Name: controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells
Uploaded: 2019-07-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells at JoVE.co

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do centro de neurociência e medicina regenerativa (CNRM, número de subvenção G170244014). Agradecemos a assistência de Mahima Dewan e clara Selbrede em estudos piloto de remoção de adesivos. Kryslaine Radomski realizou lesões cerebrais preliminares e cirurgias de transplante de células. Amanda Fu e Laura Tucker do laboratório central de estudos pré-clínicos do USU CNRM forneceram conselhos valiosos sobre cirurgias animais e testes de comportamento, respectivamente.

Todos os experimentos descritos neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais universitários da Uniformed Services.
1. craniectomia e impacto cortical controlado
<ol><li>Preparação do dispositivo de impacto cortical controlado e suprimentos cirúrgicos.<ol>
<li>Coloque uma seringa de 1 mL de ponta de deslizamento com 0,5 mL de soro fisiológico estéril para irrigação de feridas. Coloque uma agulha de 25 G na seringa para controlar a irrigação.<...

<ol>
	<li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury:+integrated+approaches+to+improve+prevention,+clinical+care,+and+research.">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li><li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).</li><li>Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+resting+functional+connectivity+after+traumatic+brain+injury+in+the+rat.">Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat.</a> PloS ONE. 9, 95280 (2014).</li><li>Sours, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Default+mode+network+interference+in+mild+traumatic+brain+injury+-+a+pilot+resting+state+study.">Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study.</a> Brain Research. 1537, 201-215 (2013).</li><li>Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+interneuron+progenitor+transplantation+restores+normal+learning+and+memory+in+ApoE4+knock-in+mice+without+or+with+Abeta+accumulation.">Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Lischka, F. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+dose+alters+the+dynamics+of+human+neural+stem+cell+engraftment,+proliferation+and+migration+after+spinal+cord+injury.">Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury.</a> Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+controlled+cortical+impact+traumatic+brain+injury+in+rats+and+mice+dictates+degree+of+behavioral+deficits.">Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits.</a> Brain Research. 1287, 157-163 (2009).</li><li>Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats.">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li><li>Namjoshi, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+biomechanical+and+biological+threshold+of+murine+mild+traumatic+brain+injury+using+CHIMERA+(Closed+Head+Impact+Model+of+Engineered+Rotational+Acceleration).">Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration).</a> Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).</li><li>Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+dysfunction+and+delayed+neurological+deficits+in+mild+traumatic+brain+injury+induced+by+blast+shock+waves.">Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).</li><li>Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+mild+traumatic+brain+injury:+translation+of+physiological+and+anatomic+injury.">Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury.</a> Neurosurgery. 75, 34-49 (2014).</li><li>Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+to+define+mild,+moderate,+and+severe+traumatic+brain+injury+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model.">Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model.</a> Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).</li><li>Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Male+and+Female+C57BL/6J+Mice+on+Motor+and+Cognitive+Tasks+Commonly+Used+in+Pre-Clinical+Traumatic+Brain+Injury+Research.">Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).</li><li>Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+long+is+too+long?+The+lack+of+consensus+regarding+the+post-concussion+syndrome+diagnosis.">How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis.</a> Brain Injury. 29, 798-803 (2015).</li><li>Hurst, J. L., West, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+anxiety+in+laboratory+mice.">Taming anxiety in laboratory mice.</a> Nature Methods. 7, 825-826 (2010).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+behavioral+testing+after+focal+ischemia+in+the+mouse:+functional+recovery+and+the+effects+of+gender.">Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender.</a> Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).</li><li>Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+cortical+lesion+effects+and+treatment+with+nimodipine.">Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine.</a> Physiology &amp; Behavior. 47, 1045-1052 (1990).</li><li>Al-Ali, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mTOR+Substrate+S6+Kinase+1+(S6K1)+Is+a+Negative+Regulator+of+Axon+Regeneration+and+a+Potential+Drug+Target+for+Central+Nervous+System+Injury.">The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).</li><li>Pleasant, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+neurodegeneration+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model+is+influenced+by+impactor+tip+shape:+implications+for+mechanistic+and+therapeutic+studies.">Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).</li></ol>

CCI leve como um sistema modelo para testar a terapia regenerativa experimental O modelo CCI é uma ferramenta valiosa para investigar mecanismos de disfunção tecidual após lesão mecânica no córtex. A tunabilidade dos parâmetros de ferimento é uma característica atrativa deste modelo. Alterando a profundidade Z de impacto, a velocidade, ou tempo de permanência pode aumentar ou diminuir a severidade da lesão conforme desejado pelo investigador10,<sup class=...

