Name: controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells
Uploaded: 2019-07-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells at JoVE.co

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Center for Neuroscience and Regenerative Medicine (CNRM, numero di sovvenzione G170244014). Apprezziamo l'assistenza di Mahima Dewan e Clara Selbrede negli studi pilota di rimozione adesiva. Kryslaine Radomski ha eseguito interventi chirurgici preliminari per il trapianto di cervello e trapianto di cellule. Amanda Fu e Laura Tucker del laboratorio centrale USU CNRM Preclinical Studies hanno fornito preziosi consigli rispettivamente su interventi chirurgici e test di comportamento per animali.

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dall'Uniformed Services University Animal Care and Use Committee.
1. Craniectomia e impatto corticale controllato
<ol><li>Preparazione del dispositivo a impatto corticale controllato e delle forniture chirurgiche.<ol>
<li>Caricare una siringa a punta di scivolamento da 1 mL con 0,5 mL di salina sterile per l'irrigazione delle ferite. Attaccare un ago da 25 G alla siringa per controllare l'irrigazione.</li>
...

<ol>
	<li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury:+integrated+approaches+to+improve+prevention,+clinical+care,+and+research.">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li><li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).</li><li>Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury-Related+Emergency+Department+Visits,+Hospitalizations,+and+Deaths+-+United+States,+2007+and+2013.">Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013.</a> Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).</li><li>Fehily, B., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Mild+Traumatic+Brain+Injury:+Potential+Mechanisms+of+Damage.">Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage.</a> Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).</li><li>Kulbe, J. R., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+traumatic+encephalopathy-integration+of+canonical+traumatic+brain+injury+secondary+injury+mechanisms+with+tau+pathology.">Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology.</a> Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).</li><li>Romine, J., Gao, X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cortical+impact+model+for+traumatic+brain+injury.">Controlled cortical impact model for traumatic brain injury.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).</li><li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke,+cortical+ablation,+parkinsonism+and+spinal+cord+injury.">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li><li>Mishra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+resting+functional+connectivity+after+traumatic+brain+injury+in+the+rat.">Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat.</a> PloS ONE. 9, 95280 (2014).</li><li>Sours, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Default+mode+network+interference+in+mild+traumatic+brain+injury+-+a+pilot+resting+state+study.">Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study.</a> Brain Research. 1537, 201-215 (2013).</li><li>Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+interneuron+progenitor+transplantation+restores+normal+learning+and+memory+in+ApoE4+knock-in+mice+without+or+with+Abeta+accumulation.">Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Lischka, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+mouse+cortical+but+not+isogenic+human+astrocyte+feeder+layers+enhance+the+functional+maturation+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+in+culture.">Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture.</a> Glia. 66, 725-748 (2018).</li><li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesive+removal+test:+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice.">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).</li><li>Fleming, S. M., Ekhator, O. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+dose+alters+the+dynamics+of+human+neural+stem+cell+engraftment,+proliferation+and+migration+after+spinal+cord+injury.">Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury.</a> Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+controlled+cortical+impact+traumatic+brain+injury+in+rats+and+mice+dictates+degree+of+behavioral+deficits.">Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits.</a> Brain Research. 1287, 157-163 (2009).</li><li>Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats.">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li><li>Namjoshi, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+biomechanical+and+biological+threshold+of+murine+mild+traumatic+brain+injury+using+CHIMERA+(Closed+Head+Impact+Model+of+Engineered+Rotational+Acceleration).">Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration).</a> Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).</li><li>Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+dysfunction+and+delayed+neurological+deficits+in+mild+traumatic+brain+injury+induced+by+blast+shock+waves.">Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).</li><li>Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+mild+traumatic+brain+injury:+translation+of+physiological+and+anatomic+injury.">Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury.</a> Neurosurgery. 75, 34-49 (2014).</li><li>Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+to+define+mild,+moderate,+and+severe+traumatic+brain+injury+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model.">Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model.</a> Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).</li><li>Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Male+and+Female+C57BL/6J+Mice+on+Motor+and+Cognitive+Tasks+Commonly+Used+in+Pre-Clinical+Traumatic+Brain+Injury+Research.">Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).</li><li>Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+long+is+too+long?+The+lack+of+consensus+regarding+the+post-concussion+syndrome+diagnosis.">How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis.</a> Brain Injury. 29, 798-803 (2015).</li><li>Hurst, J. L., West, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+anxiety+in+laboratory+mice.">Taming anxiety in laboratory mice.</a> Nature Methods. 7, 825-826 (2010).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+behavioral+testing+after+focal+ischemia+in+the+mouse:+functional+recovery+and+the+effects+of+gender.">Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender.</a> Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).</li><li>Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+cortical+lesion+effects+and+treatment+with+nimodipine.">Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine.</a> Physiology &amp; Behavior. 47, 1045-1052 (1990).</li><li>Al-Ali, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mTOR+Substrate+S6+Kinase+1+(S6K1)+Is+a+Negative+Regulator+of+Axon+Regeneration+and+a+Potential+Drug+Target+for+Central+Nervous+System+Injury.">The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).</li><li>Pleasant, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+neurodegeneration+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model+is+influenced+by+impactor+tip+shape:+implications+for+mechanistic+and+therapeutic+studies.">Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).</li></ol>

