Name: controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells
Uploaded: 2019-07-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells at JoVE.co

この研究は、神経科学再生医療センター(CNRM、助成番号G170244014)からの助成金によって支援されました。我々は、接着剤除去パイロット研究におけるマヒマ・デューワンとクララ・セルブレードの支援に感謝します。クライスレーヌ・ラドムスキーは予備的な脳損傷と細胞移植手術を行った。USU CNRM前臨床研究コアラボのアマンダ・フーとローラ・タッカーは、それぞれ動物の手術と行動検査に関する貴重なアドバイスを提供しました。

このプロトコルに記載されているすべての実験は、ユニフォームサービス大学動物ケアおよび使用委員会によってレビューされ、承認されました。
1. 頭蓋切除術と制御された皮質影響
<ol><li>制御された皮質衝撃装置および外科用品の準備。<ol>
<li>創傷灌漑用の無菌生理生理生殖水の0.5 mLで1 mLのスリップチップシリンジをロードします。25Gの針を注射器に取り付けて灌?...

<ol>
	<li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury:+integrated+approaches+to+improve+prevention,+clinical+care,+and+research.">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li><li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).</li><li>Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury-Related+Emergency+Department+Visits,+Hospitalizations,+and+Deaths+-+United+States,+2007+and+2013.">Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013.</a> Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).</li><li>Fehily, B., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Mild+Traumatic+Brain+Injury:+Potential+Mechanisms+of+Damage.">Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage.</a> Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).</li><li>Kulbe, J. R., Hall, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+resting+functional+connectivity+after+traumatic+brain+injury+in+the+rat.">Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat.</a> PloS ONE. 9, 95280 (2014).</li><li>Sours, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Default+mode+network+interference+in+mild+traumatic+brain+injury+-+a+pilot+resting+state+study.">Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study.</a> Brain Research. 1537, 201-215 (2013).</li><li>Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+CNS+repair+following+TBI.">Strategies for CNS repair following TBI.</a> Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548, 592-596 (2017).</li><li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation+of+human+iPSC-derived+glial-rich+neural+progenitors+improves+lifespan+of+ALS+mice.">Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice.</a> Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).</li><li>Tong, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+interneuron+progenitor+transplantation+restores+normal+learning+and+memory+in+ApoE4+knock-in+mice+without+or+with+Abeta+accumulation.">Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Lischka, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+mouse+cortical+but+not+isogenic+human+astrocyte+feeder+layers+enhance+the+functional+maturation+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+in+culture.">Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture.</a> Glia. 66, 725-748 (2018).</li><li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesive+removal+test:+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice.">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).</li><li>Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+sensorimotor+function+in+mouse+models+of+Parkinson's+disease.">Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , (2004).</li><li>Jacobs, G. H., Williams, G. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment.">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386, 493-495 (1997).</li><li>Piltti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+dose+alters+the+dynamics+of+human+neural+stem+cell+engraftment,+proliferation+and+migration+after+spinal+cord+injury.">Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury.</a> Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+controlled+cortical+impact+traumatic+brain+injury+in+rats+and+mice+dictates+degree+of+behavioral+deficits.">Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits.</a> Brain Research. 1287, 157-163 (2009).</li><li>Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats.">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li><li>Namjoshi, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+biomechanical+and+biological+threshold+of+murine+mild+traumatic+brain+injury+using+CHIMERA+(Closed+Head+Impact+Model+of+Engineered+Rotational+Acceleration).">Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration).</a> Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).</li><li>Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+dysfunction+and+delayed+neurological+deficits+in+mild+traumatic+brain+injury+induced+by+blast+shock+waves.">Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).</li><li>Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+mild+traumatic+brain+injury:+translation+of+physiological+and+anatomic+injury.">Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury.</a> Neurosurgery. 75, 34-49 (2014).</li><li>Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+to+define+mild,+moderate,+and+severe+traumatic+brain+injury+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model.">Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model.</a> Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).</li><li>Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Male+and+Female+C57BL/6J+Mice+on+Motor+and+Cognitive+Tasks+Commonly+Used+in+Pre-Clinical+Traumatic+Brain+Injury+Research.">Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).</li><li>Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+long+is+too+long?+The+lack+of+consensus+regarding+the+post-concussion+syndrome+diagnosis.">How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis.</a> Brain Injury. 29, 798-803 (2015).</li><li>Hurst, J. L., West, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+anxiety+in+laboratory+mice.">Taming anxiety in laboratory mice.</a> Nature Methods. 7, 825-826 (2010).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+behavioral+testing+after+focal+ischemia+in+the+mouse:+functional+recovery+and+the+effects+of+gender.">Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender.</a> Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).</li><li>Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+cortical+lesion+effects+and+treatment+with+nimodipine.">Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine.</a> Physiology &amp; Behavior. 47, 1045-1052 (1990).</li><li>Al-Ali, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mTOR+Substrate+S6+Kinase+1+(S6K1)+Is+a+Negative+Regulator+of+Axon+Regeneration+and+a+Potential+Drug+Target+for+Central+Nervous+System+Injury.">The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).</li><li>Pleasant, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+neurodegeneration+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model+is+influenced+by+impactor+tip+shape:+implications+for+mechanistic+and+therapeutic+studies.">Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).</li></ol>

