Name: controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells
Uploaded: 2019-07-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells at JoVE.co

Эта работа была поддержана грантом От Центра неврологии и регенеративной медицины (CNRM, номер гранта G170244014). Мы высоко ценим помощь Махима Деван и Клары Сельбреде в экспериментальных исследованиях удаления клея. Кристина Радомски провела предварительную черепно-мозговую травму и операцию по пересадке клеток. Аманда Фу и Лора Такер (Amanda Fu) из основной лаборатории доклинических исследований CNRM сша предоставили ценные советы по операциям на животных и тестированию поведения, соответственно.

Все эксперименты, описанные в этом протоколе, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию при едином университете.
1. Краниэктомия и контролируемое корково-воздействие
<ol><li>Подготовка контролируемого коркового ударного устройства и хир?...

<ol>
	<li>Maas, A. I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury:+integrated+approaches+to+improve+prevention,+clinical+care,+and+research.">Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research.</a> The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).</li><li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).</li><li>Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury-Related+Emergency+Department+Visits,+Hospitalizations,+and+Deaths+-+United+States,+2007+and+2013.">Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013.</a> Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).</li><li>Fehily, B., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Mild+Traumatic+Brain+Injury:+Potential+Mechanisms+of+Damage.">Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage.</a> Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).</li><li>Kulbe, J. R., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+traumatic+encephalopathy-integration+of+canonical+traumatic+brain+injury+secondary+injury+mechanisms+with+tau+pathology.">Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology.</a> Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).</li><li>Romine, J., Gao, X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cortical+impact+model+for+traumatic+brain+injury.">Controlled cortical impact model for traumatic brain injury.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).</li><li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke,+cortical+ablation,+parkinsonism+and+spinal+cord+injury.">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li><li>Mishra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+resting+functional+connectivity+after+traumatic+brain+injury+in+the+rat.">Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat.</a> PloS ONE. 9, 95280 (2014).</li><li>Sours, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Default+mode+network+interference+in+mild+traumatic+brain+injury+-+a+pilot+resting+state+study.">Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study.</a> Brain Research. 1537, 201-215 (2013).</li><li>Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contusion+injury+disrupts+olfactory+bulb+neurogenesis+in+adult+mice.">Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice.</a> BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).</li><li>Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury+Severity+Affects+Neurogenesis+in+Adult+Mouse+Hippocampus.">Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).</li><li>Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+CNS+repair+following+TBI.">Strategies for CNS repair following TBI.</a> Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548, 592-596 (2017).</li><li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation+of+human+iPSC-derived+glial-rich+neural+progenitors+improves+lifespan+of+ALS+mice.">Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice.</a> Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).</li><li>Tong, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+interneuron+progenitor+transplantation+restores+normal+learning+and+memory+in+ApoE4+knock-in+mice+without+or+with+Abeta+accumulation.">Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Lischka, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+mouse+cortical+but+not+isogenic+human+astrocyte+feeder+layers+enhance+the+functional+maturation+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+in+culture.">Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture.</a> Glia. 66, 725-748 (2018).</li><li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesive+removal+test:+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice.">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).</li><li>Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+sensorimotor+function+in+mouse+models+of+Parkinson's+disease.">Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , (2004).</li><li>Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+novel+color+vision+in+mice+engineered+to+express+a+human+cone+photopigment.">Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment.</a> Science. 315, 1723-1725 (2007).</li><li>Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin1+expression+in+cell+lineages+of+the+cerebellar+cortex+in+embryonic+and+postnatal+mice.">Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).</li><li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment.">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386, 493-495 (1997).</li><li>Piltti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+dose+alters+the+dynamics+of+human+neural+stem+cell+engraftment,+proliferation+and+migration+after+spinal+cord+injury.">Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury.</a> Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity+of+controlled+cortical+impact+traumatic+brain+injury+in+rats+and+mice+dictates+degree+of+behavioral+deficits.">Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits.</a> Brain Research. 1287, 157-163 (2009).</li><li>Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-percussion-induced+traumatic+brain+injury+model+in+rats.">Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats.</a> Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).</li><li>Namjoshi, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+biomechanical+and+biological+threshold+of+murine+mild+traumatic+brain+injury+using+CHIMERA+(Closed+Head+Impact+Model+of+Engineered+Rotational+Acceleration).">Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration).</a> Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).</li><li>Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+dysfunction+and+delayed+neurological+deficits+in+mild+traumatic+brain+injury+induced+by+blast+shock+waves.">Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).</li><li>Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+mild+traumatic+brain+injury:+translation+of+physiological+and+anatomic+injury.">Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury.</a> Neurosurgery. 75, 34-49 (2014).</li><li>Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criteria+to+define+mild,+moderate,+and+severe+traumatic+brain+injury+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model.">Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model.</a> Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).</li><li>Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+Male+and+Female+C57BL/6J+Mice+on+Motor+and+Cognitive+Tasks+Commonly+Used+in+Pre-Clinical+Traumatic+Brain+Injury+Research.">Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research.</a> Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).</li><li>Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+long+is+too+long?+The+lack+of+consensus+regarding+the+post-concussion+syndrome+diagnosis.">How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis.</a> Brain Injury. 29, 798-803 (2015).</li><li>Hurst, J. L., West, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taming+anxiety+in+laboratory+mice.">Taming anxiety in laboratory mice.</a> Nature Methods. 7, 825-826 (2010).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+behavioral+testing+after+focal+ischemia+in+the+mouse:+functional+recovery+and+the+effects+of+gender.">Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender.</a> Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).</li><li>Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+cortical+lesion+effects+and+treatment+with+nimodipine.">Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine.</a> Physiology &amp; Behavior. 47, 1045-1052 (1990).</li><li>Al-Ali, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mTOR+Substrate+S6+Kinase+1+(S6K1)+Is+a+Negative+Regulator+of+Axon+Regeneration+and+a+Potential+Drug+Target+for+Central+Nervous+System+Injury.">The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).</li><li>Pleasant, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+neurodegeneration+in+the+mouse+controlled+cortical+impact+model+is+influenced+by+impactor+tip+shape:+implications+for+mechanistic+and+therapeutic+studies.">Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).</li></ol>

