Tekniske aspekt af automatiseret syntese og real-time Kinetic evaluering af [¹¹C] SNAP-7941

Carbon-11 radiomærkning gør det muligt at bruge små forbindelser til positronemissionstomografi eller PET uden at ændre molekylet. Dette er vigtigt for at undersøge receptor udtryk niveauer. Fordelen ved carbon-11 radiomærkning er, at vi kan bruge PET til direkte at evaluere SNAP's bindinger kinetik mod melanin-koncentreret hormon receptor i realtid.

SNAP som en melanin-koncentreret hormon receptor antagonist vil bidrage til en bedre forståelse af denne receptor og dens forbindelse med metaboliske tilstande som fedme og diabetes. Efflux transportører udtrykt ved blod - hjerne barrieren kan i væsentlig grad hæmme brugen af radioaktive lægemidler til centrale receptor udtryk billeddannelse. Derfor er det vigtigt at vurdere spor in vitro.

Den automatiserede radiosyntese af SNAP er bredt anvendelig for radioaktivt mærkede lav molekylvægt forbindelser med en let vurderes methylgruppe. Når etableret denne procedure kan tilpasses til andre forbindelser. Bistå i demonstrationen vil være senior ph.d.-studerende Sarah Pfaff og Theresa Balber.

For at begynde carbon-11 SNAP syntese oprettet en ren carbon-11 automatiseret syntese modul med de relevante reagenser og materialer. Start SNAP syntese processen på modulet computer, som vil begynde med systemkontrol og konditionering. Omkring 30 til 40 minutter før modulet vil være klar til C-11 levering, skal du vælge C-11 kuldioxid mål på cyklotron og starte strålen på 65 mikroampere.

Når modulet er klar til levering lukke det indre vindue og ydre dør. Bekræft, at CO2-fælden er afkølet til mindst 40 grader Celsius, og at metanfælden er begyndt at køle. Når cyklottronen har produceret omkring 120 gigabecquerel af C-11 CO2 klik OK i modulet software til at åbne stien fra målet gennem CO2 fælde.

På cyklotron computer begynde at levere C-11 CO2 til modulet. Overvåg aktivitetsoverførslen ved modulcomputeren, og sørg for, at den går videre til reduktion af CO2 til metan efter tre minutter. Overvåg processen, da den resulterende metan skylles til metanfælden og omdannes til methylidodid ved cirkulation gennem jodovnen.

I slutningen af omdannelsessekvensen skal du vente, da biprodukter skylles fra methyliddaksen til udstødningen og derefter bekræfter, at reaktoren er klar til at modtage aktivitet ved at klikke på OK. Overvåg systemet, da methylidodid frigives fra fælden, skylles gennem methyl triflate ovnen og fanget i reaktoren. Når aktiviteten i reaktorplaterne bekræfter, at fældefangst er afsluttet. Vent, mens reaktionsblandingen reagerer ved 75 grader Celsius i tre minutter.

Derefter overvåges systemet, da reaktionsblandingen afkøles til under 35 grader Celsius og slukkes med 1,5 milliliter vand. Overvåg systemet, når reaktionsblandingen indlæses i HPLC-injektionsløkken og sprøjtes ind i den halvforenelige HPLC-kolonne. Se UV- og gammadetektorspor som kromatografien fortsætter.

Når produktets spidsbelastning begynder at dukke op manuelt, skal du begynde at opsamle produktet i den runde bundkolbe i modulet. Afslut samlingen manuelt, når gammasignalet falder til under ca. 400 antal pr. sekund. Se væskeniveauet i den runde bundkolbe, da produktet er lagt på en fast fase ekstraktionspatron under heliumtryk.

Når kolben er tom, og væsken er passeret gennem SPE-patronen, skal du klikke på OK for at begynde at vaske de produkter, der er fanget på patronen. Overvåg derefter aktiviteten i produktindsamlingshætteglasset, da produktet først eluteres fra patronen til hætteglasset og derefter fortyndes med 0,9 % saltvandsopløsning. Se, når produktopløsningen overføres til produkthætteglasset ved hjælp af sterilt filter under heliumtryk.

Når overførslen er færdig, lukkes produktudgangsventilen. Når radiotraceren ankommer i produkthætteglasset, måles det absolutte radioaktive udbytte. Brug derefter en blyskærmet sprøjte til at overføre 100 mikroliter af sporstof til et lille hætteglas for kvalitetskontrol.

