Name: controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells
Uploaded: 2019-07-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells at JoVE.co

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Zentrums für Neurowissenschaften und Regenerative Medizin (CNRM, Fördernummer G170244014) unterstützt. Wir schätzen die Unterstützung von Mahima Dewan und Clara Selbrede bei Pilotstudien zur Klebeentfernung. Kryslaine Radomski führte vorläufige Hirnverletzungen und Zelltransplantationen durch. Amanda Fu und Laura Tucker vom USU CNRM Preclinical Studies Core Laboratory gaben wertvolle Ratschläge zu Tieroperationen bzw. Verhaltenstests.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden vom Uniformed Services University Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt.
1. Kraniektomie und kontrollierte kortikale Wirkung
<ol><li>Vorbereitung des kontrollierten kortikalen Aufprallgeräts und der chirurgischen Versorgung.<ol>
<li>Eine 1 ml Schlupfspitzenspritze mit 0,5 ml steriler Saline zur Wundbewässerung aufladen. Befestigen Sie eine 25 G Nadel an der Spritze, um die Bewässerung zu steuern.</li>
		<li>Bereit...

<ol>
	<li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury:+integrated+approaches+to+improve+prevention,+clinical+care,+and+research.">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li><li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).</li><li>Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury-Related+Emergency+Department+Visits,+Hospitalizations,+and+Deaths+-+United+States,+2007+and+2013.">Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013.</a> Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).</li><li>Fehily, B., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Mild+Traumatic+Brain+Injury:+Potential+Mechanisms+of+Damage.">Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage.</a> Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).</li><li>Kulbe, J. R., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+traumatic+encephalopathy-integration+of+canonical+traumatic+brain+injury+secondary+injury+mechanisms+with+tau+pathology.">Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology.</a> Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).</li><li>Romine, J., Gao, X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cortical+impact+model+for+traumatic+brain+injury.">Controlled cortical impact model for traumatic brain injury.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).</li><li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+resting+functional+connectivity+after+traumatic+brain+injury+in+the+rat.">Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat.</a> PloS ONE. 9, 95280 (2014).</li><li>Sours, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Default+mode+network+interference+in+mild+traumatic+brain+injury+-+a+pilot+resting+state+study.">Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study.</a> Brain Research. 1537, 201-215 (2013).</li><li>Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+interneuron+progenitor+transplantation+restores+normal+learning+and+memory+in+ApoE4+knock-in+mice+without+or+with+Abeta+accumulation.">Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Lischka, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+mouse+cortical+but+not+isogenic+human+astrocyte+feeder+layers+enhance+the+functional+maturation+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+in+culture.">Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture.</a> Glia. 66, 725-748 (2018).</li><li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesive+removal+test:+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice.">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).</li><li>Fleming, S. M., Ekhator, O. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+dose+alters+the+dynamics+of+human+neural+stem+cell+engraftment,+proliferation+and+migration+after+spinal+cord+injury.">Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury.</a> Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+controlled+cortical+impact+traumatic+brain+injury+in+rats+and+mice+dictates+degree+of+behavioral+deficits.">Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits.</a> Brain Research. 1287, 157-163 (2009).</li><li>Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats.">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li><li>Namjoshi, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+biomechanical+and+biological+threshold+of+murine+mild+traumatic+brain+injury+using+CHIMERA+(Closed+Head+Impact+Model+of+Engineered+Rotational+Acceleration).">Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration).</a> Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).</li><li>Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+dysfunction+and+delayed+neurological+deficits+in+mild+traumatic+brain+injury+induced+by+blast+shock+waves.">Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).