Мягкая CCI как модельная система для тестирования экспериментальной регенеративной терапии Модель CCI является ценным инструментом для исследования механизмов дисфункции тканей после механической травмы коры головного мозга. Настройка параметров травмы является привлекат?...

Травматическая черепно-мозговая травма (TBI) является общим термином для приобретенных травм головного мозга из-за либо косвенные механические силы (вращательное ускорение / замедление или контр-переворот) от ударов по голове или прямого повреждения от объектов или взрывных волн. TBI, по оценкам, является причиной примерно 9% всех случаев смерти во всем мире и наблюдается, по оценкам, 50 миллионов случаев в год1,2. В докладе, подготовленном Центрами по контролю и профилактике заболеваний за 2017 год, подсчитано, что в 2013 году в США было зарегистрировано в общей сложности 2,8 миллиона посещений больниц и смертей от ТБИ в США3. Многие более мягкие ТБи остаются незарегистрированными каждый год. Серьезные TBI может привести к пожизненному ухудшению познания, двигательной функции и общего качества жизни. Последствия мягкой TBI, особенно повторяющиеся связанные со спортом TBI, были только недавно оценили за их коварные последствия для здоровья4,5.
Доклиническое моделирование является жизненно важным компонентом разработки новых механистической идеи и потенциальной восстановительной терапии для TBI. Модель контролируемого воздействия коры (CCI) TBI представляет собой модель с открытой головой механической контузии коры головного мозга. Параметры удара могут быть изменены для получения травм CCI, которые варьируются от легкой до тяжелой6. CcI травмы являются координационными, а не диффузные, как видно с другими закрытыми моделями головы TBI. CCI может быть выполнена, чтобы вызвать одностороннюю травму, так что контралатеральная кора может служить в качестве внутреннего компаратора. Этот протокол демонстрирует характеристики мягкой CCI к части коры, которая охватывает первичные соматосенсорные и моторные области. Эта корковая область была выбрана для его участия в сенсорном поведении, для которых многочисленные тесты поведения могут обнаружить травмы индуцированных дефицитов7. Поведенческие улучшения в связи с терапевтическими вмешательствами для ТБИ могут быть обнаружены, а также.
Отличительной чертой TBI является широко распространенной нервной дисфункции в пострадавшем регионе. Поврежденные нейроны подвергаются клеточной смерти,а подключение нейронной сети нарушается 8,9. TBI нарушает набор эндогенных стволовых клеток, что приводит к дальнейшему вниз по течению дефицит поведения10,11.  Трансплантация нервных стволовых клеток и стволовых клеток, полученных из стволовых клеток, была изучена как возможность восстановления функции в поврежденном мозге. В дополнение к потенциалу для восстановления поврежденных нейронных схем, пересаженные клетки оказывают паракриновые эффекты, которые способствуют выживанию нейронов и функциональному восстановлению от TBI12. Различные типы клеток были пересажены доклинически для оценки их восстановительного потенциала в моделях неврологических расстройств13,14,15. Недавняя популяризация индуцированной технологии стволовых клеток16 способствовала развитию многочисленных линий стволовых клеток человека для экспериментального использования. Доклиническое тестирование с клетками, полученными из hiPSC, является важным первым шагом к характеристике потенциальной терапевтической эффективности данной клеточной линии против болезней человека. Эта лаборатория разработала протоколы для дифференциации hiPSCs к нервным фенотипам17 в погоне за трансплантируемыми клетками, чтобы помочь восстановлению после черепно-мозговой травмы.
Эксперименты в этом протоколе использовать односторонний CCI, чтобы побудить TBI к левой соматосенсорной и моторной коры взрослых мышей. Мягкая травма CCI приводит к устойчивому функциональному дефициту в правой передней лапе, который используется для отслеживания последствий hiPSC полученных нейронных клеток прививок на функциональное восстановление. Испытание датчика Forepaw в этом протоколе было адаптировано из методологии, установленной Bouet и коллегами18 и продемонстрировано ранее Флемингом и коллегами19.  Этот протокол описывает полный рабочий процесс для выполнения экспериментальной черепно-мозговой травмы, терапевтическая трансплантация клеток HIPS, а также поведенческий и гистологический анализ экспериментальных показателей исхода.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:774px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;309659</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">1.7 ml flip top test tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td style="width:123px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">10 microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">7635-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">25G Precision Glide syringe needles</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td style="width:123px;">&#160;305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">acetaminophen oral suspension</td>
