Teknisk aspekt av den automatiserade syntesen och real tids kinetisk utvärdering av [¹¹C] SNAP-7941

Carbon-11 radiolabeling gör att små föreningar kan användas för positronemissionstomografi eller PET utan att ändra molekylen. Detta är väsentligt för att undersöka receptoruttrycksnivåer. Fördelen med kol-11 radiolabeling är att vi kan använda PET för att direkt utvärdera SNAP:s bindningar kinetik mot den melaninkoncentreerande hormonreceptorn i realtid.

SNAP som en melanin-koncentrerande hormonreceptorantagonist kommer att bidra till en bättre förståelse av denna receptor och dess samband med metaboliska tillstånd som fetma och diabetes. Effluxtransportörer som uttrycks vid blod- hjärnbarriären kan avsevärt hämma användningen av radiofarmaceutiska för centrala receptoruttrycksavbildning. Därför är det viktigt att utvärdera spår in vitro.

Den automatiserade radiosyntesen av SNAP är i stort sett tillämplig på radiolabeled lågmolekylvikt föreningar med en lätt assessable metylgrupp. När etablerade detta förfarande kan anpassas för andra föreningar. Bistå i demonstrationen kommer att vara senior doktorander Sarah Pfaff och Theresa Balber.

Till att börja kol-11 SNAP syntes inrätta en ren kol-11 automatiserad syntes modul med lämpliga reagenser och material. Starta SNAP-syntesprocessen på moduldatorn som kommer att börja med systemkontroller och konditionering. Cirka 30 till 40 minuter innan modulen kommer att vara redo för C-11 leverans, välj C-11 koldioxid mål på cyklotronen och starta strålen på 65 microamperes.

När modulen är klar för leverans stänga inre fönstret och ytterdörren. Bekräfta att CO2-fällan har svalnat till minst 40 grader Celsius och att metanfällan har börjat kyla. När cyclotron har producerat cirka 120 gigabecquerels av C-11 CO2 klicka OK i modulen programvara för att öppna vägen från målet genom CO2 fällan.

Vid cyclotron datorn börja leverera C-11 CO2 till modulen. Övervaka aktivitetsöverföringen vid moduldatorn och se till att den fortsätter till minskningen av CO2 till metan efter tre minuter. Övervaka processen som den resulterande metan spolas till metan fällan och omvandlas till metyljodid genom cirkulation genom jod ugnen.

I slutet av omställningssekvensen vänta som biprodukter spolas från metyl iodid fällan till avgaser och sedan bekräfta att reaktorn är redo att ta emot aktivitet genom att klicka på OK. Övervaka systemet som metyl-iodid frigörs från fällan, spolas genom metylsaker ugn och instängd i reaktorn. När aktiviteten i reaktorplatåerna bekräftar att svällningen är klar. Vänta medan reaktionsblandningen reagerar vid 75 grader Celsius i tre minuter.

Övervaka sedan systemet när reaktionsblandningen kyls till under 35 grader Celsius och släcks med 1,5 milliliter vatten. Övervaka systemet när reaktionsblandningen laddas i HPLC-injektionsslingan och injiceras i den halvförberedande HPLC-kolumnen. Titta på UV-och gammadetektor spår som kromatografi fortsätter.

När produkten topp börjar visas manuellt börja samla produkten i runda botten insamling kolven i modulen. Manuellt avsluta insamling när gamma signalen faller under ca 400 räknas per sekund. Titta på vätskenivån i den runda bottenkolven när produkten laddas på en fast fasutsugspatron under heliumtryck.

När kolven är tom och vätskan har passerat genom SPE-patronen, klicka på OK för att börja tvätta produkterna som fastnat på patronen. Övervaka sedan aktiviteten i produkterna insamling injektionsflaska som produkten först eluteras från patronen i injektionsflaskan och späds sedan med 0,9%saltlösning. Se på när produktlösningen överförs till produktflaskan genom sterilt filter under heliumtryck.

När överföringen är klar nära produkten utdataventilen. När radiotracer anländer i produkten injektionsflaskan mäta den absolut radioaktiva avkastningen. Använd sedan en blyskärmad spruta för att överföra 100 mikroliter av spårämnet till en liten injektionsflaska för kvalitetskontroll.