A lesão cerebral traumática (TCE) é um termo geral para a lesão adquirida no cérebro devido a forças mecânicas indiretas (aceleração/desaceleração rotacional ou contra-golpe) de golpes na cabeça ou dano direto de objetos ou ondas de explosão. Estima-se que a TBI seja a causa de aproximadamente 9% das mortes mundiais e observada em uma estimativa de 50 milhões casos por ano1,2. Um relatório 2017 dos centros de controle e prevenção de doenças estimou que, em 2013, houve um total de 2,8 milhões visitas hospitalares e óbitos por TBI nos Estados Unidos3. Muitos TBIs mais leves não são relatados todos os anos. TBI grave pode levar ao comprometimento vitalício da cognição, função motora e qualidade de vida geral. As conseqüências da TBI leve, especialmente TBI repetitiva relacionada ao esporte, foram apenas recentemente apreciadas por seus efeitos insidiosos de saúde4,5.
A modelagem pré-clínica é um componente vital do desenvolvimento de novas percepções mecanísticas e da terapia restauradora potencial para a TBI. O modelo controlado do impacto cortical (CCI) de TBI é um modelo da abrir-cabeça de ferimento mecânico da contusão ao córtice. Os parâmetros de impacto podem ser modificados para produzir lesões CCI que variam de leve a grave6. Os ferimentos do CCI são focais um pouco do que difuso, como visto com outros modelos de cabeça fechados de TBI. CCI pode ser realizado para induzir uma lesão unilateral, de tal forma que o córtex contralateral pode servir como um comparador interno. Este protocolo demonstra as características de um CCI suave a uma parcela do córtice que abrange as regiões somatosensory e motoras preliminares. Esta área cortical foi escolhida para sua participação em comportamentos sensorimotor para que os testes de comportamento numerosos podem detectar deficits ferimento-induzidos7. As melhorias comportamentais devido às intervenções terapêuticas para o TBI podem ser detectadas, também.
Uma característica da TBI é a disfunção neural generalizada na região lesada. Neurônios feridos sofrem morte celular, e a conectividade de rede neuronal é interrompida8,9. O TBI interrompe o recrutamento de células-tronco endógenas, o que leva a mais déficits de comportamento downstream10,11.  A transplantação de pilhas de haste neural e de pilhas de pilha-derivadas da haste foi explorada como uma possibilidade restaurar a função no cérebro ferido. Além do potencial para restaurar os circuitos neurais danificados, as células transplantadas exercem efeitos paracrinos que promovem a sobrevida neuronal e a recuperação funcional do TBI12. Uma variedade de tipos de células foram transplantadas pré-clinicamente para avaliar seu potencial restaurador em modelos de distúrbios neurológicos13,14,15. A recente popularização da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas16 facilitou o desenvolvimento de inúmeras linhagens de células-tronco humanas para uso experimental. O teste pré-clínico com células derivadas de hiPSC é um primeiro passo importante para caracterizar a potencial eficácia terapêutica de uma determinada linha celular contra doenças humanas. Este laboratório desenvolveu protocolos para diferenciar hipscs aos fenótipos neural17 na perseguição de pilhas transplantáveis para ajudar à recuperação do ferimento de cérebro traumático.
As experiências neste protocolo usam um CCI unilateral para induzir o TBI ao córtice somatosensory e do motor esquerdo de ratos adultos. Uma lesão leve do CCI conduz a um deficit funcional sustentado no forepaw direito que é usado para controlar os efeitos do Engraftment hiPSC-derivado da pilha neural na recuperação funcional. O teste sensorimotor do forepaw neste protocolo foi adaptado da metodologia estabelecida por Bouet e por colegas18 e demonstrado previamente por Fleming e por colegas19.  Este protocolo esboça um fluxo de trabalho completo para executar uma lesão cerebral experimental, transplantação terapêutica de pilhas dos quadris, e análise comportamental e histologic de medidas experimentais do resultado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:774px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;309659</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1.7 ml flip top test tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td style="width:123px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">10 microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">25G Precision Glide syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">acetaminophen oral suspension</td>
			<td>Tylenol (Children&#39;s)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Dilute to 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">anesthetic vaporizer</td>
			<td>Vetland</td>
			<td style="width:123px;">521-11-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">animal handling cloth</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Betadine</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td style="width:123px;">NDC-67618-151-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">compressed oxygen</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">cyclosporine A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">30024-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DAB staining kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D8418-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:123px;">715-035-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">electrical tape</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom Electric Co.&#160;</td>
			<td style="width:123px;">K.1070 - K.107018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Ideal Micro Drill Burr Set Of 5</td>
			<td>Cell Point Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">60-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Impact One Stereotaxic Impactor for CCI&#160;</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">39463920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td style="width:123px;">NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">lab bench timers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette puller</td>
			<td>MicroData Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">PMP-102</td>
			<td>Any puller will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope cover slips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope slide mounting medium</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:212px;">Product of choice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">mirror</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse anti-human nuclear antigen antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB1281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Mouse on Mouse blocking kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">needle holder hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic ointment</td>
			<td>Falcon Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:123px;">NDC-61314-631-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic box</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic cylinder</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">QSI motorized syringe pump</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">53311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Removable needle compression fitting</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">55750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small rodent stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">51925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">StemPro Accutase</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile alcohol prep pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">06-669-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sterile cotton swabs/Kendall Q-tips</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">540500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td style="width:123px;">NDC-0409-1966-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Stopwatches (2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">06-662-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Superfrost Plus Gold microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">15-188-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sutures - 5.0 silk with curved needle</td>
			<td>Oasis</td>
			<td style="width:123px;">MV-682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells

A lesão cerebral traumática (TCE) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A patologia da doença devido ao TBI progride do insulto mecânico preliminar aos processos secundários da lesão, incluindo o apoptose e a inflamação. A modelagem animal tem sido valiosa na busca de desvendar os mecanismos de lesão e avaliar potenciais terapias neuroprotetoras. Este protocolo descreve o modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI focal, de cabeça aberta. Especificamente, os parâmetros para produzir um ferimento cortical unilateral suave são descritos. As conseqüências comportáveis do CCI são analisadas usando o teste da remoção da fita adesiva da integração sensorimotor bilateral. A respeito da terapia experimental para a patologia de TBI, este protocolo igualmente ilustra um processo para transplantar pilhas cultivadas no cérebro. As culturas de pilha neural derivadas das pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) foram escolhidas para seu potencial mostrar a restauração funcional superior em pacientes humanos de TBI. A sobrevivência crônica de hiPSCs no tecido cerebral do rato do anfitrião é detectada usando um processo immunohistochemical modificado de DAB.

A cirurgia da craniectomia facilita a lesão cerebral experimental e a transplantação terapêutica da pilha: o modelo de impacto cortical controlado de ferimento de cérebro e a terapia subseqüente da transplantação da pilha exigem a remoção cuidadosa do crânio sobrejacente. A craniectomia pode ser realizada em qualquer superfície dorsal do crânio para permitir manipulações para a região cerebral de interesse. O diagrama na Figura 1 retrata um esquema craniectom...

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Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Este protocolo demonstra as metodologias para um modelo do rato do ferimento de cérebro traumático do abrir-crânio e a transplantação de pilhas células-derivadas pluripotentes induzidas humanas cultivadas no local da lesão. Os testes comportamentais e histologic dos resultados destes procedimentos são descritos igualmente em breve.

