Name: bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Bu çalışma, Japonya 'nın eğitim, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT) Bakanlığından mükemmel genç araştırmacılar (lıder, No. 16812285) için önde gelen bir girişim tarafından destekleniyordu (No. 18K18157, 16K21034) genç bilim adamı araştırmaları için hibe-in-Aid Japonya 'dan m. ' ye bilim (JSPS) tanıtımı için ve MEXT 'den K.K. 'ye (No. 17H06417, 17H06413) Grant-ın-Aid.

1. droplet transfer yöntemi ile bakteriyel hücreler Içeren GVs hazırlanması
<ol><li>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-gliserin-3-fosfokolin lipid stok çözümleri hazırlayın (POPC, 10 mM, 1 mL) ve 1, 2-distearoyl-sn-gliserol-3-fosfoetolin-N-[biotinyl (polileneglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) kloroform/ Metanol çözeltisi (2/1, v/v) ve stokları-20 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Lipid içeren yağ çözeltisi hazırlanması
	<ol>
<li>20 μL POPC çözeltisi ve 4 μL biotin-PEG-DSPE solüsyonu...

<ol>
	<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene.">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li><li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li><li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits.">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations.">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li><li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability.">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li><li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing:+cell-to-cell+communication+in+bacteria.">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li><li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells.">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+growth+of+Escherichia+coli.">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li><li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli.">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch.">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li><li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+From+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li><li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesizing+life.">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells,+proteins,+and+microbeads+in+lipid+vesicles.">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li><li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique.">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li><li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles:+a+novel+tool+for+bacterial+cultures.">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution,+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential.">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li><li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar.">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li><li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles.">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li><li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells.">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li><li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane.">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors.">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024 (2018).</li><li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules.">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564 (2018).</li></ol>

Burada, biz GVs içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit yöntem, damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturma içerir. Bakteriyel hücreler içeren GVs almak için diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yöntem iki avantajı vardır: (i) geliştirmek kolaydır, ve (ii) örnek çözümün küçük bir hacmi (2 μL) GVs hazırlamak için gereklidir. Bakteriyel hücreler içeren...

Tek hücreli düzeyde bakteriyel hücrelerin kültürü artan ilgi aldı. Sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreleri kültür fenotip değişkenlik1,2,3,4, hücre davranışı5gibi bakteriyel fonksiyonları aydınlatmak olabilir, 6 , 7 , 8 , 9ve antibiyotik direnci10,11. Kültür tekniklerindeki son gelişmeler nedeniyle, tek bakterilerin kültürü, bir iyi çip4,7,8, jel damlacık12,13 gibi kapalı bir alanda elde edilebilir ve yağ içinde su (W/O) damlacık5,11. Tek bakteriyel hücrelerin anlayış veya kullanımını teşvik etmek için, yetiştirme tekniklerinin daha fazla teknik gelişimi gereklidir.
Biyolojik hücre membranı taklit eden veziküller, amphiphilik moleküllerden oluşan küresel bölmeler olup çeşitli materyalleri tutabilir. Veziküller boyutuna göre sınıflandırılır ve küçük veziküller (SVs, çapı < 100 Nm), büyük veziküller (LVs, < 1 μm) ve dev veziküller (GVs, > 1 μm) içerir. SVs veya LVs yaygın olarak biyolojik hücre membranı14için kendi yakınlık nedeniyle uyuşturucu taşıyıcıları olarak kullanılır. GVS Ayrıca belirleyebiliyorlar15 veya suni hücreler16inşası için bir reaktör sistemi olarak kullanılmıştır. Biyolojik hücrelerin GVS içine kapsülleme,17,18bildirilmiştir ve böylece reaktör sistemi ile kombine edildiğinde bir hücre kültürü sistemi olarak potansiyel GVS göstermek.
Burada, deneysel prosedürler bir video ile birlikte, biz nasıl GVs yeni hücre kültürü gemiler olarak kullanılabilir tarif19. Bakteriler içeren GVs damlacık transfer yöntemi20 tarafından yapılmıştır ve daha sonra bir kapak camında desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bu sistemi, gerçek zamanlı olarak GVs içindeki tek hücreli seviyede bakteriyel büyümesini gözlemlemek için kullandık.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bactotryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>032-21921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (18 &#215; 18 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>C018181</td>
			<td>thickness 0.13&#8211;0.17 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (30 &#215; 40 mm)</td>
			<td>Matsunami Glass Ind.</td>
			<td>custom-order</td>
			<td>thickness 0.25&#8211;0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>Hi-Tech Co.</td>
			<td>ATT101</td>
			<td>swing rotor type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-faced seal (10 &#215; 10 &#215; 1 mm)</td>
			<td>Nitoms</td>
			<td>T4613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>6-306-01</td>
			<td>Durham fermentation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>133-16771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic heating stage system</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TP-110R-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>23334-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUCPLFLN 40&#215;/0.6 NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membranes</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610005</td>
			<td>pore size 100 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2 plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>191-01665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako Pure Chemicals</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ASU-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Watson</td>
			<td>130-806C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL lidded plastic tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co.</td>
			<td>MS4265-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000]</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880129P</td>
			<td>Biotin-PEG-DSPE</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial cell culture at the single-cell level inside giant vesicles

