Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Vi takker Naoto Tanaka for at hjælpe med dataindsamling og udvikling af protokollen. Indsamlingen af prøver blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

1. Udarbejdelse af en PTFE-kuvert til kvantitativ opfangning af gasformig NH3
<ol><li>Et 25 mm stykke polytetrafluorethylen (PTFE) på en lille plade aluminiumsfolie (ca. 300 mm x 450 mm, aftørret med ethanol).</li>
	<li>Aske et glasfiberfilter (10 mm i diameter med en porestørrelse på 2,7 μm) ved 450 °C i 4 timer i en lyddæmpeovn. Anskaf glasfiberfilteret lidt over midten af båndets længere akse (Figur 1a).</li>
	<li>Spot 20 μL af 0,9-mol/L H2SO4 ...

Koncentrations- og isotopforholdet for NH4+ for DNRA-analysen blev kvantificeret ved hjælp af flere metoder. Koncentrationerne og isotopforholdet for NH4+ måles generelt separat. NH4+ koncentrationen måles typisk ved hjælp af koloimetriske metoder , herunder en autoanalyser4,10,15,16,17. Iso...

Den kunstige syntese af kvælstofgødning og dens udbredte anvendelse har i høj grad forstyrret den globale kvælstofcyklus. Det anslås , at overførslen af reaktivt kvælstof fra jordbaserede til kystbaserede systemer er fordoblet siden førindustrielletider 1. En betydelig del af gødningen, der anvendes på et givet felt, vaskes væk fra jorden til floder eller grundvand, primært som NR3− 2. Dette kan forårsage miljøproblemer såsom drikkevandsforurening, eutrofiering og dannelse af hypoxi. NO3− fjernes i vandmiljøer fra eller bevares i økosystemet via biologisk assimilation og forskellige mikrobielle dissimilatoriske processer. Denitrificering og anammox er kendt for at være større mikrobielle fjernelsesprocesser for NO3−. Denitrificering er den mikrobielle reduktion af NO3− til gasformige N-produkter (NO, N2O og N2) kombineret med oxidering af en elektrondonor, såsom organiske stoffer, hvilket reducerer risikoen for ovennævnte problemer. Anammox producerer også N2 fra NO2− og NH4+; derfor fjerner den uorganiske N fra et økosystem. Omvendt arbejder DNRA på at bevare N i et økosystem. det er almindeligt accepteret, at DNRA primært udføres af fermentative bakterier eller chemolithoautotrofiske bakterier, og at de reducerer dissimilatory NO3− til biotilgængelige og mindre mobile NH4+.
Undersøgelser af DNRA er primært blevet udført i marine eller flodmundinger økosystemer, såsom oceaniske eller flodmundinger sedimenter og vand, salt eller brakvand marsh jord, og mangrove jord. Kyst- eller havøkosystemer er vigtige som reservoirer til fjernelse af NO3− fra terrestriske økosystemer, og i tidligere undersøgelser har DNRA vist sig at bidrage over et meget bredt udvalg af NO3− fjernelse (0-99%)3,4,5,6,77,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.9 Endvidere er eksistensen af DNRA blevet påvist i en lang række miljøer, herunder ferskvandsmiljøer19, rismarkeljord20og skovjord21. Mens disse undersøgelser har vist, at DNRA potentielt kan sammenlignes med denitrificering for NO3− fjernelse, er undersøgelser, der måler DNRA-aktiviteten, stadig meget begrænsede sammenlignet med dem, der måler denitrificering.
DNRA-hastigheden er blevet evalueret ved hjælp af 15N-mærkningsteknikker i forbindelse med dataanalyse via analytiske eller numeriske modeller. En analyseløsning til beregning af DNRA-hastigheden er baseret på stigningen i 15 N-berigelsenaf NH4+ puljen efter tilsætning af 15NO3− som sporstof. kr. N-mærket NO3− tilsættes til en prøve og inkuberes, og DNRA-hastigheden kan derefter beregnes ud fra koncentrations- og isotopforholdsændringerne i NH4+ før og efter en vis periode. I dette dokument beskrives en metode til kvantificering af NH4+koncentrationen og isotopforholdet, som er nødvendigt for at beregne DNRA-hastigheden, i detaljer. Dybest set, den metode, der rapporteres her er en kombination af flere tidligere rapporterede teknikker22,,23,24,25,26 med ændringer føjet til nogle procedurer. Metoden består af en serie på fem komponentprocedurer: 1) inkubation af en miljøprøve med ændring af et stabilt isotopsporingsmiddel, 15NO3−, 2) ekstraktion og nyttiggørelse af NH4+ ved hjælp af en "diffusionsprocedure" med ændringer, 3) persulfatoxidation af NH4+ i prøven bestående af indenlandske NH4+ og 15NH4+ afledt af 15NO3− via DNRA aktivitet, i NO3− og 15NO3−, (4) efterfølgende mikrobiel transformation af NO3− og 15NO3− til N2O-isotopomere via den modificerede denitrifiermetode og (5) kvantificering af N2O-isotopomerne ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometri (GC/MS). I det følgende afsnit beskrives først forberedelsen af procedurerne (2) og 4), og derefter beskrives alle fem komponentprocedurer i detaljer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