実験再生療法の試験モデルシステムとしての軽度CCI CCIモデルは皮質への機械的損傷の後の組織機能不全のメカニズムを調査するための貴重な用具である。傷害の変数の力性はこのモデルの魅力的な特徴である。衝撃のZ深度を変化させる、速度、または所望時間は、研究者が所望する傷害の重症度を、研究者10、25によって増減させることができる。<su...

外傷性脳損傷(TBI)は、頭部への打撃または物体または爆風波からの直接的な損傷による間接的な機械的力(回転加速度/減速または逆クーデター)による脳への後天的損傷の一般的な用語である。TBIは、世界の死亡者の約9%の原因であると推定されており、年間5,000万例の症例が1,2例と推定されています。米国疾病管理予防センターの2017年の報告書によると、2013年には、米国のTBIによる合計280万人の病院訪問と死亡がありました。多くの穏やかなTBAは毎年報告されていません。深刻なTBIは、認知、運動機能、および生活の全体的な質の生涯の障害につながることができます。軽度のTBI、特に反復的なスポーツ関連のTBIの結果は、最近、彼らの陰湿な健康影響4、5のために高く評価されています。
前臨床モデリングは、TBIの新しい機械的洞察と潜在的な修復療法を開発する上で重要な要素です。TBIの制御された皮質衝撃(CCI)モデルは皮質への機械的挫傷のオープンヘッドモデルである。衝撃パラメータは、軽度から重度の6までのCCI傷害を生成するために変更することができます。CCIの傷害は、TBIの他の閉じた頭部モデルと見られるように、拡散ではなく焦点である。CCIは、反対方皮質が内部比較器として機能するように、一方的な傷害を誘発するために行うことができる。このプロトコルは、一次身体感覚および運動領域を包含する皮質の一部に対する軽度のCCIの特性を示す。この皮質領域は、多数の行動検査が傷害による欠陥7を検出できる感覚運動行動への関与のために選ばれた。TBIの治療介入による行動改善も検出できる。
TBIの特徴は、負傷した地域における広範な神経機能障害である。負傷したニューロンは細胞死を受け、ニューロンネットワーク接続は8,9.TBIは内因性幹細胞の募集を妨害し、さらに下流行動の赤字10,11を引き起こした。 神経幹細胞と幹細胞由来細胞の移植は、傷ついた脳の機能を回復させる可能性として探求されている。損傷した神経回路を回復させる可能性に加えて、移植された細胞は、TBI12からの神経生存および機能回復を促進するパラクリン効果を発揮する。様々な細胞型が前臨床移植され、神経疾患13、14、15のモデルにおけるそれらの修復可能性を評価した。誘導多能性幹細胞技術16の最近の普及は、実験的使用のための多数のヒト幹細胞株の開発を促進している。hiPSC由来細胞による前臨床試験は、ヒト疾患に対する特定の細胞株の潜在的な治療有効性を特徴付ける重要な第一歩である。本研究室では、外傷性脳損傷からの回復を支援する移植可能な細胞を追求するために、hiPSCを神経型17に区別するためのプロトコルを開発した。
このプロトコルの実験は、一方的なCCIを使用して、成体マウスの左身体感覚および運動皮質にTBIを誘導する。軽度のCCI損傷は、機能回復に対するhiPSC由来神経細胞移植の影響を追跡するために使用される右前足の持続的な機能的欠損をもたらす。このプロトコルにおけるフォアポーセンサ運動試験は、Bouetおよび同僚18によって確立された方法論から適応され、フレミングと同僚19によって以前に実証された。 このプロトコルは、実験的脳損傷、hiPS細胞の治療移植、および実験結果測定の行動および組織学的分析を行うための完全なワークフローを概説する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:774px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;309659</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1.7 ml flip top test tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td style="width:123px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">10 microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">25G Precision Glide syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">acetaminophen oral suspension</td>
			<td>Tylenol (Children&#39;s)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Dilute to 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">anesthetic vaporizer</td>
			<td>Vetland</td>
			<td style="width:123px;">521-11-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">animal handling cloth</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Betadine</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td style="width:123px;">NDC-67618-151-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">compressed oxygen</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">cyclosporine A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">30024-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DAB staining kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D8418-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:123px;">715-035-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">electrical tape</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom Electric Co.&#160;</td>
			<td style="width:123px;">K.1070 - K.107018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Ideal Micro Drill Burr Set Of 5</td>
			<td>Cell Point Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">60-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Impact One Stereotaxic Impactor for CCI&#160;</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">39463920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td style="width:123px;">NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">lab bench timers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette puller</td>
			<td>MicroData Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">PMP-102</td>
			<td>Any puller will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope cover slips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope slide mounting medium</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:212px;">Product of choice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">mirror</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse anti-human nuclear antigen antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB1281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Mouse on Mouse blocking kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">needle holder hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic ointment</td>
			<td>Falcon Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:123px;">NDC-61314-631-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic box</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic cylinder</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">QSI motorized syringe pump</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">53311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Removable needle compression fitting</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">55750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small rodent stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">51925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">StemPro Accutase</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile alcohol prep pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">06-669-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sterile cotton swabs/Kendall Q-tips</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">540500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td style="width:123px;">NDC-0409-1966-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Stopwatches (2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">06-662-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Superfrost Plus Gold microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">15-188-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sutures - 5.0 silk with curved needle</td>
			<td>Oasis</td>
			<td style="width:123px;">MV-682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells

外傷性脳損傷(TBI)は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。TBIによる疾患病理学は、一次機械的侮辱から、アポトーシスおよび炎症を含む二次傷害プロセスに進行する。動物のモデリングは、傷害メカニズムを解明し、潜在的な神経保護療法を評価するための検索で貴重でした。このプロトコルは、焦点、オープンヘッドTBIの制御された皮質衝撃(CCI)モデルについて説明します。具体的には、軽度の一方的皮質損傷を産生するためのパラメータが記載されている。CCIの行動結果は、両側感覚運動統合の粘着テープ除去試験を用いて分析される。TBI病理の実験療法に関しては、このプロトコルはまた、培養細胞を脳に移植するプロセスを示す。ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)に由来する神経細胞培養物は、ヒトTBI患者において優れた機能回復を示す可能性のために選択された。宿主マウス脳組織におけるhiPSCの慢性生存は、修飾されたDAB免疫組織化学プロセスを用いて検出される。

頭蓋切除手術は、実験的な脳損傷と治療細胞移植を容易にする:脳損傷およびその後の細胞移植療法の制御された皮質衝撃モデルは、上の頭蓋骨の慎重な除去を必要とする。頭蓋切除術は、目的の脳領域への操作を可能にするために、頭蓋骨の任意の後部面で行われてもよい。図1の図は、原発性身体感覚および運動皮質を明らかにするために、直径5mmの頭蓋...