			<td>Tylenol (Children&#39;s)</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Dilute to 1 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">anesthetic vaporizer</td>
			<td>Vetland</td>
			<td style="width:123px;">521-11-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">animal handling cloth</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Betadine</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td style="width:123px;">NDC-67618-151-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">compressed oxygen</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Product of choice; varies by region</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">cyclosporine A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">30024-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DAB staining kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D8418-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A14430-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:123px;">715-035-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">electrical tape</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom Electric Co.&#160;</td>
			<td style="width:123px;">K.1070 - K.107018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Ideal Micro Drill Burr Set Of 5</td>
			<td>Cell Point Scientific&#160;</td>
			<td style="width:123px;">60-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Impact One Stereotaxic Impactor for CCI&#160;</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">39463920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td style="width:123px;">NDC-10019-360-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">lab bench timers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette puller</td>
			<td>MicroData Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">PMP-102</td>
			<td>Any puller will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope cover slips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Microscope slide mounting medium</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:212px;">Product of choice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">mirror</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse anti-human nuclear antigen antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB1281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Mouse on Mouse blocking kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:123px;">BMK-2202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">needle holder hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic ointment</td>
			<td>Falcon Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:123px;">NDC-61314-631-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">ophthalmic spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic box</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">plastic cylinder</td>
			<td></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Purchase from department store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">QSI motorized syringe pump</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">53311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Removable needle compression fitting</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td style="width:123px;">55750-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small rodent stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td style="width:123px;">51925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">small scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">StemPro Accutase</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td style="width:123px;">A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile alcohol prep pads</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">06-669-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sterile cotton swabs/Kendall Q-tips</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td style="width:123px;">540500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Sterile saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td style="width:123px;">NDC-0409-1966-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Stopwatches (2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">06-662-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">Superfrost Plus Gold microscope slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td style="width:123px;">15-188-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:238px;">sutures - 5.0 silk with curved needle</td>
			<td>Oasis</td>
			<td style="width:123px;">MV-682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled cortical impact model of mouse brain injury with therapeutic transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural cells

