Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
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我们感谢田中真纪子帮助数据收集和开发协议。样本收集由JSPS KAKENHI赠款编号17K15286支持。

1. 准备 PTFE 信封，用于定量捕获气态 NH3
<ol><li>将一块 60 毫米的聚四氟乙烯 （PTFE） 胶带（25 毫米宽）放在一小块铝箔上（约 300 mm x 450 mm 大小，用乙醇擦拭）。</li>
	<li>在 450°C 下将玻璃纤维过滤器（直径为 10 mm，孔径为 2.7 μm）灰，在消声炉中为 4 小时。将玻璃纤维过滤器放在胶带长轴的中点上方一点（图 1a）。</li>
	<li>在 GF/D 过滤器的中心点 20 μL 的 0.9 摩尔/L H<...

DNRA分析NH4+的浓度和同位素比用几种方法进行量化。NH4+的浓度和同位素比通常单独测量。NH4+浓度通常使用色度测量方法测量，包括自动分析仪4、,10、15、16、17。同位素比测量具有很大的变化，取决于其NH4+转换</su...

氮肥的人工合成及其广泛应用极大地干扰了全球氮循环。据估计，自工业化前1次以来，活性氮从陆地系统向沿海系统的转移增加了一倍。应用于给定田地的肥料的很大一部分被从土壤中冲走到河流或地下水中，主要为 NO3+ 2。这可能会导致环境问题，如饮用水污染，富营养化，和缺氧的形成。NO3=在水环境中，通过生物同化和各种微生物异化过程，从生态系统中去除或保留。脱硝和麻醉剂是NO3+的主要微生物去除过程。硝化是微生物还原NO3=气态N产物（NO、N2O和2N2）加上电子供体（如有机物质）的氧化，从而降低了上述问题的风险。Anammox 还从 NO 2 + 和NH4+ 生成 N2 ;−因此，它将无机N从生态系统中删除。相反，DNRA 致力于在生态系统中保留 N;人们普遍认为，DNRA主要由发酵细菌或化学营养细菌进行，它们可减少异化NO 3-生物利用和移动性较少的NH4++。
关于DNRA的研究主要在海洋或河口生态系统中进行，如海洋或河口沉积物和水、盐或咸沼泽土壤以及红树林土壤。,沿海或海洋生态系统作为从陆地生态系统中去除NO,− 3+−的蓄水池非常重要，在以前的研究中，DNRA已证明在NO 3 + 清除 （0-99%）,3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18,46,7,8,9,10,11,12,15,16,17的范围内13,14做出了贡献18。35此外，DNRA的存在已证明在广泛的环境，包括淡水环境19，稻田土壤20，森林土壤21。虽然这些研究表明，DNRA与NO 3+去除的脱硝具有潜在可比性，但与测量脱硝量相比，测量DNRA活性的研究仍然非常有限。
DNRA 速率通过分析或数值模型与数据分析相结合，使用15种 N 标标技术进行评估。一个用于计算 DNRA 速率的分析解决方案是基于在添加 15NO3=作为示踪剂后 NH4+池的 15N 浓缩量的增加。15N标记的NO3=被添加到样品中孵育，然后可以从NH 4+的浓度和同位素比变化中计算出在一定时期之前和之后。本文详细介绍了计算DNRA速率所需的NH4++浓度和同位素比的量化方法。基本上，这里报告的方法是结合了几个以前报告的技术22，23，24，25，26，修改添加到一些程序。22,23,24,25,26该方法由一系列五个组分程序组成：（1） 利用稳定同位素示踪剂的修正孵育环境−样品，15NO3+，（2） 使用"扩散程序"提取和恢复 NH4+，并修改，（3） 在样品中对 NH4+进行吸气氧化， 由土著 NH4+和 15NH4+从 15No3=通过 DNRA 活性派生为 No 3+和15No3+， （4） 随后的3 号微生物转化和 15NO3= 到N2O 异体通过修改的除色器方法， 和 （5） 使用气相色谱法 （GC/MS） 定量 N2O 异体体。3在以下一节中，首先对程序 （2） 和 （4） 的准备进行了描述，然后详细描述了所有五个组成部分过程。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

由于全球氮负荷在工业化后急剧增加，了解硝酸盐（NO3+）的命运的重要性不断增加，硝酸盐是从陆地向水生生态系统转移的主要N种。异硝酸盐减少至铵（DNRA）和脱硝是使用NO 3的微生物过程，用于呼吸。与否认相比，对DNRA活动的定量测定只进行了有限的程度。这导致对 DNRA 在 NO3中的重要性认识不足 –转换和此过程的调节因素。本文的目的是提供一个详细的程序，用于测量环境样品中潜在的DNRA速率。简言之，潜在的DNRA率可以从15N标铵（15NH154+）+的积累率（15NO3=添加孵化）中计算。本文所述的14NH4+和15NH4°浓度的确定由以下步骤组成。首先，提取样品中的NH4+，+并捕获在酸化玻璃过滤器作为铵盐。其次，通过硫酸盐氧化，将被困的铵洗洗并氧化为NO 3。第三，NO3=通过 N2O 还原酶缺乏除尼器转换为 N2O。最后，使用先前开发的四极气相色谱法-质谱系统对转换后的N2O进行了分析。我们将这种方法应用于盐沼沉积物，并计算了其潜在的DNRA速率，表明与前面描述的方法相比，建议的程序允许简单、更快速地确定。

