Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

We danken Naoto Tanaka voor het helpen verzamelen van gegevens en het ontwikkelen van het protocol. De verzameling monsters werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

1. Bereiding van een PTFE-enveloppe voor het kwantitatief vastleggen van gasvormige NH3
<ol><li>Plaats een stuk polytetrafluorethyleen (PTFE) van 60 mm (25 mm breed) op een klein vel aluminiumfolie (ongeveer 300 mm x 450 mm groot, afgeveegd met ethanol).</li>
	<li>As een glasvezelfilter (10 mm in diameter met een poriegrootte van 2,7 μm) bij 450 °C gedurende 4 uur in een dempoven. Plaats het glasvezelfilter iets boven het middelpunt van de langere as van de tape(figuur 1a).</l...

De concentratie- en isotopenverhouding van NH4+ voor de DNRA-analyse werd met behulp van verschillende methoden gekwantificeerd. De concentraties en isotopenverhoudingen van NH4+ worden over het algemeen afzonderlijk gemeten. De NH4+ concentratie wordt meestal gemeten met behulp van colorimetrische methoden, waaronder een autoanalyzer4,10,15,<sup class=...

De kunstmatige synthese van stikstofmest en de wijdverbreide toepassing ervan hebben de wereldwijde stikstofcyclus sterk verstoord. Geschat wordt dat de overdracht van reactieve stikstof van terrestrische naar kustsystemen is verdubbeld sinds pre-industriële tijden1. Een aanzienlijk deel van de meststoffen die op een bepaald veld worden aangebracht, wordt weggespoeld van de bodem naar rivieren of grondwater, voornamelijk als NR3− 2. Dit kan leiden tot milieuproblemen zoals drinkwatervervuiling, eutrofiëring en de vorming van hypoxie. NO3− in wateromgevingen wordt verwijderd uit of vastgehouden in het ecosysteem via biologische assimilatie en verschillende microbiële dissimilerende processen. Denitrificatie en anammox staan bekend als belangrijke microbiële verwijderingsprocessen voor NO3−. Denitrificatie is de microbiële reductie van NO3− tot gasvormige N-producten (NO, N2O en N2) in combinatie met de oxidatie van een elektronendonor, zoals organische stoffen, waardoor het risico op bovengenoemde problemen wordt verminderd. Anammox produceert ook N2 van NO2− en NH4+; daarom verwijdert het anorganische N uit een ecosysteem. Omgekeerd werkt DNRA aan het behoud van N in een ecosysteem; algemeen wordt aangenomen dat DNRA voornamelijk wordt uitgevoerd door fermenterende bacteriën of chemolithoautotrofe bacteriën en dat ze dessimilerende NO3− tot biologisch beschikbare en minder mobiele NH4+verminderen.
Studies over DNRA zijn voornamelijk uitgevoerd in mariene of estuariene ecosystemen, zoals oceanische of estuariene sedimenten en water, zout of brak moerasgrond, en mangrovegrond. Kust- of mariene ecosystemen zijn belangrijk als reservoirs voor het verwijderen van NO3− uit terrestrische ecosystemen, en in eerdere studies is aangetoond dat DNRA een bijdrage levert over een zeer breed scala van3− verwijdering (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Verder is het bestaan van DNRA aangetoond in een breed scala van omgevingen, waaronder zoetwateromgevingen19, rijstpadiebodems20en bosbodems21. Hoewel deze studies hebben aangetoond dat DNRA potentieel vergelijkbaar is met denitrificatie voor NO3− verwijdering, zijn studies die de DNRA-activiteit meten nog steeds zeer beperkt in vergelijking met studies die denitrificatie meten.
De DNRA-snelheid is geëvalueerd aan de hand van 15N-labelingtechnieken in combinatie met data-analyse via analytische of numerieke modellen. Een analytische oplossing voor het berekenen van het DNRA-tarief is gebaseerd op de toename van de 15N verrijking van de NH4+ pool na de toevoeging van 15NO3− als tracer. 15. N-label NO3− wordt toegevoegd aan een monster en geïncubeerd, en de DNRA-snelheid kan vervolgens worden berekend op basis van de veranderingen in de concentratie en isotopenverhouding in NH4+ voor en na een bepaalde periode. In dit document wordt een methode beschreven om de NH4+ concentratie en de isotopenverhouding te kwantificeren, die nodig zijn om de DNRA-snelheid te berekenen, in detail beschreven. Kortom, de hier gerapporteerde methode is een combinatie van verschillende eerder gerapporteerde technieken22,23,24,25,26 met wijzigingen toegevoegd aan een aantal procedures. De methode bestaat uit een reeks van vijf componentprocedures: (1) incubatie van een milieumonster met de wijziging van een stabiele isotopentracer, 15NR3−(2) extractie en nuttige toepassing van NH4+ met behulp van een "diffusieprocedure" met wijzigingen, (3) persulfaatoxidatie van NH4+ in het monster; bestaande uit inheemse NH4+ en 15NH4+ afgeleid van 15NR3− via DNRA-activiteit, in NO3− en 15NO3−(4) latere microbiële transformatie van NO 3− en 3 − en15 15GEEN3− tot N2O-isotopen via de gemodificeerde denitrifiermethode en (5) kwantificering van de N2O-isotopen met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC/MS). In het volgende deel wordt eerst de voorbereiding van de procedures (2) en (4) beschreven en vervolgens worden alle vijf de componentprocedures in detail beschreven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