Травматическая черепно-мозговая травма (ТБИ) является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Патология заболевания из-за TBI прогрессирует от первичного механического оскорбления к вторичным процессам травмы, включая апоптоз и воспаление. Моделирование животных было ценным в поисках, чтобы разгадать механизмы травмы и оценить потенциальные нейропротекторные терапии. Этот протокол описывает контролируемую корковую модель воздействия (CCI) фокусного, открытого TBI. В частности, описаны параметры для получения легкой односторонней корковой травмы. Поведенческие последствия ТПП анализируются с помощью теста на удаление клейкой ленты двусторонней сенсорной интеграции. Что касается экспериментальной терапии патологии TBI, этот протокол также иллюстрирует процесс трансплантации культивированных клеток в мозг. Нейронные клетки культур, полученных из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) были выбраны для их потенциал, чтобы показать превосходное функциональное восстановление в человека TBI пациентов. Хроническое выживание hiPSCs в ткани мозга мыши хозяина обнаруживается с помощью модифицированного иммуногистохимического процесса DAB.

Craniectomy хирургии облегчает экспериментальную черепно-мозговую травму и терапевтической трансплантации клеток: контролируемые корковой модели воздействия черепа и последующей трансплантации клеток терапии требуют тщательного удаления надлежащего черепа. Краниэктомия може?...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells at JoVE.co

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Этот протокол демонстрирует методологии для мыши модели открытой черепа черепа черепа черепа черепа черепа травмы головного мозга и трансплантации культивированных человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток в месте травмы. Поведенческие и гистологические тесты результатов этих процедур также описаны вкратце.

Контролируемая кортикальная модель воздействия мышечной травмы мозга с терапевтической трансплантацией индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронных клеток