</li><li>Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+mild+traumatic+brain+injury:+translation+of+physiological+and+anatomic+injury.">Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury.</a> Neurosurgery. 75, 34-49 (2014).</li><li>Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+to+define+mild,+moderate,+and+severe+traumatic+brain+injury+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model.">Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model.</a> Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).</li><li>Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Male+and+Female+C57BL/6J+Mice+on+Motor+and+Cognitive+Tasks+Commonly+Used+in+Pre-Clinical+Traumatic+Brain+Injury+Research.">Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).</li><li>Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+long+is+too+long?+The+lack+of+consensus+regarding+the+post-concussion+syndrome+diagnosis.">How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis.</a> Brain Injury. 29, 798-803 (2015).</li><li>Hurst, J. L., West, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+anxiety+in+laboratory+mice.">Taming anxiety in laboratory mice.</a> Nature Methods. 7, 825-826 (2010).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+behavioral+testing+after+focal+ischemia+in+the+mouse:+functional+recovery+and+the+effects+of+gender.">Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender.</a> Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).</li><li>Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+cortical+lesion+effects+and+treatment+with+nimodipine.">Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine.</a> Physiology &amp; Behavior. 47, 1045-1052 (1990).</li><li>Al-Ali, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mTOR+Substrate+S6+Kinase+1+(S6K1)+Is+a+Negative+Regulator+of+Axon+Regeneration+and+a+Potential+Drug+Target+for+Central+Nervous+System+Injury.">The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).</li><li>Pleasant, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+neurodegeneration+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model+is+influenced+by+impactor+tip+shape:+implications+for+mechanistic+and+therapeutic+studies.">Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).</li></ol>

Mildes CCI als Modellsystem zur Erprobung experimenteller regenerativer Therapie Das CCI-Modell ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Mechanismen der Gewebefunktionsstörung nach mechanischen Verletzungen des Kortex. Die Abstimmbarkeit der Verletzungsparameter ist ein attraktives Merkmal dieses Modells. Die Änderung der Z-Tiefe des Aufpralls, der Geschwindigkeit oder der Verweilzeit kann die Schwere der Verletzung erhöhen oder verringern, wie vom Prüfer gewünscht10</su...

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind ein allgemeiner Begriff für die erworbene Schädigung des Gehirns aufgrund von indirekten mechanischen Kräften (Rotationsbeschleunigung/Verzögerung oder Gegenputsch) durch Schläge auf den Kopf oder direkte Schäden durch Objekte oder Explosionswellen. TBI ist schätzungsweise die Ursache von etwa 9 % der weltweiten Todesfälle undwurde in schätzungsweise 50 Millionen Fällen pro Jahr 1,2beobachtet. Ein Bericht der Centers for Disease Control and Prevention aus dem Jahr 2017 schätzte, dass es im Jahr 2013 insgesamt 2,8 Millionen Krankenhausbesuche und Todesfälle aufgrund von TBI in den Vereinigten Staatengab 3. Viele mildere TBIs werden jedes Jahr nicht gemeldet. Seriöses TBI kann zu lebenslanger Beeinträchtigung der Kognition, der motorischen Funktion und der allgemeinen Lebensqualität führen. Die Folgen von mildem TBI, insbesondere repetitives sportbezogenes TBI, wurdenerst vor kurzem für ihre heimtückischen gesundheitlichen Auswirkungen 4,5geschätzt.
Die präklinische Modellierung ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung neuer mechanistischer Erkenntnisse und einer möglichen restaurativen Therapie für TBI. Das Modell der kontrollierten kortikalen Schlagwirkung (CCI) von TBI ist ein Open-Head-Modell der mechanischen Prellung des Kortex. Die Aufprallparameter können geändert werden, um CCI-Verletzungen zu erzeugen, die von leichten bis schweren6reichen. CCI-Verletzungen sind eher fokal als diffus, wie bei anderen geschlossenen Kopfmodellen von TBI zu sehen ist. CCI kann durchgeführt werden, um eine einseitige Verletzung zu induzieren, so dass der kontralaterale Kortex als interner Vergleich dienen kann. Dieses Protokoll zeigt die Eigenschaften einer milden CCI für einen Teil des Kortex, der primäre somatosensorische und motorische Regionen umfasst. Dieser kortikale Bereich wurde für seine Beteiligung an sensorimotorischen Verhaltensweisen ausgewählt, für die zahlreiche Verhaltenstests verletzungsbedingte Defizite erkennen können7. Auch Verhaltensverbesserungen durch therapeutische Eingriffe bei TBI können nachgewiesen werden.