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Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

このプロトコルは、オープン頭蓋骨外傷性脳損傷のマウスモデルの方法論を示し、培養ヒト誘導多能性幹細胞由来細胞を傷害部位に移植する。これらの手順からの結果の行動および組織学的検査も簡単に説明される。

ヒト誘導多能性幹細胞由来神経細胞の治療移植によるマウス脳損傷の制御された皮質衝撃モデル

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

我々のプロトコルは、脳損傷後のヒト誘発多能性幹細胞の治療効果をテストするための包括的な前臨床ワークフローを示している。この外傷性脳損傷モデルは、機械的な力のパラメータを厳密に制御し、明確に定義された傷害を提供することによって、高度な汎用性と再現性を提供します。これらの手順は、他の脳領域における傷害および回復過程を研究するために使用することができ、移植方法は、多くの細胞タイプで使用することが可能である。頭蓋掘削は、適切な圧力、速度、深さ、滑らかな動きを習得するために手作業の器用さが必要であるため、困難です。すべてのイベントを記録し、広範囲に練習します。一方的なクラニエクトミーを行うために、麻酔マウスのつまみつまみに対する応答の欠如を確認し、ステレオタキシックフレームでマウスを固定します。抗生物質の眼軟膏を、剃った頭皮領域に無菌綿棒とヨウ素ベースの溶液で目に塗布する。70%エタノールでヨウ素を取り除き、フェネレートされた外科用ドレープで動物を覆います。頭皮に1.5〜2センチメートルの中線切開を行い、生殖不能綿棒を使用して傷をきれいにし、ブレグマで中線の左の鼻隠しをクリアします。エコンサイクサプローブを使用してクラニエクトミーサイトを識別し、xがゼロに等しく、yはゼロステレオタキシック基準点をbregmaに設定します。プローブを正線の左 2 ミリメートルに横に調整します。微細な先端の外科的に安全なマーカーを使用して、推定衝撃領域の周りに直径5ミリメートルの円をランドマーク化します。エコンターを上げて回転させて5ミリの円を完成させます。5ミリメートルの円の精度を確認するために、インコンサイターを簡単に位置に戻します。次に、インコンパクタを位置から上げ、回転させ、円形の先端0.6または0.8ミリメートルのバリドリルビットを装備した高速回転式マイクロモーターキットハンドツールを使用して、70〜80%の最高速度で頭蓋骨に開いた穴を作ります。この境界内の 5 ミリメートル周縁の輪郭に沿ってドリルしながら、頭蓋骨に光圧を適用し、鉗子を使用して得られたボーン フラップを持ち上げます。縫合線を通して掘削は骨が中断され、追加の圧力を必要とするので、追加の困難を提示するかもしれない。血管は密接に関連している可能性があるため、出血イベントが発生する可能性があります。軽度の制御された皮質衝撃損傷を誘発するには、無菌アルコール準備パッドでインシクタプローブを洗浄し、露出した皮質の上の位置にインポジションプローブを戻します。プローブをデュラマーターサーフェスに触れるまで下げ、この位置を z がゼロに等しいマークします。ピストンを引き出し、z等しいマイナス1ミリメートルに移動し、コルテックスに影響を与えるためにピストンを排出します。すぐにピストンを上げ、位置から腕を動かし、生理食い物の寛大なボリュームで皮質を灌漑し、頭皮の切開を閉じるために簡単な中断されたステッチと5-0シルク縫合糸を使用します。その後、スクラフに皮下注射によってシクロスポリンAのキログラム当たり10ミリグラムを提供し、完全な回復まで監視してきれいな前温めの術後ケージにマウスを置きます.クラニエクトミーの約24時間後、マウスをステレオタキシックフレームに戻します。フェネストされた外科のドレープでマウスを覆う。切開部位を滅菌生理的に洗浄し、部位をきれいにし、縫合糸を緩める。70%エタノール浸漬綿棒を使用して、切開部位を優しく殺菌し、細かいピンセットと眼科用はさみを使用して縫合糸を取り除きます。その後、豊富な無菌生理学で手術とクラニエクトミー部位を灌漑します。細胞培養バイオセーフティフードでは、細胞のチューブを穏やかに旋回またはタップして、均質な細胞懸濁を確実にします。