Ta kvalitetskontrollprovet till ett avskärmat kvalitetskontrollarbetsområde. Dra upp 40 mikroliter av QC-provet i en gastät spruta, ladda det i ett berett HPLC-instrument som är utrustat med en analyskolonn och injicera produkten. Utför andra kvalitetskontrollmätningar under HPLC-körningen.

När HPLC-körningen har blivit färdigt integrera alla toppar i kromatogrammet från radioaktivitetsdetektorn för att avgöra om SNAP radiokemikalie renhet är större än 95%Integrera topparna i UV-kromatogrammet för att bestämma produktens kemiska renhet. Använd området under UV-produkttoppen för att beräkna den specifika aktiviteten. När produkten har bekräftats uppfylla kraven för användning släppa radio tracer till realtid kinetisk experiment lab.

Minst 30 minuter före försöket tvätta den beredda vild typ eller transfekterade celler med DPBS och tillsätt två milliliter av serum-fri tillväxt medium. För att blockera transfekterade celler tillsätt 0,98 mikroliter av en 20,4 millimolar lösning av racemic verapamil hydroklorid i dimetylsulfoxid. Inkubera cellerna på ett snedplan i 30 minuter.

Slå sedan på analysinstrumentet i realtid och den tillhörande datorn. Öppna styrprogramvaran och välj ett mål. Ställ in antalet positioner till två, identifieringstiden till tre sekunder, upptäcktens fördröjningstid till två sekunder och namnet på den första fasen till baslinjen.

För in cellodlingsfatet i anordningens lutande stöd med cellstången på undersidan. Se till att cellpolen är täckt av cellodlingsmedium. Starta en 10-minuters bakgrundsmätning och ställ in filnamn och sökväg.

Ställ in tidsskalan på minuter och nukliduppsamlingen till kol-11. Konfigurera grafen för att visa bakgrund, mål och bakgrund subtraherade måldata. När radiospåraren har levererats och godkänts för användning, ta ett litet prov för analysen.

Beräkna den volym som behövs av radiospårämneslösning och förbered en pipett. I instrumentet programvara pausa körningen och vänta på skålen rotation att stoppa. Öppna locket på enheten, vrid stödet 90 grader åt vänster, lägg till radiospåraren med den förberedda pipetten och återför enheten till sitt inledande läge.

Stäng locket på enheten och återuppta omedelbart experimentet. Låt experimentet rinna i 20 minuter innan du avslutar det. Bearbeta och analysera data för att utvärdera SNAP-upptagning i cellerna.

Nu kan proceduren upprepas för dmso-behandlade kontroll cell kultur skålen och vilda typ cellinje. Real-time kinetic assays utfördes med icke-PGP uttrycker vilda typ celler, PGP-uttrycker celler pre-blockerade med verapamil som en PGP-hämmare och oblockerade PGP celler. Ingen signifikant skillnad observerades mellan icke- behandlade celler och fordonsbehandlade celler.

Kol-11 SNAP snabbt ackumuleras i vilda typ celler medan ingen ackumulering observerades i PGP-uttryck celler. Pre-blockering av PGP efflux transportör med verapamil resulterade i SNAP ackumulering i PGP-cellerna jämförbar med den för vilda typ celler. I kombination med realtidskinetiska mätningar möjliggör denna uppställda uppsättning en bred förståelse för farmakokinetiken hos föreningar med låg molekylvikt och är därför mycket viktigt för preklinisk utveckling av radiofarmaceutiska läkemedel.

Timing och organisation är de viktigaste ingredienserna för en framgångsrik kol-11 radiosyntes med efterföljande realtid kinetiska experiment som halveringstiden för kol-11 är bara 20 minuter. På grund av en kort halveringstid av kol-11 många delar av denna procedur utförs samtidigt. Det är viktigt för alla inblandade att förstå omfattningen och tidpunkten för sin roll.

Både produktsäkerhet och strålskydd är nyckeln för beredning av radiofarmaka. Alla experiment måste följa den så låga som rimligen är möjligt eller ALARA Princip för att begränsa operatörens strålningsexponering.