Ein Kennzeichen von TBI ist die weit verbreitete neuronale Dysfunktion in der verletzten Region. Verletzte Neuronen erleiden den Zelltod, und die neuronale Netzwerkkonnektivität ist gestört8,9. TBI stört die Rekrutierung endogener Stammzellen, was zu weiteren nachgelagerten Verhaltensdefiziten10,11führt.  Die Transplantation von neuronalen Stammzellen und Stammzellen-abgeleiteten Zellen wurde als Möglichkeit zur Wiederherstellung der Funktion im verletzten Gehirn untersucht. Zusätzlich zu dem Potenzial, beschädigte neuronale Schaltkreise wiederherzustellen, üben transplantierte Zellen parakrine Effekte aus, die das neuronale Überleben und die funktionelle Erholung von TBI12fördern. Eine Vielzahl von Zelltypen wurden präklinisch transplantiert, um ihr restauratives Potenzial in Modellen neurologischer Erkrankungen13,14,15zu bewerten. Die jüngste Popularisierung der induzierten pluripotenten Stammzelltechnologie16 hat die Entwicklung zahlreicher menschlicher Stammzelllinien für den experimentellen Einsatz erleichtert. Präklinische Tests mit hiPSC-abgeleiteten Zellen sind ein wichtiger erster Schritt, um die potenzielle therapeutische Wirksamkeit einer bestimmten Zelllinie gegen menschliche Krankheiten zu charakterisieren. Dieses Labor hat Protokolle zur Unterscheidung von HiPSCs zu neuralen Phänotypen17 entwickelt, um transplantierbare Zellen zu erhalten, um die Erholung von traumatischen Hirnverletzungen zu unterstützen.
Experimente in diesem Protokoll verwenden eine einseitige CCI, um TBI in die linke somatosensorische und motorische Kortex von erwachsenen Mäusen zu induzieren. Eine leichte CCI-Verletzung führt zu einem anhaltenden funktionellen Defizit im rechten Vorderpfau, das verwendet wird, um die Auswirkungen der von hiPSC abgeleiteten neuronalen Zelltransplantation auf die funktionelle Wiederherstellung zu verfolgen. Die senkpermittelmotorische Prüfung in diesem Protokoll wurde an die von Bouet und Kollegen18 festgelegte Methodik angepasst und zuvor von Fleming und Kollegen19demonstriert.  Dieses Protokoll skizziert einen vollständigen Workflow für die Durchführung einer experimentellen Hirnverletzung, therapeutische Transplantation von HiPS-Zellen und Verhaltens- und histologische Analysen experimenteller Ergebnismessungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:774px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;309659</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1.7 ml flip top test tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td style="width:123px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">10 microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">25G Precision Glide syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">acetaminophen oral suspension</td>
			<td>Tylenol (Children&#39;s)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Dilute to 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">anesthetic vaporizer</td>
			<td>Vetland</td>
			<td style="width:123px;">521-11-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">animal handling cloth</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Betadine</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td style="width:123px;">NDC-67618-151-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">compressed oxygen</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">cyclosporine A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">30024-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DAB staining kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D8418-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:123px;">715-035-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">electrical tape</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom Electric Co.&#160;</td>
			<td style="width:123px;">K.1070 - K.107018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Ideal Micro Drill Burr Set Of 5</td>
			<td>Cell Point Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">60-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Impact One Stereotaxic Impactor for CCI&#160;</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">39463920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td style="width:123px;">NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">lab bench timers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette puller</td>
			<td>MicroData Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">PMP-102</td>
			<td>Any puller will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope cover slips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope slide mounting medium</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:212px;">Product of choice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">mirror</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse anti-human nuclear antigen antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB1281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Mouse on Mouse blocking kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">needle holder hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic ointment</td>
			<td>Falcon Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:123px;">NDC-61314-631-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic box</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic cylinder</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">QSI motorized syringe pump</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">53311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Removable needle compression fitting</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">55750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small rodent stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">51925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">StemPro Accutase</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile alcohol prep pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">06-669-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sterile cotton swabs/Kendall Q-tips</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">540500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td style="width:123px;">NDC-0409-1966-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Stopwatches (2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">06-662-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Superfrost Plus Gold microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">15-188-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sutures - 5.0 silk with curved needle</td>
			<td>Oasis</td>
			<td style="width:123px;">MV-682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Krankheitspathologie aufgrund von TBI entwickelt sich von der primären mechanischen Beleidigung zu sekundären Verletzungsprozessen, einschließlich Apoptose und Entzündung. Tiermodellierung war wertvoll bei der Suche nach Verletzungsmechanismen und Bewertung potenzieller neuroprotektive Therapien. Dieses Protokoll beschreibt das Modell der kontrollierten kortikalen Wirkung (KII) des fokalen, offenen TBI. Insbesondere werden Parameter für die Herstellung einer leichten einseitigen kortikalen Verletzung beschrieben. Die Verhaltensfolgen von CCI werden mit dem Klebebandentfernungstest der bilateralen sensorimotorischen Integration analysiert. In Bezug auf die experimentelle Therapie für TBI-Pathologie, dieses Protokoll zeigt auch einen Prozess für die Transplantation kultivierter Zellen in das Gehirn. Neuronale Zellkulturen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) gewonnen wurden, wurden aufgrund ihres Potenzials ausgewählt, eine überlegene funktionelle Wiederherstellung bei menschlichen TBI-Patienten zu zeigen. Chronisches Überleben von HiPSCs im Hirngewebe der Wirtsmaus wird mit einem modifizierten DAB-Immunhistochemischen Prozess nachgewiesen.

