Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett ledande initiativ för framstående unga forskare (LEADER, nr 16812285) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) i Japan, ett bidrag-in-Aid för ung forskare forskning (nr 18K18157, 16K21034) från Japan Society for främjande av vetenskap (JSPS) till M.M., och Grant-in-Aid från MEXT till KK (nr 17H06417, 17H06413).

1. beredning av GVs som innehåller bakterieceller med dropp överföringsmetoden
<ol><li>Förbered lipidstockslösningar av 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC, 10 mM, 1 mL) och 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[biotinyl (polyetyleneglykol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) i kloroform/ metanol lösning (2/1, v/v) och förvara beståndet vid-20 ° c.</li>
	<li>Beredning av en lipidinnehållande oljelösning
	<ol>
<li>Häll 20 μL av POPC-lösningen och 4 μL av biotin-P...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Här beskriver vi en metod för odling av bakterieceller på encellsnivå inuti GVs. Denna enkla metod innebär att bilda GVS som innehåller bakterieceller på Single-cellnivå med hjälp av DROPP överföringsmetod. Jämfört med andra metoder för att erhålla GVs som innehåller bakterieceller, har denna metod två fördelar: (i) det är lätt att utveckla, och (II) en liten volym (2 μL) av provlösningen krävs för att förbereda GVs. DROPP överföringsmetoden20 för beredning av GVS som i...

Kulturen i bakterieceller på encellig nivå har fått ökad uppmärksamhet. Odling av bakterieceller på encellig nivå inuti ett trångt utrymme kan belysa bakteriella funktioner såsom fenotypisk variabilitet1,2,3,4, cell Behavior5, 6 , 7 , 8 , 9, och antibiotikaresistens10,11. På grund av de senaste framstegen inom kultur teknik, kan kulturen av enstaka bakterier uppnås i ett trångt utrymme, såsom i en väl chip4,7,8, gel dropp12,13 , och vatten-i-olja (W/O) DROPP5,11. För att främja förståelsen eller utnyttjandet av enstaka bakterieceller behövs ytterligare teknisk utveckling av odlingstekniker.
Vesikler som imiterar det biologiska cellmembranet är sfäriska fack som består av amfifila molekyler och kan hålla olika material. Vesiklarna klassificeras efter storlek och omfattar små blåsor (SVs, diameter < 100 nm), stora vesikler (LVs, < 1 μm) och jätte blåsor (GVs, > 1 μm). SVs eller LVs används ofta som drog bärare på grund av deras affinitet till det biologiska cellmembranet14. GVs har också använts som ett reaktorsystem för byggande av protoceller15 eller konstgjorda-celler16. Inkapsling av biologiska celler i GVS har rapporterats17,18, och därmed GVS Visa potential som ett cellkultursystem i kombination med reaktor systemet.
Här, tillsammans med en video av experimentella procedurer, beskriver vi hur GVs kan användas som nya cell-kultur fartyg19. GVs innehållande bakterier gjordes av DROPP överföringsmetoden20 och immobiliserades sedan på ett membran som stöds på ett täckglas. Vi använde detta system för att observera bakterietillväxt på Single-cellnivå inuti GVs i realtid.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

Vi utvecklade en metod för odling av bakterieceller på encellig nivå inuti Giant blåsor (GVS). Bakteriell cellkultur är viktigt för att förstå funktionen hos bakterieceller i den naturliga miljön. På grund av tekniska framsteg, olika bakteriella cellfunktioner kan avslöjas på encellig nivå inuti ett trångt utrymme. GVS är sfäriska mikro-stora fack består av amfifila lipid molekyler och kan hålla olika material, inklusive celler. I denna studie var en enda bakteriecell inkapslad i 10 – 30 μm GVs av DROPP metoden och GVs som innehöll bakterieceller immobiliserades på ett membran som stöds på ett glas substrat. Vår metod är användbar för att observera realtids-tillväxten av enstaka bakterier inuti GVs. Vi odlade Escherichia coli (E. coli) celler som en modell inuti GVS, men denna metod kan anpassas till andra celltyper. Vår metod kan användas inom vetenskap och industriella områden inom mikrobiologi, biologi, bioteknik och syntetisk biologi.