Modelo de impacto cortical controlado da lesão cerebral do rato com transplantação terapêutica de células neurais pluripotentes induzidas humanas da pilha de haste

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Nosso protocolo demonstra um fluxo de trabalho pré-clínico abrangente para testar a eficácia terapêutica de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem após lesão cerebral. Este modelo de lesão cerebral traumática fornece um alto grau de versatilidade e reprodutibilidade, controlando firmemente os parâmetros da força mecânica e, portanto, proporcionando uma lesão bem definida. Esses procedimentos podem ser usados para estudar processos de lesão e recuperação em outras regiões cerebrais e o método de transplante é capaz de usar com muitos tipos de células.A perfuração craniana é desafiadora, pois a técnica requer destreza manual para dominar a pressão, velocidade, profundidade e movimentos suaves apropriados. Documente todos os eventos e pratique extensivamente. Para realizar uma craniectomia unilateral, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo no mouse anestesiado e fixe o mouse em um quadro estereotaxic.Aplique pomada oftalmica antibiótico aos olhos com um cotonete estéril e solução à base de iodo na área do couro cabeludo raspado. Retire o iodo com 70% de etanol e cubra o animal com uma cortina cirúrgica fenestrada. Faça uma incisão média de 1,5 a 2 centímetros no couro cabeludo e use cotonetes estéreis para limpar a ferida e limpar a fáscia deixada da linha média em bregma.Use uma sonda impactante para identificar o local da craniectomia e definir o x é igual a zero, y é igual a ponto de referência estereotaxic zero a bregma. Ajuste a sonda lateralmente para dois milímetros à esquerda da linha média. Use um marcador cirurgicamente seguro de ponta fina para marcar um círculo de cinco milímetros de diâmetro ao redor da área de impacto presunçoso.Levante e gire o impactor fora de posição e complete o círculo de cinco milímetros. Retorne brevemente o impactor em posição para verificar a precisão do círculo de cinco milímetros. Em seguida, levante e gire o impactador fora de posição e use uma ferramenta manual de micro motor rotativo de alta velocidade equipada com uma broca de rebarba redonda de 0,6 ou 0,8 milímetros para fazer um orifício aberto no crânio a uma velocidade máxima de 70 a 80%.Aplique pressão leve no crânio enquanto perfura ao longo do contorno circunferencial de cinco milímetros dentro desta borda e use fórceps para levantar a aba óssea resultante. Perfurar através de linhas de sutura pode apresentar dificuldade adicional, pois o osso é interrompido e requer pressão adicional. Os vasos sanguíneos podem estar em estreita associação e, portanto, eventos de sangramento são prováveis.Para induzir uma leve lesão de impacto cortical controlada, limpe a sonda impactante com uma almofada de preparação de álcool estéril e mova a sonda impactor de volta à posição sobre o córtex exposto. Abaixe a sonda até que toque a superfície dura mater e marque esta posição como z é igual a zero. Retire o pistão e mova-se para z é igual a menos um milímetro e descarreça o pistão para impactar o córtex.Levante imediatamente o pistão e mova o braço para fora da posição e irrigar o córtex com um volume generoso de soro fisiológico e use simples pontos interrompidos e sutura de seda 5-0 para fechar a incisão do couro cabeludo. Em seguida, entregue 10 miligramas por quilograma de Ciclosporina A por injeção subcutânea no escroto e coloque o mouse em uma gaiola pós-operatória limpa pré-aquecida com monitoramento até a recuperação completa. Cerca de 24 horas após a craniectomia, coloque o mouse de volta no quadro estereotaxico.Cubra o mouse com a cortina cirúrgica fenestrada. Lavar o local de incisão com soro fisiológico estéril para limpar o local e soltar as suturas. Use um cotonete de algodão 70% encharcado de etanol para esterilizar suavemente o local da incisão e use pinças finas e tesouras oftálmicas para remover as suturas.Em seguida, irrigar o local da cirurgia e craniectomia com soro fisiológico abundante estéril. Em uma cultura celular, a biossegurança, gire suavemente ou toque no tubo das células para garantir uma suspensão celular homogênea. Use uma micropipette para carregar aproximadamente 7,5 microliters de células em uma seringa Hamilton através da extremidade do êmbolo.Segurando a seringa em um ângulo de 120 graus com a extremidade do êmbolo voltada para baixo, insira o êmbolo tomando cuidado para não introduzir uma bolha de