Die Craniectomie-Chirurgie erleichtert experimentelle Hirnverletzungen und therapeutische Zelltransplantationen: Das kontrollierte kortikale Wirkungsmodell der Hirnverletzung und die anschließende Zelltransplantationstherapie erfordern eine sorgfältige Entfernung des darüber liegenden Schädels. Die Kraniektomie kann auf jeder dorsalen Oberfläche des Schädels durchgeführt werden, um Manipulationen an der Hirnregion von Interesse zu ermöglichen. Das Diagramm in Abbildung 1</str...

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Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Dieses Protokoll zeigt Methoden für ein Mausmodell der traumatischen Hirnverletzung mit offenem Schädel und die Transplantation kultivierter, humaninduzierter pluripotenter Stammzellen-abgeleiteter Zellen in die Verletzungsstelle. Verhaltens- und histologische Tests der Ergebnisse dieser Verfahren werden ebenfalls kurz beschrieben.

Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Unser Protokoll zeigt einen umfassenden präklinischen Workflow zur Erprobung der therapeutischen Wirksamkeit von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen nach Einer Hirnverletzung. Dieses Modell der traumatischen Hirnverletzung bietet ein hohes Maß an Vielseitigkeit und Reproduzierbarkeit, indem es die Parameter der mechanischen Kraft genau kontrolliert und somit eine klar definierte Verletzung liefert. Diese Verfahren können verwendet werden, um Verletzungs- und Erholungsprozesse in anderen Hirnregionen zu untersuchen, und die Transplantationsmethode ist für viele Zelltypen geeignet.Cranial-Bohren ist eine Herausforderung, da die Technik manuelle Geschicklichkeit erfordert, um den entsprechenden Druck, Geschwindigkeit, Tiefe und sanfte Bewegungen zu meistern. Dokumentieren Sie alle Veranstaltungen und Üben ausgiebig. Um eine einseitige Kraniektomie durchzuführen, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in der anästhesierten Maus und sichern Sie die Maus in einem stereotaxic Rahmen.Mit einem sterilen Wattestäbchen und einer Jodlösung auf die Augen wird eine antibiotische ophthalmologische Salbe auf die Augen aufgebracht. Entfernen Sie das Jod mit 70% Ethanol und bedecken Sie das Tier mit einem fenestrated chirurgischen Drap. Machen Sie einen 1,5 bis zwei Zentimeter Mittellinie Schnitt auf der Kopfhaut und verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um die Wunde zu reinigen und die Faszien links von der Mittellinie bei Bregma zu reinigen.Verwenden Sie eine Schlagsonde, um die Kraniektomie-Site zu identifizieren und legen Sie den x gleich Null, y gleich Null stereotaxic Referenzpunkt bregma. Passen Sie die Sonde seitlich auf zwei Millimeter links von der Mittellinie an. Verwenden Sie einen feinspitzen chirurgisch sicheren Marker, um einen Kreis mit fünf Millimetern Durchmesser um den mutmaßlichen Aufprallbereich zu umkreisen.Heben und drehen Sie den Stoßkraft aus der Position und vervollständigen Sie den Fünf-Millimeter-Kreis. Geben Sie den Stoßkraft kurz in Position zurück, um die Genauigkeit des Fünf-Millimeter-Kreises zu überprüfen. Heben und drehen Sie den Stoßsatz aus der Position und verwenden Sie ein Hochgeschwindigkeits-Dreh-Mikromotor-Kit-Handwerkzeug, das mit einem runden Spitzenbohrer 0,6 oder 0,8 Millimeter Gratbit ausgestattet ist, um ein offenes Loch im Schädel mit einer maximalen Geschwindigkeit von 70 bis 80 % zu machen.Wenden Sie leichten Druck auf den Schädel an, während Sie entlang der