Het belang van het begrijpen van het lot van nitraat (NR3−), de dominante N-soort die van terrestrische naar aquatische ecosystemen wordt overgebracht, is toegenomen omdat de wereldwijde stikstofbelastingen na de industrialisatie drastisch zijn toegenomen. Dissimilatorische nitraatreductie tot ammonium (DNRA) en denitrificatie zijn beide microbiële processen die NO3− gebruiken voor ademhaling. In vergelijking met denitrificatie zijn de kwantitatieve bepalingen van de DNRA-activiteit slechts in beperkte mate uitgevoerd. Dit heeft geleid tot onvoldoende inzicht in het belang van DNRA in NO3− transformaties en de regulerende factoren van dit proces. Het doel van dit document is een gedetailleerde procedure te bieden voor de meting van het potentiële DNRA-tarief in milieumonsters. Kortom, het potentiële DNRA-tarief kan worden berekend op basis van de 15N-gelabelde ammonium (15NH4+) accumulatiesnelheid in 15NR3− toegevoegde incubatie. De bepaling van de 14NH4+ en 15NH4+ concentraties beschreven in dit document bestaat uit de volgende stappen. Ten eerste wordt de NH4+ in het monster geëxtraheerd en gevangen op een verzuurd glasfilter als ammoniumzout. Ten tweede wordt het gevangen ammonium via persulfaatoxidatie geëuterd en geoxideerd tot NO3− Ten derde wordt de NO3− omgezet in N2O via een N2O reductase denitreifier. Ten slotte wordt de omgebouwde N2O geanalyseerd met behulp van een eerder ontwikkeld quadrupole gaschromatografie-massaspectrometriesysteem. We pasten deze methode toe op kweldersedimenten en berekenden hun potentiële DNRA-percentages, waaruit bleek dat de voorgestelde procedures een eenvoudige en snellere bepaling mogelijk maken in vergelijking met eerder beschreven methoden.

De representatieve resultaten in dit document zijn afgeleid van 15N-tracing experimenten van kweldersedimenten. De bemonsterde kwelder werd nieuw gemaakt in de nasleep van de 2011 Great East Japan Aardbeving in het Moune gebied van Kesen-numa stad in miyagi prefectuur, Japan. In september 2017 werden oppervlaktesedimenten (0-3 cm) verzameld op twee locaties in de subgetijden- en intergetijdenzones. Eerst, onmiddellijk na het verzamelen, werd het sediment gezeefd door een 4 mm g...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Een reeks methoden om de potentiële DNRA-snelheid te bepalen op basis van 14NH4+/15NH4+ analyses wordt in detail verstrekt. NH4+ wordt omgezet in N2O via verschillende stappen en geanalyseerd met behulp van quadrupole gaschromatografie-massaspectrometrie.