Betydningen af at forstå nitrattens skæbne (NR3−), som er den dominerende N-art, der overføres fra terrestriske til akvatiske økosystemer, har været stigende, fordi den globale kvælstofbelastning er steget dramatisk efter industrialiseringen. Dissimilatoriske nitratreduktion til ammonium (DNRA) og denitrificering er begge mikrobielle processer, der bruger NO3− til respiration. Sammenlignet med denitrificering er der kun i begrænset omfang foretaget kvantitative bestemmelser for DNRA's aktiviteter. Dette har ført til en utilstrækkelig forståelse af DNRA's betydning i NR3− transformationer og reguleringsfaktorerne i denne proces. Formålet med dette dokument er at tilvejebringe en detaljeret procedure for måling af den potentielle DNRA-rate i miljøprøver. Kort sagt kan den potentielle DNRA-rate beregnes ud fra den 15N-mærkede ammonium (15NH4+) akkumuleringsrate i 15NO3− tilsat inkubation. Bestemmelsen af de 14NH4+ og 15NH 4+ koncentrationer,der er beskrevet i dette papir, består af følgende trin. For det første udvindesNH 4+ i prøven og fanges på et forsuret glasfilter som ammoniumsalt. For det andet eluteres det fangne ammonium og oxideres til NO3− via persulfatoxidation. For det tredje konverteres NO3− til N2O via en N2O-reduktasedetændig denitrifier. Endelig analyseres den konverterede N2O ved hjælp af et tidligere udviklet firedobbelt gaskromatografi-massespektrometrisystem. Vi anvendte denne metode til salt marsh sedimenter og beregnet deres potentielle DNRA satser, viser, at de foreslåede procedurer giver mulighed for en enkel og hurtigere bestemmelse i forhold til tidligere beskrevne metoder.

De repræsentative resultater, der præsenteres i dette dokument, stammer fra 15N-opsporingsforsøg med saltmarskedimenter. Den samplede saltmose blev nyoprettet i kølvandet på jordskælvet i Great East Japan i 2011 i Moune-området i Kesen-numa by i Miyagi-præfekturet, Japan. I september 2017 blev overfladesedimenter (0-3 cm) indsamlet to steder i de subtidale og tidevandszoner. Først, umiddelbart efter indsamling, sedimentet blev sigtet gennem en 4-mm mesh til at fjerne p...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

En række metoder til at bestemme den potentielle DNRA sats baseret på 14NH4+/15NH4+ analyser leveres i detaljer. NH4+ omdannes til N2O via flere trin og analyseres ved hjælp af quadrupole gaskromatografi-massespektrometri.

