkluderer små blemmer (SVs, diameter < 100 NM), store blemmer (LVs, < 1 μm), og gigantiske blemmer (GVs, > 1 μm). SVs eller LVs brukes ofte som legemiddel bærere på grunn av deres affinitet til den biologiske cellemembranen14. GVs har også blitt brukt som en reaktor system for bygging av protocells15 eller kunstige-celler16. Innkapsling av biologiske celler i GVs har blitt rapportert17,18, og dermed GVs vise potensial som en cellekultur system kombinert med reaktoren systemet.
Her, sammen med en video av eksperimentelle prosedyrer, beskriver vi hvordan GVs kan brukes som romanen celle-kultur fartøy19. GVs inneholdende bakterier ble gjort av dråpe overføringsmetoden20 og ble deretter immobilisert på en støttet membran på et dekkglass. Vi brukte dette systemet til å observere bakteriell vekst på single-cellenivå inne GVs i sanntid.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

Vi utviklet en metode for å dyrking bakterieceller på enkelt cellenivå inne gigantiske blemmer (GVs). Bakteriell cellekultur er viktig for å forstå funksjonen av bakterielle celler i det naturlige miljøet. På grunn av teknologiske fremskritt, kan ulike bakterielle celle funksjoner bli avslørt på enkelt cellenivå inne i et trangt sted. GVs er sfæriske mikro-sized avdelinger bestående av amfifile lipid molekyler og kan holde ulike materialer, inkludert celler. I denne studien, en enkelt bakteriell celle ble innkapslet i 10-30 μm GVs av dråpe overføringsmetoden og GVs inneholder bakterielle celler ble immobilisert på en støttet membran på et glass substrat. Vår metode er nyttig for å observere sann tids veksten av enkelt bakterier inne i GVs. Vi kultivert Escherichia coli (E. coli) celler som en modell inni GVs, men denne metoden kan tilpasses andre celletyper. Vår metode kan brukes i vitenskap og industrielle felt av mikrobiologi, biologi, bioteknologi og syntetisk biologi.

Vi presenterer en enkel metode for å generere GVs som inneholder enkelt bakterielle celler ved hjelp av dråpe overføringsmetoden (figur 1). Figur 1a viser et skjematisk bilde av nedbøren i GVs som inneholder bakterier. W/O dråper som inneholder bakterier er overført over olje-vann (lipid monolag) grensesnitt ved sentrifugering å danne GVs. Forskjellen i tetthet mellom sukrose (indre vandig løsning) og glukose (ytre vandig...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Bakteriell Cell kultur på single-cellenivå Inside Giant blemmer