Bring kvalitetskontrolprøven til et afskærmet arbejdsområde til kvalitetskontrol. Lav 40 mikroliter af QC-prøven i en gastæt sprøjte, læg den i et forberedt HPLC-instrument udstyret med en analytisk søjle, og injicer produktet. Udfør andre kvalitetskontrolmålinger under HPLC-løbet.

Når HPLC-løbet er færdigt, skal du integrere alle toppe i kromatogrammet fra radioaktivitetsdetektoren for at afgøre, om SNAP-radiokemikalie renheden er større end 95 %Integrer toppene i UV-kromatogrammet for at bestemme produktets kemiske renhed. Brug området under UV-produkttoppen til at beregne den specifikke aktivitet. Når produktet er blevet bekræftet for at opfylde kravene til brug frigive radio sporstof til real-time kinetiske eksperiment lab.

Mindst 30 minutter før forsøget vaskes den forberedte vildtype eller transficerede celler med DPBS, og der tilsættes to milliliter serumfrit vækstmedium. For at blokere transfekterede celler tilsættes 0,98 mikroliter af en 20,4 millimolar opløsning af racemic verapamil hydrochlorid i dimethylsulfoxid. Inkuber cellerne på et skråt plan i 30 minutter.

Tænd derefter for realtidsanalyseinstrumentet og den tilhørende computer. Åbn kontrolsoftwaren, og vælg ét mål. Indstil antallet af positioner til to, registreringstiden til tre sekunder, detektionsforsinkelsestiden til to sekunder og navnet på den første fase til baseline.

Sæt cellekulturskålen i enhedens skrå støtte med cellestangen på den nederste side. Sørg for, at cellepolen er dækket af cellekulturmedium. Start en 10-minutters baggrundsmåling, og angiv filnavnet og stien.

Indstil tidsskalaen til minutter og nuklidsamlingen til kulstof-11. Konfigurer grafen til at vise baggrunds-, mål- og baggrundsdetrubtrakede måldata. Når radiosporeren er leveret og godkendt til brug, udtages der en lille prøve til analysen.

Beregn den nødvendige mængde radiosporingsopløsning, og klargør en pipette. I instrumentsoftwaren sættes løbet på pause, og skålens rotation stoppes. Åbn låget på enheden, drej understøtten 90 grader til venstre, tilsæt radiosporeren med den forberedte pipette, og vend enheden tilbage til dens oprindelige position.

Luk låget på enheden, og fortsæt straks forsøget. Lad eksperimentet køre i 20 minutter, før det afsluttes. Betene og analyser dataene for at evaluere SNAP-optagelse i cellerne.

Nu kan proceduren gentages for DMSO-behandlede kontrolcellekulturskål og vild typecellelinje. Kinetiske analyser i realtid blev udført med ikke-PGP, der udtrykker vilde celler, PGP-ekspresceller, der er blokeret med verapamil som PGP-hæmmer, og ublokerede PGP-celler. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem ikke-behandlede celler og køretøjsbehandlede celler.

Carbon-11 SNAP hurtigt akkumuleret i vilde type celler, mens ingen ophobning blev observeret i PGP-ekspresserende celler. Pre-blokering pgp efflux transportør med verapamil resulterede i SNAP ophobning i PGP celler sammenlignes med vilde type celler. I kombination med kinetiske målinger i realtid muliggør dette set-up en bred forståelse af farmakokinetik af lav molekylvægtforbindelser og er derfor meget vigtigt for præklinisk udvikling af radioaktive lægemidler.

Timing og organisation er de vigtigste ingredienser til en vellykket carbon-11 radiosyntese med efterfølgende real-time kinetiske eksperimenter som halveringstid af kulstof-11 er kun 20 minutter. På grund af en kort halveringstid af kulstof-11 mange dele af denne procedure udføres samtidigt. Det er vigtigt for alle involverede at forstå omfanget og timingen af deres rolle.

Både produktsikkerhed og strålingsbeskyttelse er nøglen til fremstilling af radioaktive lægemidler. Alle forsøg skal følge det så lave, som det med rimelighed er muligt, eller ALARA-princippet for at begrænse operatørens stråling.