Biz dev veziküller (GVs) içinde tek hücreli düzeyde bakteriyel hücreler kültür için bir yöntem geliştirdik. Bakteriyel hücre kültürü, doğal ortamda bakteriyel hücrelerin fonksiyonunu anlamak için önemlidir. Teknolojik gelişmeler nedeniyle, çeşitli bakteriyel hücre fonksiyonları sınırlı bir alan içinde tek hücreli düzeyde ortaya olabilir. GVs, amphiphilik lipid moleküllerinden oluşan küresel mikro boyutlu bölmeler ve hücreler de dahil olmak üzere çeşitli malzemeler tutabilir. Bu çalışmada, tek bir bakteriyel hücre, damlacık transfer yöntemi ile 10 – 30 μm GVs içine kapsüllenmiş ve bakteriyel hücreler içeren GVs cam substrat üzerinde desteklenen bir membran üzerinde immobilize edildi. Bizim yöntemi GVs içinde tek bakterilerin gerçek zamanlı büyüme gözlem için yararlıdır. Biz GVs içinde bir model olarak Escherichia coli (E. coli) hücreleri kültürlü, ama bu yöntem diğer hücre türlerine adapte edilebilir. Bizim yöntemi Mikrobiyoloji, biyoloji, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji bilim ve sanayi alanlarında kullanılabilir.

Damlacık Transfer yöntemini kullanarak tek bakteriyel hücreler içeren GVs oluşturmak için basit bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Şekil 1a bakteri Içeren GVS yağışında bir şematik görüntü gösterir. Bakteri içeren W/O damlacıkları yağ-su (lipid monolayer) arayüzünde santrifüjleme ile GVs oluşturmak için aktarılır. Sakaroz (iç sulu solüsyon) ve glikoz (dış sulu solüsyon) arasındaki yoğunlukta fark...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles at JoVE.com

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Dev veziküller Içinde tek hücreli seviyede bakteriyel hücre kültürü

Biz dev veziküller (GVs) içinde bakteri tek hücreli kültürü göstermektedir. Bakteriyel hücreler içeren GVs damlacık transfer yöntemi ile hazırlanmıştır ve bakteriyel büyüme doğrudan gözlem için bir cam substrat üzerinde desteklenen bir membran immobilize edildi. Bu yaklaşım, diğer hücrelere de uyarlanabilir.