CCI mite come sistema modello per testare la terapia rigenerativa sperimentale Il modello CCI è uno strumento prezioso per studiare i meccanismi di disfunzione tissutale dopo lesioni meccaniche alla corteccia. La sintonabilità dei parametri di lesione è una caratteristica interessante di questo modello. Alterare la profondità di impatto, la velocità o il tempo di dimora può aumentare o diminuire la gravità della lesione come desiderato dall'investigatore10,<su...

Lesione cerebrale traumatica (TBI) è un termine generale per la lesione acquisita al cervello a causa di forze meccaniche indirette (accelerazione/decelerazione rotazionale o contro-colpo) da colpi alla testa o danni diretti da oggetti o onde di scoppio. La TBI è stata stimata essere la causa di circa il 9% dei decessi a livello mondiale e osservata in circa 50 milioni di casi all'anno1,2. Un rapporto del 2017 dei Centers for Disease Control and Prevention ha stimato che nel 2013 ci sono stati 2,8 milioni di visite ospedaliere e decessi dovuti a TBI negli Stati Uniti3. Molti TBI più lievi non vengono segnalati ogni anno. La TBI grave può portare a una compromissione permanente della cognizione, della funzione motoria e della qualità generale della vita. Le conseguenze del lieve TBI, in particolare il TBI sportivo ripetitivo, sono state apprezzate solo di recente per i loro insidiosi effetti sulla salute4,5.
La modellazione preclinica è una componente vitale dello sviluppo di nuove intuizioni meccanicistiche e di una potenziale terapia rigenerativa per la TBI. Il modello a impatto corticale controllato (CCI) di TBI è un modello a testa aperta di lesioni da contusione meccanica alla corteccia. I parametri di impatto possono essere modificati per produrre lesioni CCI che vanno da lievi a6. Le lesioni CCI sono focali piuttosto che diffuse, come si è visto con altri modelli a testa chiusa di TBI. CCI può essere eseguito per indurre una lesione unilaterale, in modo tale che la corteccia contralaterale può servire come un comparatore interno. Questo protocollo dimostra le caratteristiche di un CCI lieve a una porzione della corteccia che comprende le regioni somatosensoriali e motorie primarie. Questa zona corticale è stata scelta per il suo coinvolgimento nei comportamenti sensomotori per i quali numerosi test di comportamento possono rilevare deficit indotti da lesioni7. Miglioramenti comportamentali dovuti a interventi terapeutici per la TBI possono essere rilevati, pure.
Un segno distintivo della TBI è diffusa disfunzione neurale nella regione ferita. I neuroni feriti subiscono la morte cellulare, e la connettività della rete neuronale viene interrotta8,9. La TBI interrompe il reclutamento di cellule staminali endogene, il che porta a ulteriori deficit di comportamento a valle10,11.  Il trapianto di cellule staminali neurali e cellule derivate da cellule staminali è stato esplorato come una possibilità per ripristinare la funzione nel cervello ferito. Oltre al potenziale per ripristinare i circuiti neurali danneggiati, le cellule trapiantate esercitano effetti paracrini che promuovono la sopravvivenza neuronale e il recupero funzionale da TBI12. Una varietà di tipi di cellule sono stati trapiantati preclinicamente per valutare il loro potenziale rigenerativo in modelli di disturbi neurologici13,14,15. La recente divulgazione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotta16 ha facilitato lo sviluppo di numerose linee di cellule staminali umane per uso sperimentale. Il test preclinico con cellule derivate da hiPSC è un primo passo importante per caratterizzare la potenziale efficacia terapeutica di una data linea cellulare contro le malattie umane. Questo laboratorio ha sviluppato protocolli per differenziare gli hiPSC ai fenotipi neurali17 alla ricerca di cellule trapiantate per aiutare il recupero da lesioni cerebrali traumatiche.
Gli esperimenti in questo protocollo utilizzano un CCI unilaterale per indurre la TBI alla corteccia somatosensoriale e motoria sinistra dei topi adulti. Una lieve lesione CCI si traduce in un deficit funzionale sostenuto nella pedina destra che viene utilizzato per monitorare gli effetti dell'innesto di cellule neurali derivato da hiPSC sul recupero funzionale. Il forepaw sensorimotor testing in questo protocollo è stato adattato dalla metodologia stabilita da Bouet e colleghi18 e dimostrato in precedenza da Fleming e colleghi19.  Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo per l'esecuzione di una lesione cerebrale sperimentale, il trapianto terapeutico di cellule hiPS e l'analisi comportamentale e istologica delle misure di esito sperimentale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:774px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;309659</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1.7 ml flip top test tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td style="width:123px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">10 microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">25G Precision Glide syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">acetaminophen oral suspension</td>
			<td>Tylenol (Children&#39;s)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Dilute to 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">anesthetic vaporizer</td>
			<td>Vetland</td>