Vi presenterar en enkel metod för att generera GVs som innehåller enstaka bakterieceller med hjälp av DROPP överföringsmetoden (figur 1). Figur 1a visar en schematisk bild av utfällningen av GVS som innehåller bakterier. W/O droppar som innehåller bakterier överförs över olje-vatten (lipidmonolayer) gränssnitt genom centrifugering att bilda GVs. Skillnaden i densitet mellan sackaros (inre vattenlösning) och glukos (y...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Bakteriell cellkultur på Single-cell nivå inuti Giant vesicles

Vi demonstrerar encellig kultur av bakterier inuti jätte blåsor (GVs). GVs som innehåller bakterieceller bereddes av DROPP överföringsmetoden och immobiliserades på ett membran som stöds på ett glas substrat för direkt observation av bakterietillväxt. Den här metoden kan också vara anpassningsbar till andra celler.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Detta protokoll ger ett medel för odling av bakterieceller på encellsnivå inuti jätteblåsor. Det är lätt att utveckla jätteblåsorna, och endast en mycket liten volym provlösning krävs för att förbereda vesiklarna. Demonstrera förfarandet kommer att Yuri Ota, en doktorand från vårt laboratorium.Börja med att lägga till 20 mikroliter av nyberedda POPC-lösning och fyra mikroliter av nyberedda biotin-PEG-DSPE lösning till en glasflaska. Avdunsta det organiska lösningsmedlet genom luftflöde tills en lipidfilm bildas. Placera filmen i en exsiccator i en timme för att helt avdunsta det organiska lösningsmedlet.Tillsätt sedan 200 mikroliter mineralolja till injektionsflaskan. Täck öppningen av injektionsflaskan med plast paraffin film, och sonikera injektionsflaskan innehållet i ett ultraljud bad på 120 watt i minst en timme. För en liten vesikel förberedelse, skapa en lipidfilm, som just visat, och lägga till 200 mikroliter av 200 millimeter glukos i LB medium till filmen.Sedan sonikera filmen på 120 watt i minst en timme, följt av extrudering av de resulterande jätteblåsorna i små vesiklar med hjälp av en mini extruder och ett polykarbonatmembran med en 100-nanometer porstorlek. För bakterieceller pre-kultur, inokulera E.coli från en LB-platta i milliliter av LB medium för en övernattning kultur vid 37 grader Celsius. Nästa morgon, överföra 20 mikroliter av kulturens supernatant till 1,98 milliliter färskt LB medium för ytterligare två timmars kultur.Kontrollera vid inkubationens den optiska densiteten vid 600 nanometer, eller OD 600-värdet, för förkulturlösningen på en spektrofotometer. En pre-culture lösning med en OD 600 av en till 1,5 bör användas. Blanda sedan förkulturlösningen med nyberedd sackaroslösning och färskt LB-medium, enligt tabell ett.För jätte vesikelbildning, tillsätt 50 mikroliter av en nyberedd yttre vattenlösning av jätteblåsiklar till en 1,5 milliliter lidded plaströr. Försiktigt lager 150 mikroliter av lipid-innehållande oljelösningen över den yttre vattenhaltiga lösningen av jätte vesiklar. Inkubera den resulterande lösningen i 10 till 15 minuter i rumstemperatur, innan du kontrollerar för att säkerställa att gränssnittet för oljan och vattenlösningar är platt.För vatten och olja bakterieceller som innehåller droppbildning, tillsätt två mikroliter av en nyberedda inre vattenlösning av jätte vesiklar till 50 mikroliter av sonicated lipid-innehållande oljelösning i en 0,6 milliliter lidded plaströr. Sedan trycker du på röret för att emulgera de två komponenterna. Därefter använder en pipettering för att lägga till 50 mikroliter vatten och oljedroppar lösning till gränssnittet för olja och vattenlösning, och sediment den bakteriella cell-innehållande jätte vesicles genom centrifugeringen.Därefter aspirera det översta oljelagret