Meting van de potentiële tarieven van dissimilatorische nitraatreductie naar Ammonium op basis van 14NH4+/15NH4+ Analyses via sequentiële conversie naar N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Kust- en mariene ecosystemen zijn belangrijk als reservoirs, voor het verwijderen van nitraat uit terrestrische ecosystemen. Nitraat in het aquatisch milieu kan door meerdere processen tegelijk worden geconsumeerd. Zoals denitrification, anammox en DNRA.Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat DNRA mogelijk schuldig is aan denitrificatie, studies meten DNRA activiteit als nog steeds zeer beperkt in vergelijking met die meten denitrificatie. In ons protocol bieden we een gedetailleerde procedure voor het meten van de potentiële DNRA-snelheid in milieumonsters. Wij zijn van mening dat potentiële DNRA-snelheid kan worden berekend op basis van N15-gelabelde Ammoniumaccumulatie met N15-labelNitraattoevoeling.Het voordeel van onze methode ten opzichte van andere methoden is dat Ammonium uiteindelijk wordt omgezet in lachgas, dat een lage atmosferische achtergrond heeft. Ook is het niet verstandig dat we lachgas gemeten via quadrupole gaschromatografie massaspectrometer. Dat is minder duur en gemakkelijk te beheren dan een isotopenverhouding massaspectrometer.Plaats eerst een stuk PTFE-tape van 60 millimeter op een klein vel aluminiumfolie. As een glasvezelfilter op 450 graden Celsius gedurende vier uur in een dempoven. Plaats vervolgens de glasvezelfilter iets boven het middelpunt van de langere as van de tape.Spot vervolgens 20 microliters van 0,9 mol per liter zwavelzuur in het midden van het glasvezelfilter en vouw onmiddellijk de PTFE-tape met platte stempel en een rechte pincet. Draai de PTFE tape over het glasvezelfilter, sluit vervolgens beide zijden van de PTFE-tape af door te vouwen en druk vervolgens stevig op de rand met de pincet. Vouw met de pincet het open uiteinde van de PTFE-tape en druk op de rand.Verzegel het open uiteinde van de PTFE-tape door de rand met de pincet stevig te drukken, waarbij u ervoor zorgt dat u het glasvezelfilter niet drukt. Breng 30 milligram ashed Magnesiumoxide, naar een 20 milliliter glazen flacon, en plaats de PTFE envelop in de flacon. Breng vijf milliliter van een eerder bereid monster of standaard over in het flesje met de magnesiumoxide en de PTFE-enveloppe.En sluit onmiddellijk de flacon met een grijze butyl rubberstopper. Sluit vervolgens de flacon af met een aluminium dop. Schud de flesjes bij 150 RPM gedurende drie uur bij vier graden Celsius onder donkere omstandigheden.Verwijder hierna de aluminium dop en de butylrubberstopper uit elke flacon. Verwijder de PTFE-envelop uit elke flacon met behulp van punt eindigde pincet, en grondig spoelen van de envelop en de pincet met ionen uitgewisseld water. Veeg vervolgens de envelop en de pincet met afvegend papier en leg de envelop op vers veegpapier.Open de PTFE envelop met platte einde en puntige eindigde pincet in omgekeerde volgorde van de vouwen stappen. Met behulp van platte pincet, houd het perifere gebied van de glasvezel filter, waar het zwavelzuur wordt verondersteld te worden unabsorbed. En breng het over in een 11 millimeter schroefdop reageerbuis.Spoel de pincet met ionenuitgewisseld water en veeg ze af met afvegend papier. Voeg een milliliter ionenuitgewisseld water toe aan elke reageerbuis. Sluit de reageerbuizen met PTFE gevoerde schroefdoppen en laat ze minstens 30 minuten op kamertemperatuur staan, om de ammoniumcation volledig te ontwijken aan het glasvezelfilter.Open hierna de schroefdop, voeg twee milliliter van een eerder voorbereid persulfaat oxiderende oplossing reagens aan de reageerbuis, en sluit de buis stevig met een schroefdop, om verlies of verontreiniging tijdens de volgende stappen te voorkomen. Zet de reageerbuizen op een rek, wikkel ze in dubbelgelaagde aluminiumfolie en maak ze