Måling af de potentielle satser for dissimilatorisk nitratreduktion til Ammonium baseret på 14NH4+/15NH4+ Analyser via Sekventiel konvertering til N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Kyst- og havøkosystemer er vigtige som reservoirer for at fjerne nitrat fra terrestriske økosystemer. Nitrat i vandmiljøet kan forbruges ved flere processer samtidigt. Såsom denitrificering, anammox og DNRA.Mens tidligere undersøgelser har vist, at DNRA er potentielt skyldige i denitrificering, undersøgelser måling DNRA aktivitet som stadig meget begrænset i forhold til dem, måling denitrificering. I vores protokol giver vi en detaljeret procedure til måling af den potentielle DNRA-rate i miljøprøver. Vi mener, at potentielle DNRA sats kan beregnes fra N15 mærket Ammonium akkumulering med N15 mærket Nitrat tilsætning.Fordelen ved vores metode i forhold til andre metoder, er, at Ammonium i sidste ende omdannes til lattergas, som har en lav atmosfærisk baggrund. Det er heller ikke klogt, at vi målte lattergas via quadrupole gaskromatografi massespektrometer. Hvilket er billigere og let at håndtere end et isotop-forhold massespektrometer.Først skal du placere et 60 millimeter stykke PTFE tape på et lille ark aluminiumsfolie. Aske et glasfiberfilter ved 450 grader Celsius i fire timer i en dæmpeovn. Placer derefter glasfiberfilteret lidt over midten af båndets længere akse.Dernæst stedet 20 mikroliter af 0,9 modermærker per liter svovlsyre på midten af glasfiberfilteret, og fold straks PTFE-båndet ved hjælp af fladt ended stempel og lige endte pincet. Vend PTFE-båndet over glasfiberfilteret, og luk derefter begge sider af PTFE-båndet ved at folde og derefter trykke tæt på kanten med pincet. Brug pincetten til at folde den åbne ende af PTFE-båndet og trykke på kanten.Luk den åbne ende af PTFE-båndet ved at trykke tæt på kanten med pincetten, idet du skal passe på ikke at trykke på glasfiberfilteret. Overfør 30 milligram ashed Magnesiumoxid, til en 20 milliliter glas hætteglas, og læg PTFE kuvert i hætteglasset. Der overføres fem milliliter en tidligere tilberedt prøve eller standard til hætteglasset med magnesiumoxid og PTFE-konvolutten.Og luk straks hætteglasset med en grå butylgummiprop. Derefter forsegle hætteglasset med en aluminiumshætte. Ryst hætteglassene ved 150 omdr./min. i tre timer ved fire grader Celsius under mørke forhold.Derefter fjernes aluminiumshætten og butylgumproppen fra hvert hætteglas. Fjern PTFE-konvolutten fra hvert hætteglas ved hjælp af punktpolderede pincet, og skyl konvolutten og pincetten grundigt med ionbyttet vand. Tør derefter konvolutten og pincetten med tørrepapir, og læg konvolutten på frisk aftørringspapir.Åbn PTFE kuvert med flade ended og spidse en pincet i omvendt rækkefølge af foldetrin. Ved hjælp af flade endte pincet, holde det perifere område af glasfiber filter, hvor svovlsyre formodes at være uabsorberet. Og overføre det til en 11 millimeter skruelåg reagensglas.Skyl pincet med ion udvekslet vand og tør dem af med aftørring papir. Der tilsættes en milliliter ion, der udveksles vand, til hvert reagensglas. Luk reagensglassene med PTFE-forede skruehætter, og lad dem stå i mindst 30 minutter ved stuetemperatur for helt at unddrage sig ammonium kationen fra glasfiberfilteret.Derefter åbnes skruehætten, der tilsættes to milliliter et tidligere forberedt persulfatgenilerende opløsningsreage til reagensglasset, og røret lukkes tæt med en skruehætte for at undgå tab eller kontaminering under følgende trin. Stå reagensglas på en rack, pak dem i dobbelt lag aluminiumsfolie, og autoklave dem i opretstående position i en time ved 121 grader Celsius. Bland 100 milliliter sterile 40 millimoler per liter fosfat buffer, og 100 milliliter sterile 30 millimoles per liter glukose