Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Эта работа была поддержана ведущей инициативой для превосходных молодых исследователей (ЛИДЕР, No 16812285) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT) Японии, Грант-в-помощь для молодых ученых исследований (No 18K18157, 16K21034) от Японского общества содействия науке (JSPS) до M.M., и Грант-в-помощи от MEXT до K.K. (No 17H06417, 17H06413).

1. Подготовка ГВ, содержащих бактериальные клетки методом передачи капель
<ol><li>Подготовка липидных стоковых растворов 1-пальмитоила-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфохолин (POPC, 10 мМ, 1 мл) и 1,2-дистеэроил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Н-биотиниол (полиэтиленегликоль) -2000" (биотин-ПЕГ-ДСПЕ, 0,1 мм, 1 мл) ?...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Здесь мы описываем метод культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри ГВ. Этот простой метод включает в себя формирование ГВ, содержащих бактериальные клетки на одноклеточном уровне с помощью метода передачи капель. По сравнению с другими подходами к получению...

Культура бактериальных клеток на одноклеточном уровне получила все большее внимание. Культирование бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри ограниченного пространства может выяснить бактериальные функции, такие как фенотипическая изменчивость1,2,3,поведениеклеток5, 6 , 7 (г. , 8 , 9, и устойчивость к антибиотикам10,11. Из-за последних достижений в области техники культуры, культура отдельных бактерий может быть достигнута внутри ограниченного пространства, например, в хорошо чип4,7,8, гель капли12,13 , и вода в масле (W / O) капля5,11. Для содействия пониманию или использованию отдельных бактериальных клеток необходимы дальнейшие технические разработки методов выращивания.
Везикулы, имитирующие мембрану биологических клеток, представляют сферические отсеки, состоящие из амфифильных молекул, и могут содержать различные материалы. Везикулы классифицируются в зависимости от размера и включают в себя небольшие пузырьки (SVs, диаметр йlt; 100 нм), большие пузырьки (LVs, lt;1 мкм), и гигантские пузырьки (GVs, SVs или LVs обыкновенно использованы как несущие снадобья из-за их сродства к биологической мембране клетки14. GVs также были использованы в качестве реакторной системы для строительства протоэлементов15 или искусственных клеток16. Инкапсуляция биологических клеток в GVs было сообщено17,18, и, таким образом, GVs показать потенциал в качестве системы клеточной культуры в сочетании с реакторной системой.
Здесь, наряду с видео экспериментальных процедур, мы описываем, как GVs могут быть использованы в качестве новых сосудов клеточной культуры19. GVs, содержащие бактерии были сделаны методом передачи капель20, а затем обездвижены на поддерживаемой мембране на крышке стекла. Мы использовали эту систему для наблюдения за ростом бактерий на одноклеточном уровне внутри ГВ в режиме реального времени.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

Мы разработали метод культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков (ГВ). Культура бактериальных клеток важна для понимания функции бактериальных клеток в естественной среде. Из-за технологических достижений, различные бактериальные функции клеток могут быть выявлены на одноклеточном уровне внутри ограниченного пространства. GVs представляют сферические микроразмерные отсеки, состоящие из амфифильных липидных молекул и могут содержать различные материалы, в том числе клетки. В этом исследовании, одна бактериальная клетка была инкапсулирована в 10-30 мкм GVs методом передачи капель и GVs, содержащие бактериальные клетки были обездвижены на поддерживаемой мембране на стеклянном субстрате. Наш метод полезен для наблюдения за ростом в реальном времени отдельных бактерий внутри ГВ. Мы культивировали клетки Escherichia coli (E.coli)в качестве модели внутри GV, но этот метод можно адаптировать к другим типам клеток. Наш метод может быть использован в научно-промышленных областях микробиологии, биологии, биотехнологии и синтетической биологии.

Мы представляем простой метод для генерации ГВ, содержащих отдельные бактериальные клетки с помощью метода передачи капель(рисунок 1). На рисунке 1а показано схематическое изображение осадков ГВ, содержащих бактерии. W / O капель, содержа...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Бактериальная культура клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков

Мы демонстрируем одноклеточную культуру бактерий внутри гигантских пузырьков (ГВ). ГВ, содержащие бактериальные клетки, были подготовлены методом передачи капель и были обездвижены на поддерживаемой мембране на стеклянном субстрате для прямого наблюдения за бактериальным ростом. Этот подход также может быть адаптирован к другим клеткам.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Этот протокол предоставляет средства для культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков. Это легко разработать гигантские пузырьки, и только очень небольшой объем образца раствора требуется для подготовки пузырьков. Демонстрацией процедуры будет кандидат медицинских наук из нашей лаборатории, кандидат медицинских наук, доктор медицинских наук,Начните с добавления 20 микролитров свежеприготовленного раствора POPC и четырех микролитров свежеприготовленного раствора биотин-PEG-DSPE в стеклянный флакон. Испарять органический растворитель потоком воздуха до формирования липидной пленки. Поместите пленку в децикатор в течение одного часа, чтобы полностью испарять органический растворитель.Затем добавьте в флакон 200 микролитров минерального масла. Обложка открытия флакона с пластиковой парафиновой пленкой, и sonicate содержимое флакона в ультразвуковой ванне на 120 Вт, по крайней мере один час. Для небольшой подготовки пузырьков создайте липидную пленку, как только что продемонстрировано, и добавьте к пленке 200 микролитров глюкозы 200 миллиметров глюкозы в среде LB.Затем sonicate пленки на 120 Вт, по крайней мере час, а затем экструзии в результате гигантских пузырьков в небольших пузырьков с помощью мини экструдера и поликарбонатной мембраны с 100-нанометровой поры размера. Для бактериальных клеток до культуры, привить E.coli из пластины LB в миллилитров LB среды для ночной культуры при 37 градусов по Цельсию. На следующее утро перенесите 20 микролитров супернатанта культуры на 1,98 миллилитров свежей среды LB еще на два часа культуры.В конце инкубации проверьте оптическую плотность на 600 нанометров, или значение OD 600, до культурного раствора на спектрофотометре. Следует использовать до культурное решение с OD 600 от одного до 1,5. Затем смешайте предварительное решение с свежеприготовленным раствором сахарозы и свежей средой LB, согласно таблице 1.Для формирования гигантских пузырьков добавьте 50 микролитров свежеприготовленного внешнего акуса раствора гигантских пузырьков в 1,5 миллилитровую пластиковую трубку. Аккуратно слой 150 микролитров липидсодержащего раствора масла над внешним aqueous раствором гигантских пузырьков. Инкубировать полученный раствор в течение 10-15 минут при комнатной температуре, прежде чем проверить, что интерфейс масла и aqueous решения плоские.Для воды и масла бактериальной клетки, содержащей образование капель, добавьте два микролитера свежеприготовленного внутреннего акального раствора гигантских пузырьков в 50 микролитров звукового липидосодержащего раствора масла в 0,6 миллилитровую пластиковую трубку. Затем коснитесь трубки, чтобы эмульгировать два компонента. Далее используйте пипетку, чтобы добавить 50 микролитров раствора капли воды и масла к интерфейсу масла и аквозного раствора, и отсадить бактериальные клетки, содержащие гигантские пузырьки центрифугации.Затем аспирировать верхний слой масла и собирать гигантские пузырьки. Чтобы подготовить камеру ручной работы, просверлите семимиллиметровое отверстие с полым пуншом на 10 на 10 на один миллиметр двулицый уплотнитель, а затем вставьте двулицую печать на стекло крышки размером 30 на 40 миллиметров. Чтобы подготовить поддерживаемую двухслойную мембрану, добавьте 30 микролитров раствора маленького везикула в отверстие камеры ручной работы.Инкубировать пузырьки при комнатной температуре в течение 30 минут. В конце инкубации, аккуратно мыть отверстие два раза с 20 микролитров LB среды, дополняется 200 миллимиллер глюкозы. Чтобы обездвижить гигантские пузырьки на поддержке двухслойной мембраны, ввейте 10 микролитров нейтравлина во внешнемтельном растворе гигантских пузырьков в отверстие для 15-минутной инкубации при комнатной температуре.В конце инкубации аккуратно промыть отверстие два раза с помощью 20 микролитров среды LB, дополненных глюкозой 200 миллимиллеров, и добавить весь объем раствора гигантских пузырьков в отверстие в камере. Затем запечатайте отверстие стеклом крышки размером 18 на 18 миллиметров. Для мониторинга роста бактерий в гигантских пузырьках выберите цель 40X на перевернутом микроскопе и поместите камеру на систему нагрева микроскопа.Затем инкубировать бактериальные клетки, содержащие гигантские пузырьки в камере в статических условиях в течение шести часов при 37 градусах по Цельсию, захвата и записи изображений роста бактериальных клеток каждые 30 минут, с научной дополнительной полупроводниковой камеры оксида металла. Гигантские пузырьки, содержащие бактериальные клетки, как правило, варьируются в размерах от 10 до 30 микрометров. Для обоих размеров гигантских пузырьков, клетки E.coli проходят процессы удлинения и деления, при этом некоторые клетки E.coli растут до очень большого количества клеток в течение шести часов периода наблюдения.Относительная частота гигантских пузырьков, содержащих один уровень клеток, составляет примерно 10% от полученных гигантских пузырьков, а гигантские пузырьки, инкапсулированные на уровне одной клетки, составляют примерно 50% гигантских пузырьков, содержащих бактериальные клетки. Стабильность масляно-водяного интерфейса важна для получения гигантских пузырьков, содержащих бактериальные клетки. Позаботьтесь, чтобы аспирировать масло тщательно до гигантской коррекции пузырьков.После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как культура бактериальных клеток на уровне одной клетки в отдельных гигантских пузырьков. Наш метод бактериальной культуры является новым инструментом в микробиологии для культивирования неизвестных экологических бактерий для получения или анализа их метаболических продуктов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Распространение<em&gt; Homalodisca coagulata вирус-01</em&gt; Через<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Культура клеток

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Оценка бактериального вторжения сердечных клеток в культуре и колонизации сердца у инфицированных мышей с использованием листерий моноцитогенов

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Разработка и идентификация романа субпопуляции человеческого нейтрофилами производного Giant фагоцитов<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Использование бактериальных патогенов чтобы зонд для сотовых и организмический уровне принимающей ответов

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Изоляция одной внутриклеточных бактериальных сообществ, генерируется из мышиных модели инфекции мочевыводящих путей анализа течению одноклеточного

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Высок объём шигеллезом-конкретные бактерицидной Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Электрофизиологические записи одноклеточных ионных токов под четко определенным сдвигами

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...