een uur rechtop bij 121 graden Celsius. Meng 100 milliliter steriele 40 millimol per liter fosfaatbuffer, en 100 milliliter steriele 30 millimol per liter glucose aseptisch.Voeg een glycerolvoorraad P.chlororaphis toe aan 200 milliliter van de fosfaatgebufferde glucoseoplossing, in een Erlenmeyer-kolf van 300 milliliter. En zuiveren met een ultra pure helium stroom voor een uur. Vervolgens, afzien van twee milliliter van een eerder bereide denitrifier suspensie in vijf milliliter flesjes.Dop elke flacon met een grijze butyl rubberen stop, en een aluminium sluiting. Vervang de Headspace-lucht door ultrazuiver helium, door drie minuten te stofzuigen en het helium één minuut op te laden. Stel de headspace gas positieve druk in op 1,3 atmosferen, om onbedoelde luchtverontreiniging te voorkomen.Injecteer een milliliter van een monster of standaard door de butyl rubberstopper, met behulp van een wegwerpspuit van één milliliter. Dan, incubeer de flesjes 's nachts op 25 graden Celsius, onder donkere omstandigheden. Injecteer de volgende dag 0,3 milliliter zes moedervlekken per liter natriumhydroxide om de denitrificatie te stoppen en de Headspace-kooldioxide op te nemen, wat anders de analyse van lachgas zal verstoren.Omdat kooldioxide en lachgas hetzelfde molecuulgewicht hebben. Bepaal de hoeveelheden lachgas met een moleculair gewicht van 44, 45 en 46, in het Headspace gas met behulp van quadrupole GC/MS met een aangepaste injectiepoort. De representatieve resultaten werden afgeleid van 15 stikstoftracering experimenten van kwelder sedimenten gemaakt van de 2011 Great East Japan Aardbeving in het maangebied van Kesennuma stad en Miyagi prefectuur, Japan.Voor alle sedimenten die in de subgetijden- en intergetijdenzones werden verzameld, werd een toename van de gelabelde ammoniumconcentratie gedurende de incubatieperiode waargenomen. De DNRA-tarieven lagen binnen het bereik van 24,8 tot 177. En zijn vergelijkbaar met waarden die in eerdere studies worden gerapporteerd, maar hoger dan waarden die zijn afgeleid van vergelijkbare omgevingen.De hoge DNRA tarief, kan worden verklaard door de kwelder wordt gebruikt als een teeltveld voor de aardbeving. In overeenstemming met de speculatie, de DNRA tarief in de intergetijdenzone, die rijk is en organische verbindingen in vergelijking met de subtidal zone, was hoger. Ons protocol is breed toepasbaar op de analyse van metabole trajecten, waarbij ammoniumvorming en N15-sporentoevoelingen betrokken zijn.

Research

JoVE Journal

Environment

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimaliseer Rookgas instellingen ter bevordering van microalgen groei in fotobioreactoren via Computersimulaties

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

High-throughput Fluorometrische Meting van Potentiële Soil Extracellular Enzyme Activiteiten

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Het meten van koolstof gebaseerde Verontreinigende Mineralisering gebruik van gecombineerde CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux en Radiokoolstofdatering Analyses

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

Beoordeling van de labiele organische koolstof in de bodem met behulp van Sequential Fumigatiediensten Incubation Procedures

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Het evalueren van het effect van Environmental Chemicals over Honey Bee ontwikkeling van het individu naar Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Zichzelf staande elektrochemische Set-up te verrijken Anode-respiring bacteriën ter plaatse

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Schatten van Sediment denitrificatie tarieven met behulp van Cores en N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Samenstelling en analyse van de verdeling van Bioaerosols onder verschillende omgevingsomstandigheden

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...