本文提出的代表性结果来自 盐沼沉积物的15个N-跟踪实验。采样盐沼是在2011年日本东部大地震后在日本宫城县Kesen-numa市的Moune地区新建的。2017年9月，在部下和部间区的两个地点收集了地表沉积物（0~3厘米）。首先，在收集后，沉积物立即通过4毫米网状，清除植物根、贝壳碎片和碎石，然后均质化。样品储存在4°C，直到DNRA分析进行。
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Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

详细介绍了基于 14 NH 4+ / 15NH444+分析确定潜在 DNRA 速率的一系列方法。NH4+通过几个步骤转换为 N2O，并使用四极气相色谱法（质谱法）进行分析。

基于14NH 4 + /4+ 15NH 4= 通过顺序转换为 N2O 的分析，测量异化硝酸盐降低至铵的潜在率

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

沿海和海洋生态系统作为水库，对于从陆地生态系统中去除硝酸盐十分重要。水生环境中的硝酸盐可以同时由多个过程消耗。如脱硝、麻醉剂和DNRA。虽然先前的研究表明，DNRA具有潜在的否认性责任，但与测量否认性相比，衡量DNRA活性的研究仍然非常有限。在我们的协议中，我们提供了测量环境样品中潜在DNRA速率的详细程序。我们相信，潜在的DNRA速率可以从N15标签铵积累与N15标记硝酸盐添加计算。与其他方法相比，我们的方法的优点是，铵最终转化为一氧化二氮，具有低大气背景。此外，我们通过四极气相色谱质谱仪测量一氧化二氮也是不明智的。与同位素比质谱仪价格更低、易于管理。首先，在一小块铝箔上放置一块60毫米的PTFE胶带。在450摄氏度的玻璃纤维过滤器中，在消声炉中灰4小时。然后将玻璃纤维过滤器放在胶带长轴的中点上方一点。接下来，在玻璃纤维过滤器中心发现每升0.9摩尔的20微升硫酸，并立即使用平端邮票和直端钳子折叠PTFE胶带。将 PTFE 胶带翻转到玻璃纤维过滤器上，然后通过折叠密封 PTFE 胶带的两侧，然后用钳子紧按边缘。使用钳子，折叠 PTFE 胶带的开端，然后按压边缘。用钳子紧按边缘，密封 PTFE 胶带的开端，注意不要按玻璃纤维过滤器。将 30 毫克氧化镁转移到 20 毫升玻璃瓶中，然后将 PTFE 信封放在小瓶中。将先前制备的样品或标准样品的五毫升转移到含有氧化镁和 PTFE 包络的小瓶中。并立即关闭小瓶与灰色丁基橡胶塞。然后，用铝盖密封小瓶。在 4 摄氏度的黑暗条件下，以 150 RPM 的速度摇动小瓶 3 小时。之后，从每个小瓶中取下铝盖和丁基橡胶塞。使用点端钳从每个小瓶中取出 PTFE 信封，然后用离子交换水彻底冲洗信封和钳子。然后，用擦拭纸擦拭信封和钳子，将信封放在新鲜的擦拭纸上。打开带平端和尖端钳子的 PTFE 信封，按照折叠步骤的相反顺序打开。使用平端钳子，握住玻璃纤维过滤器的外围区域，其中硫酸应不吸收。并将其转移到一个11毫米的螺丝帽试管。用离子交换水冲洗钳子，然后用擦拭纸擦拭。在每个试管中加入一毫升离子交换水。用 PTFE 内衬螺钉盖关闭试管，并允许它们在室温下至少站立 30 分钟，以完全躲避玻璃纤维过滤器中的铵离子。之后，打开螺钉盖，将两毫升以前准备好的螺旋酸盐氧化溶液试剂添加到试管中，然后用螺钉盖紧闭管，以防止在以下步骤中出现任何损失或污染。将试管放在机架上，用双层铝箔包裹，并在 121 摄氏度下直立放置试管一小时。混合100毫升的无菌40毫升每升磷酸盐缓冲液，和100毫升无菌30毫升每升葡萄糖无菌。在 300 毫升 Erlenmeyer 烧瓶中，在 200 毫升磷酸盐缓冲葡萄糖溶液中加入一种 P.12 氟草的甘油库存。用超纯氦流清洗一小时。接下来，将先前准备的除尼器悬浮液的两毫升分配到五毫升小瓶中。用灰色丁基橡胶塞和铝封口盖住每个小瓶。用超纯氦气代替 Headspace 空气，吸尘三分钟，为氦充电一分钟。将头空间气体正压设置为 1.3 个大气，以避免意外空气污染。使用一毫升一次性注射器，通过丁基橡胶塞注入一毫升样品或标准样品。然后，在25摄氏度的高温条件下孵育小瓶过夜。第二天，每升氢氧化钠注射0.3毫升6摩尔，以阻止利化并吸收头空间二氧化碳，否则会干扰一氧化二氮的分析。因为二氧化碳和一氧化二氮的分子量相同。使用具有改性注射口的四极极性GC/MS，确定头空间气体中分子量为44、45和46的一氧化二氮数量。这一代表性结果来自2011年日本东部大地震产生的15个盐沼沉积物的氮追踪实验，这些实验位于日本庆县和宫城县的月球地区。在整个潜伏期，在下部和区间收集的所有沉积物中，标记的铵浓度都增加。DNRA 速率在 24.8 到 177 之间。与之前研究中报告的值相当，但高于从类似环境派生的值。高DNRA率，可以解释为盐沼被用作在地震前的种植场。与推测一致，与次交区相比，地间区丰富的有机化合物DNRA率较高。我们的协议广泛适用于代谢途径的分析，其中涉及铵的形成和N15微量增加。

Research

JoVE Journal

Environment

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环境科学

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