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Bu protokol, dev veziküllerin içindeki tek hücreli seviyede bakteri hücrelerinin kültüre sayılmaması için bir araç sağlar. Dev vezikülleri geliştirmek kolaydır ve vezikülleri hazırlamak için çok küçük bir numune çözeltisi gereklidir. Prosedürü gösteren Yuri Ota, bizim laboratuvar bir doktora adayı olacaktır.Bir cam şişeye 20 mikrolitre taze hazırlanmış POPC çözeltisi ve dört mikrolitre taze hazırlanmış biotin-PEG-DSPE çözeltisi ekleyerek başlayın. Bir lipid film oluşana kadar hava akımı ile organik çözücü buharlaştırmak. Tamamen organik çözücü buharlaştırmak için bir saat için bir kurutucu film yerleştirin.Sonra şişeye 200 mikrolitre mineral yağ ekleyin. Plastik parafin film ile şişe nin açılış kapağı ve en az bir saat boyunca 120 watt bir ultrasonik banyoda şişe içeriğini sonicate. Küçük bir vezikül hazırlığı için, bir lipid film oluşturmak, sadece gösterildiği gibi, ve filme LB orta 200 milimetre lik glikoz 200 mikrolitre ekleyin.Daha sonra filmi en az bir saat boyunca 120 watt'ta sonicate, ardından ortaya çıkan dev veziküllerin mini ekstrüzyon ve 100 nanometre lik gözenek boyutuna sahip polikarbonat membran kullanarak küçük veziküllere ekstrüzyonu. Bakteri hücresi öncesi kültür için, 37 santigrat derece bir gecede kültür için LB orta mililitre içine bir LB plaka E.coli aşılamak. Ertesi sabah, kültürün süpernatant 20 mikrolitre aktarın 1.98 taze LB orta ek iki saat için.Kuluçka sonunda, optik yoğunluğu nu spektrofotometredeki kültür öncesi çözeltinin 600 nanometre veya OD 600 değerinde kontrol edin. 1 ile 1,5 arasında OD 600 ile kültür öncesi çözüm kullanılmalıdır. Daha sonra birinci masaya göre, kültür öncesi solüsyonu taze hazırlanmış sakaroz solüsyonu ve taze LB ortamı ile karıştırın.Dev vezikül oluşumu için, 1,5 mililitre kapaklı plastik tüp için dev veziküllerin taze hazırlanmış dış sulu çözelti50 mikrolitre ekleyin. Yavaşça dev veziküllerin dış sulu çözeltisi üzerinde lipid içeren yağ çözeltisi 150 mikrolitre katman. Yağ ve sulu çözeltilerin arabiriminin düz olduğundan emin olmak için kontrol etmeden önce, ortaya çıkan çözeltiyi oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.Damlacık oluşumu içeren su ve yağ bakteri hücresi için, 0,6 mililitrelik kapaklı plastik tüpte sonicated lipid içeren yağ çözeltisinin 50 mikrolitresine, dev veziküllerin taze hazırlanmış iç sulu çözeltisinin iki mikrolitresini ekleyin. Ardından, iki bileşeni emülgatörlük için tüpe dokunun. Daha sonra, yağ ve sulu çözelti arayüzüne 50 mikrolitre su ve yağ damlacık çözeltisi eklemek için bir pipet kullanın ve santrifüj ile bakteri hücresi içeren dev vezikülleri tortulayın.Sonra üst yağ tabakası aspire ve dev veziküller toplamak. El yapımı bir hazne hazırlamak için, 10'a 10'a 10'luk çift yüzlü bir mührü delin ve çift yüzlü mührü 30'a 40 milimetrelik kapak camı üzerine yapıştırın. Desteklenen bir iki katmanlı membran hazırlamak için, el yapımı oda deliğine küçük vezikül çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin.Vezikülleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, 200 milimiller glikoz ile desteklenen 20 mikrolitre LB orta ile deliği iki kez hafifçe yıkayın. Destekçi iki katmanlı membran üzerinde dev veziküller hareketsizleştirmek için, oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka için deliğe dış sulu dev vezikül çözeltisi neutravidin 10 mikrolitre tanıtmak.Kuluçka sonunda, yavaşça LB orta 20 mikrolitre ile iki kez delik yıkayın, 200 milimiller glikoz ile takviye, ve odasında deliğe dev vezikül çözeltisi tüm hacmi ekleyin. Sonra 18 tarafından 18 milimetrelik kapak camı ile delik mühür. Dev veziküller içindeki bakteri üremesini izlemek için ters mikroskoptaki 40X hedefini seçin ve odayı mikroskop ısıtma sahne sistemine yerleştirin.Daha sonra 37 santigrat derece statik koşullar altında oda içinde bakteri hücre içeren dev veziküller kuluçka, yakalama ve her 30 dakikada bir bakteri hücre büyüme görüntüleri kayıt, bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera ile. Bakteri hücreleri içeren dev veziküllerin boyutları genellikle 10 ila 30 mikrometre arasında değişir. Dev veziküllerin her iki boyutu için, E.coli hücreleri uzama ve bölünme süreçlerinden geçer, bazı E.coli hücreleri altı saatlik gözlem süresi boyunca çok sayıda hücreye büyürler.Tek hücre lisenini içeren dev veziküllerin göreceli sıklığı elde edilen dev veziküllerin yaklaşık %10'udur ve tek hücre düzeyinde kapsüllenmiş dev veziküller bakteri hücreleri içeren dev veziküllerin yaklaşık %50'sikadardır. Yağ-su arabiriminin stabilitesi bakteri hücreleri içeren dev veziküller elde etmek için önemlidir. Dev vezikül düzeltme önce dikkatle yağ aspire dikkat edin.Bu videoyu izledikten sonra, tek tek dev veziküller içinde tek hücre düzeyinde bakteri hücreleri kültür nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bakteri kültürü yöntemimiz, mikrobiyolojide bilinmeyen çevresel bakterilerin metabolik ürünlerini elde etmek veya analiz etmek için yeni bir araçtır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI&#39;nin Gelişimi ve Kimlik<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

İdrar yolu enfeksiyonu aşağı akım tek hücreli analiz için bir fare modelinden oluşturulan tek hücre içi bakteriyel toplulukların yalıtım

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Iyi tanımlanmış kayma stres altında tek hücreli Iyon akımları elektrofizyolojik kayıtlar

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...