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Наш протокол демонстрирует всеобъемлющий доклинический рабочий процесс для тестирования терапевтической эффективности человеческих плюрипотентных стволовых клеток после черепно-мозговой травмы. Эта модель черепно-мозговой травмы обеспечивает высокую степень универсальности и воспроизводимости, жестко контролируя параметры механической силы и, следовательно, обеспечивая четко определенные травмы. Эти процедуры могут быть использованы для изучения травм и процессов восстановления в других областях мозга и метод трансплантации является подложным для использования со многими типами клеток.Краниальное бурение является сложной задачей, поскольку техника требует ловкости рук, чтобы освоить соответствующее давление, скорость, глубину и плавные движения. Документировать все события и практики широко. Чтобы выполнить одностороннюю черепно-мозговую операцию, подтвердите отсутствие реакции на щепотку носа в обезболивающей мыши и закрените мышь в стереотаксисе.Нанесите офтальмологическую мазь на глаза стерильным ватным тампоном и раствором на основе йода в область бритой кожи головы. Удалить йод с 70%этанола и покрыть животное с фенестированной хирургической драпировки. Сделать 1,5 до двух сантиметров средней линии разреза на кожу головы и использовать стерильные ватные тампоны для очистки раны и очистить фасции слева от средней линии на брегме.Используйте ударный зонд для идентификации сайта краниэктомии и установите x равно нулю, у равна нулевой стереотаксисной точке отсчета к брегме. Отрегулируйте зонд боково до двух миллиметров слева от средней линии. Используйте тонкий наконечник хирургически безопасный маркер, чтобы ориентир пять миллиметров диаметром круг вокруг предполагаемой области удара.Поднимите и поверните ударник из положения и заполнив пятимиллиметровый круг. Кратко верните ударник в положение, чтобы проверить точность пятимиллиметрового круга. Затем поднимите и поверните ударник из положения и используйте высокоскоростной роторный микродвигатель ручной инструмент, оснащенный круглым наконечником 0,6 или 0,8 миллиметра заусенцев, чтобы сделать открытое отверстие в черепе на 70-80% максимальной скорости.Нанесите световое давление на череп во время бурения вдоль пятимиллиметрового окружного контура в пределах этой границы и используйте типсы для подъема полученного костного лоскута. Бурение через линии шва может представлять дополнительную трудность, так как кость прерывается и требует дополнительного давления. Кровеносные сосуды могут быть в тесной связи и, следовательно, кровотечение события, вероятно.Чтобы вызвать легкую контролируемую травму коркового удара, очистите зонд ударора стерильной подготовительной площадкой для алкоголя и переместите зонд ударора обратно в положение над открытой корой. Опустите зонд до тех пор, пока он не коснется поверхности dura mater и не отметит это положение как z равно нулю. Свяжай поршень и двигайся к z равен минус одному миллиметру и разряжай поршень, чтобы повлиять на кору.Немедленно поднимите поршень и переместить руку из положения и орошать кору с щедрым объемом солевого раствора и использовать простые прерванные стежки и 5-0 шелковый шов, чтобы закрыть разрез кожи головы. Затем доставить 10 миллиграммов на килограмм циклоспорина А путем подкожной инъекции в потертости и поместить мышь в чистую предварительно разогретую послеоперационную клетку с наблюдением до полного выздоровления. Примерно через 24 часа после краниэктомии поместите мышь обратно в стереотаксисную рамку.Обложка мыши с фенестированной хирургической драпировки. Lavage разрез сайт с стерильным солевым раствором, чтобы очистить сайт и ослабить швы. Используйте 70% этанола пропитанной ватным тампоном, чтобы аккуратно стерилизовать место разреза и использовать тонкие пинцет и офтальмологические ножницы, чтобы удалить швы.Затем орошать хирургии и краниэктомии сайт с обильным стерильным солевым раствором. В клеточной культуре биобезопасности капот, осторожно вихрем или нажмите трубку клеток, чтобы обеспечить однородную подвеску клеток. Используйте микропипюту для загрузки примерно 7,5 микролитров клеток в шприц Гамильтона через конец поршеня.Держа шприц под углом 120 градусов с поршенем конца лицом вниз, вставьте поршень заботясь, чтобы не ввести пузырь воздуха между подвеской и поршень отзыв. Прикрепите сборку прокладки к игле пипетки и прикрепите иглу к шприцу. Нажмите поршень, чтобы переместить подвеску клетки в трубчатую иглу и прикрепить шприц к стереотаксисному шприцу насоса.Предварительный поршень, чтобы убедиться, что сборка шприц насоса работает должным образом и переместить иглу в координаты для инъекции. Выровняй кончик иглы до брегмы и установите х и у-координаты до нуля. Перемести иглу опрокинуть краниэктомию на два миллиметра боковой и минус один миллиметр задней к брегме и коснуться кончика иглы к поверхности dura mater.