aseptisk.Der tilsættes en glycerolbestand p.chlororaphis til 200 milliliter af fosfatbuffetglukoseopløsningen i en 300 milliliter Erlenmeyerkolbe. Og fjern med en ultra ren heliumstrøm i en time. Dernæst dispenseres to milliliter af en tidligere forberedt denitrifier suspension i fem milliliter hætteglas.Cap hvert hætteglas med en grå butyl gummi prop, og en aluminium lukning. Udskift Headspace-luften med ultra ren helium ved at støvsuge i tre minutter og oplade heliummet i et minut. Indstil Headspace gas positivt tryk til 1,3 atmosfærer, for at undgå utilsigtet luftforurening.Der indsprøjtes en milliliter en prøve eller standard gennem butylgummiproppen ved hjælp af en engangssprøjte på en milliliter. Derefter inkubere hætteglassene natten over ved 25 grader Celsius, under mørke forhold. Den følgende dag injiceres 0,3 milliliter af seks modermærker pr. liter natriumhydroxid for at stoppe denitrificeringen og absorbere Headspace-kuldioxiden, hvilket ellers vil forstyrre lattergasanalysen.Fordi kuldioxid og lattergas har samme molekylvægt. Mængden af lattergas med en molekylvægt på 44, 45 og 46 bestemmes i Headspace-gassen ved hjælp af quadrupole GC/MS med en modificeret injektionsport. De repræsentative resultater stammer fra 15 kvælstof opsporing eksperimenter af salt marsh sedimenter skabt fra 2011 Great East Japan Jordskælv i månen område Kesennuma by og Miyagi præfekturet, Japan.Der blev observeret en stigning i ammoniumkoncentrationen i hele inkubationstiden for alle sedimenter, der blev opsamlet i de subtidale og intertidale zoner. DNRA-satserne var inden for intervallet 24,8 til 177. Og kan sammenlignes med værdier rapporteret i tidligere undersøgelser, men højere end værdier afledt af lignende miljøer.Den høje DNRA sats, kan forklares ved salt marsk bliver brugt som et dyrkningsområde før jordskælvet. I overensstemmelse med spekulation, DNRA sats i tidevandszonen, som er rige og organiske forbindelser i forhold til den subtidale zone, var højere. Vores protokol er bredt anvendelig til analyse af metaboliske veje, som indebærer ammonium dannelse og N15 spor tilføjelser.

Research

JoVE Journal

Environment

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimer Røggas indstillinger for at fremme mikroalger Vækst i fotobioreaktorer via computersimuleringer

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

High-throughput Fluorometric Måling af Potentiel Jord Ekstracellulære enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Metoder til Lettere Mikrobiel vækst på cellulosefabrikken affaldsstrømme og karakterisering af Bionedbrydningspotentialet af Kulturperler Mikrober

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Måling Carbon-baserede Kontaminant Mineralisering Brug Kombineret CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux og Kulstofdateringer Analyser

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Måling Satser for Ukrudtsmiddel Metabolisme i tokimbladede Ukrudt med en udskåret Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

Vurdering af Labil organisk kulstof i jorden ved hjælp af Sekventiel Gasning Inkuberingsbetingelser Procedurer

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Evaluering af effekten af ​​Environmental Chemicals på Honey Bee Udvikling fra den enkelte til Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Selvstændigt elektrokemiske Set-up til at berige Anode-respiring bakterier på stedet

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Estimering af Sediment denitrifikation priser ved hjælp af kerner og N2O mikrosensorer

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammensætning og Distribution analyse af Bioaerosols Under forskellige miljøforhold

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...