			<td style="width:123px;">521-11-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">animal handling cloth</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Betadine</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td style="width:123px;">NDC-67618-151-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">compressed oxygen</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">cyclosporine A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">30024-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DAB staining kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D8418-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:123px;">715-035-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">electrical tape</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom Electric Co.&#160;</td>
			<td style="width:123px;">K.1070 - K.107018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Ideal Micro Drill Burr Set Of 5</td>
			<td>Cell Point Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">60-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Impact One Stereotaxic Impactor for CCI&#160;</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">39463920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td style="width:123px;">NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">lab bench timers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette puller</td>
			<td>MicroData Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">PMP-102</td>
			<td>Any puller will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope cover slips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope slide mounting medium</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:212px;">Product of choice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">mirror</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse anti-human nuclear antigen antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB1281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Mouse on Mouse blocking kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">needle holder hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic ointment</td>
			<td>Falcon Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:123px;">NDC-61314-631-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic box</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic cylinder</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">QSI motorized syringe pump</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">53311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Removable needle compression fitting</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">55750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small rodent stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">51925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">StemPro Accutase</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile alcohol prep pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">06-669-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sterile cotton swabs/Kendall Q-tips</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">540500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td style="width:123px;">NDC-0409-1966-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Stopwatches (2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">06-662-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Superfrost Plus Gold microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">15-188-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sutures - 5.0 silk with curved needle</td>
			<td>Oasis</td>
			<td style="width:123px;">MV-682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Patologia della malattia a causa di TBI progredisce dall'insulto meccanico primario ai processi di lesioni secondarie, tra cui apoptosi e infiammazione. La modellazione animale è stata preziosa nella ricerca di svelare i meccanismi di lesione e valutare potenziali terapie neuroprotettive. Questo protocollo descrive il modello di impatto corticale controllato (CCI) del TBI focale e a testa aperta. In particolare, vengono descritti i parametri per produrre una lieve lesione corticale unilaterale. Le conseguenze comportamentali del CCI vengono analizzate utilizzando il test di rimozione del nastro adesivo dell'integrazione sensoriale-continua bilaterale. Per quanto riguarda la terapia sperimentale per la patologia TBI, questo protocollo illustra anche un processo per il trapianto di cellule coltivate nel cervello. Le colture di cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono state scelte per il loro potenziale per mostrare un ripristino funzionale superiore nei pazienti con TBI umana. La sopravvivenza cronica degli hiPSC nel tessuto cerebrale del topo ospite viene rilevata utilizzando un processo immunohistochimico DAB modificato.

La chirurgia della craniectomia facilita la lesione cerebrale sperimentale e il trapianto di cellule terapeutiche: il modello di impatto corticale controllato della lesione cerebrale e la successiva terapia per il trapianto di cellule richiedono un'attenta rimozione del cranio sovrastante. La craniectomia può essere eseguita su qualsiasi superficie dorsale del cranio per consentire manipolazioni alla regione di interesse del cervello. Il diagramma in Figura 1 illustra uno s...

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Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Questo protocollo dimostra le metodologie per un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche a cranio aperto e il trapianto di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate nel sito della lesione. Test comportamentali e istologici dei risultati di queste procedure sono descritti anche in breve.

Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Il nostro protocollo dimostra un flusso di lavoro preclinico completo per testare l'efficacia terapeutica delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo dopo una lesione cerebrale. Questo modello di lesione cerebrale traumatica fornisce un alto grado di versatilità e riproducibilità controllando strettamente i parametri della forza meccanica e fornendo quindi una lesione ben definita. Queste procedure possono essere utilizzate per studiare i processi di lesione e recupero in altre regioni cerebrali e il metodo di trapianto è suscettibile di utilizzo con molti tipi di cellule.La perforazione craniciale è impegnativa in quanto la tecnica richiede destrezza manuale per padroneggiare la pressione, la velocità, la profondità e i movimenti fluidi appropriati. Documenta tutti gli eventi e pratica ampiamente. Per eseguire una craniectomia unilaterale, confermare la mancanza di risposta al dito del piedi nel mouse anestetizzato e fissare il mouse in un telaio stereotassico.Applicare un unguento oftalmico antibiotico agli occhi con un batuffolo di cotone sterile e una soluzione a base di iodio sulla zona del cuoio capelluto rasato. Rimuovere lo iodio con il 70% di etanolo e coprire l'animale con un drappo chirurgico fenestrato. Fare un'incisione della linea mediana da 1,5 a due centimetri sul cuoio capelluto e utilizzare tamponi di cotone sterili per pulire la ferita e cancellare la fascia sinistra della linea mediana al bregma.Utilizzate una sonda di impatto per identificare il sito di craniectomia e impostate la x uguale a zero, y è uguale a zero punto di riferimento stereotassico a bregma. Regolare la sonda lateralmente a due millimetri a sinistra della linea mediana. Utilizzare un pennarello finemente sicuro chirurgicamente per indire un cerchio di diametro di cinque millimetri intorno all'area di impatto presuntiva.Sollevare e ruotare il riflettore fuori posizione e completare il cerchio di cinque millimetri. Riportare brevemente il riflettore in posizione per verificare la precisione del cerchio di cinque millimetri. Quindi sollevare e ruotare il riflettore fuori posizione e utilizzare uno strumento a mano a micromotore rotante ad alta velocità dotato di una punta rotonda da 0,6 o 0,8 millimetri per fare un foro aperto nel cranio a una velocità massima dal 70 all'80%.Applicare una leggera pressione sul cranio durante la perforazione lungo il contorno circonferenziale di cinque millimetri all'interno di questo bordo e utilizzare le forcep per sollevare il lembo osseo risultante. La perforazione attraverso le linee di sutura può presentare ulteriori difficoltà in quanto l'osso viene interrotto e richiede ulteriore pressione. I vasi sanguigni possono essere in stretta associazione e quindi sono probabili eventi sanguinanti.Per indurre una lieve lesione da impatto corticale controllato, pulire la sonda del dispositivo di impatto con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol e spostare la sonda del dispositivo di impatto in posizione sopra la corteccia esposta. Abbassare la sonda fino a tocchi la superficie dura mater e contrassegnare questa posizione come z uguale a zero. Ritirare il pistone e passare a z è uguale a meno un millimetro e scaricare il pistone per influire sulla corteccia.Sollevare immediatamente il pistone e spostare il braccio fuori posizione e irrigare la corteccia con un generoso volume di salina e utilizzare semplici punti interrotti e sutura di seta 5-0 per chiudere l'incisione del cuoio capelluto. Quindi consegnare 10 milligrammi per chilogrammo di ciclosporina A per iniezione sottocutanea nel collotto e posizionare il mouse in una gabbia post-operatoria pulita pre-riscaldata con monitoraggio fino al pieno recupero. Circa 24 ore dopo la craniectomia, riposizionare il mouse nel telaio stereotassico.Coprire il mouse con il drappo chirurgico fenestrato. Lavare il sito di incisione con soluzione salina sterile per pulire il sito e allentare le suture. Utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% per sterilizzare delicatamente il sito di incisione e utilizzare pinzette sottili e forbici oftalmiche per rimuovere le suture.Quindi irrigare l'intervento chirurgico e il sito di craniectomia con abbondante soluzione salina sterile. In una cappa di biosicurezza in coltura cellulare, ruotare delicatamente o toccare il tubo delle cellule per garantire una sospensione cellulare omogenea. Utilizzare una micropipetta per caricare circa 7,5 microlitri di cellule in una siringa Hamilton attraverso l'estremità dello stantuffo.Tenendo la siringa con un angolo di 120 gradi con l'estremità dello stantuffo rivolta verso il basso, inserire lo stantuffo facendo attenzione a non introdurre una bolla d'aria tra la sospensione e la punta dello stantuffo. Attaccare l'assieme della guarnizione all'ago della pipetta e attaccare l'ago alla siringa. Spingere lo stantuffo per spostare la sospensione cellulare nell'ago