Поднимите иглу немного затем сделать небольшой разрез в dura матер в месте, где игла в контакте. Установите стереотаксис координаты до z равен нулю и нажмите поршень, чтобы подтвердить, что подвеска клетки течет адекватно перед введением иглы в мозг. Введать иглу в мозг на глубину z равно минус 1,4 миллиметра, чтобы поместить трансплантат на серый вещества / белого вещества границы глубокой коры.Запустите шприц-насос, чтобы наполнить cell suspension в течение 15-минутного периода. Используйте микроскоп дальнего следования для мониторинга оттока клеточной суспензии, орошающей хирургическое вмешательство стерильным солевым раствором во время инъекции для поддержания гидратации тканей. Когда все клетки были доставлены, медленно снять трансплантации иглы и орошения хирургии сайт с дополнительным солевым раствором перед закрытием разреза с новыми швами.Затем доставить послеоперационную помощь, как это было продемонстрировано. Для теста на удаление клейкой ленты сначала используйте небольшой бритвенный нож, чтобы разрезать желтые и красные кусочки электрической ленты на полоски три на пять миллиметров на гладкой стеклянной поверхности. Принесите мышей в комнату тестирования поведения, по крайней мере за 30 минут до тестирования и использовать обработку ткани для сдерживания мыши за потертости шеи и спины так, что мышь держит forepaws от его тела и головы.Используйте пинцет, чтобы поместить клей полосу на подошве каждого передний лапа и использовать тонкий и последовательный палец давление для обеспечения полосы лапы. Быстро поместите мышь в пластиковый цилиндр и запустите два секундомера, когда мышь имеет все четыре лапы на пластиковой коробке тестирования. Затем используйте два секундомера для записи latencies для левой лапы уведомления, удаление левой лапы, правую лапу уведомления и удаление правой лапы.В этом экспериментальном эксперименте функцию forelimb сравнивали только с краниэктомией, контролируемой травмой коркового удара и наивными мышами. Мыши, которые прошли операцию выставлены переходные повышенной latencies заметить клей стимулы в течение одного-трех дней сразу после операции и переходных послеоперационных дефицитов в клей удаления из ипсилатеральной типы. Мыши, которые подверглись контролируемому корковому воздействию, однако, продемонстрировали значительный дефицит двигательных характеристик в передняя часть против травмы по сравнению с наивными мышами из послеоперационного дня 28.Иммуностеинирование секций мозга мыши для ядерного антигена человека показывает, что трансплантаты клеток человека можно четко отличить от тканей-хозяина при травме ШАМ и контролируемом корковом воздействии мозга. Вы должны соблюдать стандартные лабораторные процедуры безопасности при обработке культурных клеток человека и при обращении шприц иглы, которые вступают в контакт с грызунами или иммуносупрессивных препаратов. Секции тканей мозга могут быть проанализированы для выражения нейровоспламеня маркеров, как это ценно знать, как трансплантат влияет на реакцию травмы ткани хозяина и наоборот.Мы были удивлены, чтобы найти тонкие половые различия в результатах поведения после травмы. В настоящее время мы расследуем ли секс играет определенную роль в нейроиммуне ответ на черепно-мозговую травму. Устойчивые руки, терпение и практика имеют решающее значение для разработки хорошей техники краниэктомии.Сопутствующий ущерб от неправильной краниэктомии может поставить под угрозу область, которую вы хотите, чтобы цель для трансплантации клеток.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Культивирование Человеческий плюрипотентных и нервные стволовые клетки в замкнутой системе клеточной культуре фундаментальных и доклинических исследований

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Быстрое Нейрональная Дифференциация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для измерения сетевой активности на микро-электродных Массивы

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток сердца для инфарктом Ремонт

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Дифференцирование хондроцитов из периферических кроветворных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение стандартизированных и воспроизводимые переднего мозга тип мозгового Organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

С помощью человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток получены гепатоцито как клетки для обнаружения наркотиков

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Модель человека печени химерных мыши семейной гиперхолестеринемией, с помощью индуцированных плюрипотентных стволовых клеток гепатоцитов

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Microfluidic Assay для оценки лейкоцитарной адгезии к человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных эндотелиальных клеток (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение 3D кожи органоид из пуповинной крови производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...