ar entre a suspensão e a ponta do êmbolo. Coloque o conjunto da junta na agulha da pipeta e coloque a agulha na seringa. Empurre o êmbolo para mover a suspensão da célula para a agulha pipeta e conecte a seringa à bomba de seringa estereotíxica.Avance o êmbolo para ter certeza de que o conjunto da bomba de seringa está funcionando corretamente e mova a agulha para as coordenadas para injeção. Alinhe a ponta da agulha para bregma e coloque as coordenadas x e y a zero. Mova a ponta da agulha sobre a craniectomia para dois milímetros laterais e menos um milímetro posterior para bregma e toque a ponta da agulha para a superfície dura mater.Levante a agulha ligeiramente e faça uma pequena incisão na dura-se mater no local onde a agulha fez contato. Defina a coordenada estereotaxic para z é igual a zero e empurre o êmbolo para confirmar que a suspensão celular está fluindo adequadamente antes de introduzir a agulha no cérebro. Introduzir a agulha no cérebro a uma profundidade de z é igual a menos 1,4 milímetros para colocar o enxerto na borda de matéria cinzenta/matéria branca do córtex profundo.Inicie a bomba de seringa para infundir a suspensão da célula durante um período de 15 minutos. Use um microscópio de longa distância de trabalho para monitorar o fluxo de suspensão celular irrigando o local da cirurgia com soro fisiológico estéril durante a injeção para manter a hidratação tecidual. Quando todas as células tiverem sido entregues, retire lentamente a agulha de transplante e irrigar o local da cirurgia com soro fisiológico adicional antes de fechar a incisão com novas suturas.Em seguida, prestar cuidados pós-operatórios como demonstrado. Para um teste de remoção de fita adesiva, primeiro use uma pequena faca de barbear para cortar pedaços amarelos e vermelhos de fita elétrica em tiras de três por cinco milímetros em uma superfície de vidro lisa. Leve os ratos para a sala de testes de comportamento por pelo menos 30 minutos antes do teste e use um pano de manuseio para conter o rato pelo pescoço e costas para que o mouse mantenha as previs longe de seu corpo e cabeça.Use pinças para colocar uma tira adesiva na superfície plantar de cada prentosse e use uma pressão delicada e consistente dos dedos para fixar as tiras nas patas. Coloque rapidamente o mouse em um cilindro de plástico e inicie dois cronômetros quando o mouse tiver todas as quatro patas na caixa de teste de plástico. Em seguida, use os dois cronômetros para registrar as latências para aviso da pata esquerda, remoção da pata esquerda, aviso da pata direita e remoção da pata direita.Neste experimento piloto, a função forelimb foi comparada apenas na craniectomia, lesão de impacto cortical controlada e camundongos ingênuos. Camundongos submetidos à cirurgia apresentaram latências transitórias aumentadas para notar estímulos adesivos por um a três dias imediatamente após a cirurgia e déficits pós-operatórios transitórios na remoção adesiva da previsão ipsilateral. Camundongos que sofreram impacto cortical controlado, no entanto, apresentaram déficits significativos no desempenho motor no contralateral previsto para a lesão em comparação com ratos ingênuos fora do dia 28 pós-operatório.A imunossuagem de seções cerebrais de camundongos para antígenos nucleares humanos revela que enxertos de células humanas podem ser claramente distinguidos dos tecidos hospedeiros na lesão sham e cérebros de impacto cortical controlados. Você deve observar procedimentos padrão de segurança laboratorial ao manusear células humanas cultivadas e ao manusear agulhas de seringa que entram em contato com roedores ou drogas imunossupressores. As seções de tecido cerebral podem ser analisadas para a expressão de marcadores neuroinflamatórios, pois é valioso saber como o enxerto afeta a resposta da lesão tecidual hospedeira e vice-versa.Ficamos surpresos ao encontrar diferenças sexuais sutis nos resultados do comportamento pós-lesão. Estamos investigando se o sexo desempenha um papel na resposta neuroimune à lesão cerebral. Mãos firmes, paciência e prática são cruciais para desenvolver uma boa técnica de craniectomia.Danos colaterais de uma craniectomia imprópria podem comprometer a área que você quer atingir para transplante celular.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Biologia do Desenvolvimento

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Condrócitos diferenciadores de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivadas de sangue periférico

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...