fünf Millimeter umlaufenden Umrisse innerhalb dieser Grenze bohren, und verwenden Sie Zangen, um die resultierende Knochenklappe zu heben. Das Bohren durch Nahtlinien kann zusätzliche Schwierigkeiten mit sich bringen, da der Knochen unterbrochen wird und zusätzlichen Druck erfordert. Blutgefäße können in enger Verbindung sein und daher Blutungsereignisse sind wahrscheinlich.Um eine leichte kontrollierte kortikale Schlagverletzung auszulösen, reinigen Sie die Stoßsonde mit einem sterilen Alkohol-Prep-Pad und bewegen Sie die Stoßsonde wieder in Position über den exponierten Kortex. Senken Sie die Sonde, bis sie die Dura mater-Oberfläche berührt, und markieren Sie diese Position als z gleich Null. Ziehen Sie den Kolben ab und bewegen Sie sich auf z entspricht minus einem Millimeter und entladen Sie den Kolben, um den Kortex zu beeinflussen.Heben Sie den Kolben sofort an und bewegen Sie den Arm aus der Position und bewässern Sie den Kortex mit einem großzügigen Volumen an Saline und verwenden Sie einfache unterbrochene Stiche und 5-0 Seidennaht, um den Kopfhautschnitt zu schließen. Dann liefern Sie 10 Milligramm pro Kilogramm Cyclosporin A durch subkutane Injektion in die Scruff und legen Sie die Maus in einen sauberen vorgewärmten postoperativen Käfig mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung. Etwa 24 Stunden nach der Kraniektomie, legen Sie die Maus wieder in den stereotaxic Rahmen.Bedecken Sie die Maus mit dem fenestrated chirurgischen Drap. Spülen Sie die Einschnittstelle mit steriler Saline, um die Stelle zu reinigen und die Nähte zu lösen. Verwenden Sie einen 70% Ethanol getränkten Wattestäbchen, um die Schnittstelle sanft zu sterilisieren und verwenden Sie feine Pinzette und Augenscheren, um die Nähte zu entfernen.Dann bewässern Sie die Operation und Kraniektomie-Site mit reichlich steriler Saline. In einer Zellkultur Biosicherheitshaube, sanft wirbeln oder tippen Sie auf die Zellröhre, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um etwa 7,5 Mikroliter Zellen durch das Kolbenende in eine Hamilton-Spritze zu laden.Halten Sie die Spritze in einem 120-Grad-Winkel mit dem Kolbenende nach unten, legen Sie den Kolben unter Hinweis darauf, keine Luftblase zwischen Federung und Kolbenspitze einzuführen. Befestigen Sie die Dichtungseinheit an der Pipettennadel und befestigen Sie die Nadel an der Spritze. Drücken Sie den Kolben, um die Zellsuspension in die Pipettenadel zu bewegen, und befestigen Sie die Spritze an der stereotaxic Spritzenpumpe.Bewegen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass die Spritzenpumpenbaugruppe ordnungsgemäß funktioniert, und bewegen Sie die Nadel in die Injektionskoordinaten. Richten Sie die Nadelspitze auf Bregma aus, und legen Sie die x- und y-Koordinaten auf Null fest. Bewegen Sie die Nadelspitze über die Kraniektomie auf zwei Millimeter seitlich und minus einen Millimeter hinter dem Ende auf Bregma und berühren Sie die Nadelspitze auf die Dura-Mater-Oberfläche.Heben Sie die Nadel leicht an und machen Sie dann einen kleinen Schnitt in der Dura mater an der Stelle, an der die Nadel Kontakt aufgenommen hat. Stellen Sie die stereotaxic-Koordinate auf z gleich Null und drücken Sie den Kolben, um zu bestätigen, dass die Zellsuspension ausreichend fließt, bevor Sie die Nadel in das Gehirn einführen. Führen Sie die Nadel in eine Tiefe von z entspricht minus 1,4 Millimeter naden in das Gehirn ein, um das Transplantat an den grauen Materie-/Weißen