マイクロピペットを使用して、プランジャーエンドを通して約7.5マイクロリットルの細胞をハミルトン注射器にロードします。プランジャの端を下にして120度の角度でシリンジを保持し、サスペンションとプランジャーチップの間に気泡を導入しないように気をつけてプランジャーを挿入します。ガスケットアセンブリをピペット針に取り付け、針を注射器に取り付けます。プランジャーを押して細胞懸濁液をピペット針に移動させ、シリンジを立体性シリンジポンプに取り付けます。プランジャーを進めて、シリンジポンプアセンブリが正常に動作していることを確認し、注射用の座標に針を移動します。針先をブレグマに合わせ、x 座標と y 座標を 0 に設定します。針の先端を針切除術の上に2ミリメートル横向きに移動し、後方から1ミリメートルを引いた後方をブレグマに移動し、針の先端を硬膜の表面に触れます。針を少し上げて、針が接触した場所で硬膜に小さな切開を行います。ステレオタキシック座標をz等しいゼロに設定し、プランジャーを押して細胞懸濁液が適切に流れているか確認してから、針を脳に導入します。深皮質の灰色物質/白質の境界に移植片を配置するためにz等しいzの深さに脳に針を導入します。シリンジポンプを起動して、15分間にわたって細胞懸濁液を注入します。長い作動距離の顕微鏡を使用して、組織の水分補給を維持するために、注射中に生殖不能生理食塩水で手術部位を灌漑する細胞懸濁液流出を監視する。すべての細胞が送達されたら、移植針をゆっくりと引き出し、新しい縫合糸で切開を閉じる前に追加の生理的な生理布で手術部位を灌漑する。その後、実証されているように術後のケアを提供します。粘着テープの取り外し試験では、まず小さなカミソリナイフを使用して、滑らかなガラス表面に3×5ミリメートルのストリップに黄色と赤の電気テープをカットします。マウスを試験の前に少なくとも30分間行動検査室に持ち込み、ハンドリングクロスを使用して首と背中の擦り傷でマウスを拘束し、マウスが前足を体と頭から遠ざけます。ピンセットを使用して各前足の足底面に粘着ストリップを配置し、繊細で一貫した指圧を使用して足にストリップを固定します。マウスがプラスチック製の試験ボックスに4本の足をすべて持っている場合は、マウスを素早くプラスチックシリンダーに入れ、2つのストップウォッチを開始します。その後、左足通知、左足の除去、右足の通知と右足の除去のための遅延を記録するために2つのストップウォッチを使用しています。本試験実験では、前肢機能をクラニエクトミー単独で比較し、皮質衝撃損傷およびナイーブマウスを制御した。手術を受けたマウスは、手術直後から1〜3日間の粘着刺激に気づくために一時的な遅延が増加し、イピラテラジラエポーからの粘着除去における一過性術後の欠損を示した。しかし、制御された皮質の影響を受けたマウスは、術後28日目のナイーブマウスと比較して、前足の運動性能に有意な欠陥を示した。ヒト核抗原に対するマウス脳切片の免疫染色は、ヒト細胞移植片がSHAM傷害および制御された皮質影響脳における宿主組織と明確に区別できることを明らかにする。培養ヒト細胞を扱う場合や、げっ歯類や免疫抑制薬に接触する注射針を扱う場合は、標準的な検査室の安全手順を遵守する必要があります。脳組織切片は、移植片が宿主組織傷害反応に及ぼす影響を知ることは価値があるため、神経炎症マーカーの発現について分析することができる。私たちは、傷害後の行動の結果に微妙な性差を見つけて驚きました。私たちは現在、性が脳損傷に対する神経免疫反応に役割を果たしているかどうかを調査しています。安定した手、忍耐、そして練習は良いクラニエクトミー技術を開発するために重要です。不適切なクラニエクトミーによる副次的損傷は、細胞移植の対象とする領域を損なう可能性があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

マイクロ電極アレイ上のネットワーク・アクティビティを測定するための人工多能性幹細胞の急速な神経分化

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

誘導多能性幹細胞由来肝細胞を用いた家族性高コレステロール血症ひと肝臓キメラマウス モデル

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...