Vi demonstrerer én cellekultur av bakterier inne gigantiske blemmer (GVs). GVs inneholdende bakterielle celler ble utarbeidet av dråpe overføringsmetoden og ble immobilisert på en støttet membran på et glass substrat for direkte observasjon av bakteriell vekst. Denne tilnærmingen kan også tilpasses andre celler.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Denne protokollen gir et middel for å kultere bakterielle celler på encellenivå inne i gigantiske vesikler. Det er lett å utvikle de gigantiske vesikler, og bare et svært lite volum prøveløsning er nødvendig for å forberede vesikler. Å demonstrere prosedyren vil være Yuri Ota, en ph.d.-kandidat fra laboratoriet vårt.Begynn med å legge til 20 mikroliter nylaget POPC-oppløsning og fire mikroliter nylaget biotin-PEG-DSPE-oppløsning til et hetteglass med glass. Fordampe det organiske løsningsmidlet ved luftstrøm til en lipidfilm dannes. Plasser filmen i en desiccator i en time for å fullstendig fordampe det organiske løsningsmidlet.Tilsett deretter 200 mikroliter mineralolje til hetteglasset. Dekk åpningen av hetteglasset med plastparafinfilm, og sonikere hetteglassinnholdet i et ultralydbad på 120 watt i minst en time. For et lite vesikkelpreparat, lag en lipidfilm, som nettopp demonstrert, og legg til 200 mikroliter med 200 millimeter glukose i LB medium til filmen.Deretter sonikere filmen på 120 watt i minst en time, etterfulgt av ekstrudering av de resulterende gigantiske vesikler i små vesikler ved hjelp av en mini ekstruder og en polykarbonatmembran med en 100-nanometer porestørrelse. For bakteriell celle pre-kultur, inokulere E.coli fra en LB plate til milliliter lb medium for en overnatting kultur på 37 grader Celsius. Neste morgen, overføre 20 mikroliter av kulturens supernatant til 1,98 milliliter frisk LB medium for ytterligere to timer med kultur.På slutten av inkubasjonen, sjekk den optiske tettheten på 600 nanometer, eller OD 600 verdi, av pre-kultur løsningen på et spektrofotometer. En pre-kultur løsning med en OD 600 av en til 1,5 bør brukes. Bland deretter førkulturløsningen med nylaget sukroseløsning og frisk LB-medium, ifølge tabell én.For gigantisk vesikkeldannelse, tilsett 50 mikroliter av en nylaget ytre vandig løsning av gigantiske vesikler til et 1,5 milliliter lokket plastrør. Lag forsiktig 150 mikroliter av den lipidholdige oljeløsningen over den ytre vandige løsningen av gigantiske vesikler. Inkuber den resulterende løsningen i 10 til 15 minutter ved romtemperatur, før du kontrollerer for å sikre at grensesnittet til olje- og vandige løsninger er flatt.For vann- og oljebakteriellcelle som inneholder dråpedannelse, tilsett to mikroliter av en nylaget indre vandig løsning av gigantiske vesikler til 50 mikroliter av den sonikerte lipidholdige oljeoppløsningen i et 0,6 milliliter lokket plastrør. Deretter trykker du på røret for å emulgere de to komponentene. Deretter bruker du en pipette til å tilsette 50 mikroliter vann- og oljedråpeløsning til grensesnittet til oljen og vandig løsning, og sedimenterer bakteriecelleholdige gigantiske vesikler ved sentrifugering.Deretter aspirerer det øverste oljelaget og samler de gigantiske vesikler. For å forberede et håndlaget kammer, bore en syv millimeter hull med en hul punch på en 10 av 10 med en millimeter dobbel-faced segl, deretter lime dobbel-faced segl på en 30 av 40 millimeter cover glass. For å forberede en støttet tolagsmembran, legg til 30 mikroliter av den lille vesikkelløsningen til hullet i det håndlagde kammeret.Inkuber vesikler ved romtemperatur i 30 minutter. På slutten av inkubasjonen, vask forsiktig hullet to ganger med 20 mikroliter LB medium, supplert med 200 millimiller glukose. For å immobilisere gigantiske vesikler på supporterens tolagsmembran, introdusere 10 mikroliter neutravidin i ytre vandig gigantisk vesikkelløsning til hullet i en 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen, vask forsiktig hullet to ganger med 20 mikroliter LB medium, supplert med 200 millimiller glukose, og legg hele volumet av gigantisk vesikkelløsning til hullet i kammeret. Tet deretter hullet med et 18 med 18 millimeter dekkglass. For å overvåke bakteriell vekst i de gigantiske vesikler, velg 40X målet på et invertert mikroskop, og plasser kammeret på mikroskopet varmetrinn system.Inkuber deretter bakteriecelleholdige gigantiske vesikler i kammeret under statiske forhold i seks timer ved 37 grader Celsius, og ta og ta opp bilder av bakteriecelleveksten hvert 30. Gigantiske vesikler som inneholder bakterielle celler varierer vanligvis i størrelse fra 10 til 30 mikrometer. For begge størrelser av gigantiske vesikler gjennomgår E.coli-cellene forlengelses- og divisjonsprosesser, med noen E.coli-celler som vokser til et svært stort antall celler i løpet av den seks timers observasjonsperioden.Den relative frekvensen av gigantiske vesikler som inneholder et enkeltcellenivå er omtrent 10% av de oppnådde gigantiske vesikler, og de gigantiske vesikler innkapslet på enkeltcellenivå er ca 50% av de gigantiske vesikler som inneholder bakterielle celler. Stabiliteten i olje-vann-grensesnittet er viktig for å oppnå gigantiske vesikler som inneholder bakterielle celler. Vær forsiktig med å aspirere oljen forsiktig før den gigantiske vesikkelkorreksjonen.Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du dyrker bakterielle celler på enkeltcellenivå i individuelle gigantiske vesikler. Vår bakterielle kulturmetode er et nytt verktøy i mikrobiologi for å dyrke ukjente miljøbakterier for å oppnå eller analysere sine metabolske produkter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Utbredelsen av<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Vurdering av bakterieinvasjon av hjerteceller i kultur og hjertekolonisering hos infiserte mus ved hjelp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utvikling og identifikasjon av en Novel undergruppe av menneskelige nøytrofilmedierte avledet Giant Fagocytter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Kvantifisering av intracellulær vekst i makrofager er en rask og pålitelig metode for å vurdere virulens av Leishmania parasitter

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Bruke en bakteriell patogen Probe for mobilnettet og Organismic-nivå vert svar

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolering av enkelt intracellulær bakteriell samfunn generert fra en Murine modell av urinveisinfeksjon for nedstrøms encellede analyse

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Elektrofysiologisk innspillinger av single-Cell ion strømninger under godt definert skjær stress

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...