och samla de jättelika vesiklarna. För att förbereda en handgjord kammare, borra ett sju millimeters hål med ett ihåligt hål på en 10 gånger 10 gånger en millimeter dubbel-faced tätning, sedan klistra in dubbel-faced tätning på en 30 av 40 millimeter täckglas. För att förbereda ett stöds bi-lager membran, tillsätt 30 mikroliter av den lilla vesikellösning till hålet i den handgjorda kammaren.Inkubera vesiklarna i rumstemperatur i 30 minuter. I slutet av inkubationen, försiktigt tvätta hålet två gånger med 20 mikroliter lb medium, kompletterat med 200 millimiller glukos. För att immobilisera jätte vesiklar på supporter bi-lager membran, införa 10 mikroliter av neutravidin i yttre vattenhaltiga jätte vesikel lösning till hålet för en 15 minuters inkubation vid rumstemperatur.I slutet av inkubationen, tvätta försiktigt hålet två gånger med 20 mikroliter lb medium, kompletterat med 200 millimiller glukos, och tillsätt hela volymen av jätte vesikellösning till hålet i kammaren. Sedan försegla hålet med en 18 med 18 millimeter täckglas. För att övervaka bakterietillväxt inom jätteblåsorna väljer du 40X-målet på ett inverterat mikroskop och placerar kammaren på mikroskopets värmestegssystem.Sedan inkubera den bakteriella cell-innehållande jätte vesicles i kammaren under statiska förhållanden i sex timmar vid 37 grader Celsius, fånga och spela in bilder av bakteriecelltillväxt var 30 minuter, med den vetenskapliga kompletterande metalloxid halvledarkamera. Jätteblåsor som innehåller bakterieceller varierar vanligtvis i storlek från 10 till 30 mikrometer. För båda storlekarna av jätte vesiklar, E.coli cellerna genomgår töjning och division processer, med vissa E.coli celler växer till ett mycket stort antal celler under sex timmars observationsperioden.Den relativa frekvensen av jätteblåsor som innehåller en encellig nivå är cirka 10%av de erhållna jätteblåsiklarna, och de jätteblåsiklar som är inkapslade på encellsnivå är cirka 50%av de jätteblåsiklar som innehåller bakterieceller. Stabiliteten i olje-vatten gränssnittet är viktigt för att få jätte vesiklar som innehåller bakterieceller. Var noga med att aspirera oljan försiktigt innan den gigantiska vesikelkorrigeringen.Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man odlar bakterieceller på encellsnivå inom enskilda jätteblåsor. Vår bakteriekulturmetod är ett nytt verktyg inom mikrobiologi för att odla okända miljöbakterier för att få eller analysera deras metaboliska produkter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Förökning av<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Bedömning av bakteriell invasion av hjärtceller i kultur och hjärtkolonisering hos infekterade möss med hjälp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Utveckling och identifieringen av en ny underpopulation av humant neutrofilt härrörande Giant fagocyter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Kvantifiering av intracellulära tillväxt inuti makrofager är en snabb och tillförlitlig metod för att bedöma virulens Leishmania parasiter

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifiering av Efferocytosis av Single-cell fluorescensmikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Med en bakterie patogen att sonden för cellulär och organismnivå-nivå värd Svaren

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

Isolering av enda intracellulära bakteriella samhällen som genereras från en murin modell av urinvägsinfektion för nedströms Single-cell analys

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Elektrofysiologiska inspelningar av encellig Jon strömmar under väldefinierad skjuvning stress

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...