Stoffrand des tiefen Kortex zu platzieren.Starten Sie die Spritzenpumpe, um die Zellsuspension über einen Zeitraum von 15 Minuten zu infundieren. Verwenden Sie ein Langzeitmikroskop, um den Zellsuspensionsabfluss zu überwachen, der die Operationsstelle während der Injektion mit steriler Saline bewässert, um die Gewebefeuchte aufrechtzuerhalten. Wenn alle Zellen geliefert sind, ziehen Sie langsam die Transplantationsnadel zurück und bewässern Sie die Operationsstelle mit zusätzlicher Saline, bevor Sie den Schnitt mit neuen Nähten schließen.Dann liefern Sie postoperative Pflege, wie gezeigt. Für einen Klebebandentfernungstest verwenden Sie zunächst ein kleines Rasiermesser, um gelbe und rote Teile des Elektrobandes auf einer glatten Glasoberfläche in drei mal fünf Millimeter Streifen zu schneiden. Bringen Sie die Mäuse mindestens 30 Minuten vor dem Test in den Verhaltenstestraum und verwenden Sie ein Handhabungstuch, um die Maus durch die Schürfwunden des Halses und des Rückens so zu halten, dass die Maus die Vorderpfoten von ihrem Körper und Kopf fernhält.Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Klebestreifen auf die Plantaroberfläche jedes Vorderpfoes zu legen und verwenden Sie einen empfindlichen und konsistenten Fingerdruck, um die Streifen an den Pfoten zu sichern. Legen Sie die Maus schnell in einen Kunststoffzylinder und starten Sie zwei Stoppuhren, wenn die Maus alle vier Pfoten auf der Kunststoff-Testbox hat. Dann verwenden Sie die beiden Stoppuhren, um die Latenzen für linke Pfotenanzeige, linke Pfotenentfernung, rechte Pfotenanzeige und rechte Pfotenentfernung aufzuzeichnen.In diesem Pilotexperiment wurde die Vorderbeinfunktion allein bei Derkerei, kontrollierten kortikalen Schlagverletzungen und naiven Mäusen verglichen. Mäuse, die operiert wurden, wiesen vorübergehende erhöhte Latenzen auf, um klebefreie Reize für ein bis drei Tage unmittelbar nach der Operation und vorübergehende postoperative Defizite bei der Klebeentfernung aus dem ipsilateralen Vorpaw zu bemerken. Mäuse, die kontrollierten kortikalen Auswirkungen unterzogen wurden, wiesen jedoch signifikante Defizite in der motorischen Leistung in der Vorpaw kontralateral zu der Verletzung im Vergleich zu naiven Mäusen aus dem postoperativen Tag 28.Die Immunostainierung von Maus-Gehirnabschnitten für menschliches Kernantigen zeigt, dass menschliche Zelltransplantate deutlich von Wirtsgeweben bei SHAM-Verletzungen und kontrollierten kortikalen Aufprallgehirnen unterschieden werden können. Sie müssen bei der Handhabung kultivierter menschlicher Zellen und beim Umgang mit Spritzennadeln, die mit Nagetieren oder immunsuppressiven Medikamenten in Berührung kommen, die üblichen Laborsicherheitsverfahren beachten. Hirngewebeabschnitte können für die Expression von neuroinflammatorischen Markern analysiert werden, da es wertvoll ist zu wissen, wie das Transplantat die Reaktion auf die Wirtsgewebeverletzung beeinflusst und umgekehrt.Wir waren überrascht, subtile Geschlechtsunterschiede in den Verhaltensergebnissen nach der Verletzung zu finden. Wir untersuchen nun, ob Sex eine Rolle bei der Neuroimmunreaktion auf Hirnverletzungen spielt. Stetige Hände, Geduld und Übung sind entscheidend für die Entwicklung einer guten Kraniektomie-Technik.Kollateralschäden durch eine unsachgemäße Kraniektomie können den Bereich gefährden, den Sie für die Zelltransplantation ins Visier nehmen möchten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...