della pipetta e attaccare la siringa alla pompa della siringa stereotassica.Far avanzare lo stantuffo per assicurarsi che l'assemblaggio della pompa della siringa funzioni correttamente e spostare l'ago nelle coordinate per l'iniezione. Allineare la punta dell'ago al bregma e impostare le coordinate x e y su zero. Spostare la punta dell'ago sulla craniectomia a due millimetri laterali e meno un millimetro posteriore a bregma e toccare la punta dell'ago sulla superficie dura mater.Sollevare leggermente l'ago, quindi fare una piccola incisione nella dura mater nel punto in cui l'ago ha preso contatto. Impostare la coordinata stereotassica su z uguale a zero e spingere lo stantuffo per confermare che la sospensione cellulare scorre adeguatamente prima di introdurre l'ago nel cervello. Introdurre l'ago nel cervello a una profondità di z uguale a meno 1,4 millimetri per posizionare l'innesto al bordo della materia grigia / materia bianca della corteccia profonda.Avviare la pompa della siringa per infondere la sospensione cellulare per un periodo di 15 minuti. Utilizzare un microscopio a lunga distanza di lavoro per monitorare il deflusso delle sospensioni cellulari che irriga il sito chirurgico con soluzione salina sterile durante l'iniezione per mantenere l'idratazione dei tessuti. Quando tutte le cellule sono state consegnate, ritirare lentamente l'ago del trapianto e irrigare il sito di intervento chirurgico con soluzione salina aggiuntiva prima di chiudere l'incisione con nuove suture.Quindi fornire assistenza post-operatoria come dimostrato. Per un test di rimozione del nastro adesivo, utilizzare prima un piccolo coltello da barba per tagliare pezzi gialli e rossi di nastro elettrico in tre strisce di cinque millimetri su una superficie di vetro liscia. Portare i topi nella sala prove comportamentale per almeno 30 minuti prima del test e utilizzare un panno di manipolazione per trattenere il mouse per la collotta del collo e della schiena in modo che il mouse trattiene le sopracciglia lontano dal corpo e dalla testa.Utilizzare una pinzetta per posizionare una striscia adesiva sulla superficie plantare di ogni zampa anteriore e utilizzare una pressione delicata e costante delle dita per fissare le strisce alle zampe. Posizionare rapidamente il mouse in un cilindro di plastica e iniziare due cronometri quando il mouse ha tutte e quattro le zampe sulla scatola di prova in plastica. Quindi usa i due cronometri per registrare le latenze per l'avviso della zampa sinistra, la rimozione della zampa sinistra, l'avviso della zampa destra e la rimozione della zampa destra.In questo esperimento pilota, la funzione dell'avanzino è stata confrontata solo nella craniectomia, nella lesione da impatto corticale controllato e nei topi ingenui. I topi sottoposti a intervento chirurgico hanno mostrato latenze transitori aumentate per notare stimoli adesivi per uno o tre giorni immediatamente dopo l'intervento chirurgico e deficit post-operatori transitori nella rimozione dell'adesivo dalla forepaw ipsilaterale. I topi che hanno subito un impatto corticale controllato, tuttavia, hanno mostrato notevoli deficit nelle prestazioni motorie nel contralaterale della forepaw alla lesione rispetto ai topi ingenui del giorno post-operatorio 28.L'immunostaining delle sezioni cerebrali del topo per l'antigene nucleare umano rivela che gli innesti cellulari umani possono essere chiaramente distinti dai tessuti ospiti nelle lesioni SHAM e nei cervelli ad impatto corticale controllato. È necessario osservare le procedure standard di sicurezza di laboratorio quando si maneggiano cellule umane coltivate e quando si maneggiano aghi per siringhe che entrano in contatto con roditori o farmaci immunosoppressivi. Le sezioni del tessuto cerebrale possono essere analizzate per l'espressione di marcatori neuroinfiammatori in quanto è prezioso sapere come l'innesto influisce sulla risposta alle lesioni del tessuto ospite e viceversa.Siamo rimasti sorpresi di trovare sottili differenze di sesso negli esiti del comportamento post-infortunio. Ora stiamo studiando se il sesso gioca un ruolo nella risposta neuroimmune alle lesioni cerebrali. Mani ferme, pazienza e pratica sono cruciali per sviluppare una buona tecnica di craniectomia.I danni collaterali causati da una craniectomia impropria possono compromettere l'area che si desidera prendere di mira per il trapianto di cellule.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Pluripotenti cellule staminali derivate cellule cardiache per la riparazione del miocardio

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo derivato dal sangue

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Un modello di Mouse chimerici del fegato umano di ipercolesterolemia familiare facendo uso degli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Saggio di microfluidic per la valutazione di adesione del leucocita alle cellule endoteliali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...