Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
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Nous remercions Naoto Tanaka d’avoir aidé à la collecte de données et d’avoir développé le protocole. La collecte d’échantillons a été appuyée par le numéro de subvention 17K15286 de JSPS KAKENHI.

1. Préparation d’une enveloppe PTFE pour la capture quantitative de NH3 gazeux
<ol><li>Placer un morceau de ruban de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 60 mm (25 mm de largeur) sur une petite feuille de papier d’aluminium (environ 300 mm x 450 mm de taille, essuyé avec de l’éthanol).</li>
	<li>Cendres un filtre en fibre de verre (10 mm de diamètre avec une taille de pore de 2,7 μm) à 450 °C pour 4 h dans un four à silencieux. Placez le filtre en fibre de verre un peu au-dessus du point média...

Le rapport concentration et isotope du NH4+ pour l’analyse DNRA a été quantifié à l’aide de plusieurs méthodes. Les concentrations et les rapports isotopiques de NH4+ sont généralement mesurés séparément. La concentration de NH4+ est généralement mesurée à l’aide de méthodes colorimétriques, y compris un autoanalyseur4,10,15,<sup c...

La synthèse artificielle de l’engrais azoté et son application généralisée ont grandement perturbé le cycle mondial de l’azote. On estime que le transfert d’azote réactif des systèmes terrestres vers les systèmes côtiers a doublé depuis l’époque préindustrielle1. Une partie importante des engrais appliqués à un champ donné est emportée du sol vers les rivières ou les eaux souterraines, principalement sous le nomde NO 3− 2. Cela peut causer des problèmes environnementaux tels que la pollution de l’eau potable, l’eutrophisation et la formation d’hypoxie. NO3− dans les milieux aquatiques est retiré ou conservé dans l’écosystème par l’assimilation biologique et divers processus dissimilatoires microbiens. La dénitrification et l’anammox sont connus pour être des processus d’ablation microbienne majeurs pour no3−. La dénitrification est la réduction microbienne du NO3− aux produits gazeux N (NO, N2O et N2)couplée à l’oxydation d’un donneur d’électrons, tels que les substances organiques, réduisant ainsi le risque des problèmes susmentionnés. Anammox produit également N2 à partir de NO2− et NH4+; par conséquent, il élimine le N inorganique d’un écosystème. Inversement, la DNRA travaille à conserver le N dans un écosystème; il est généralement admis que la DNRA est effectuée principalement par des bactéries fermentatives ou des bactéries chimiolithoautotrophiques et qu’elles réduisent le N°3dissimilatoire− à la biodisponibilité et moins mobile NH4+.
Des études sur la DNRA ont été principalement réalisées dans des écosystèmes marins ou estuariens, tels que les sédiments océaniques ou estuariens et l’eau, le sol des marais salés ou saumâtres et le sol des mangroves. Les écosystèmes côtiers ou marins sont importants en tant que réservoirs pour enlever no3− des écosystèmes terrestres, et dans des études précédentes, DNRA a été montré pour contribuer sur un très large éventail de NO3− enlèvement (0–99%)3,4,5,6,7,,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. En outre, l’existence de la DNRA a été démontrée dans un large éventail d’environnements, y compris les milieux d’eau douce19, les sols paddy de riz20, et les sols forestiers21. Bien que ces études aient montré que la DNRA est potentiellement comparable à la dénitrification pour l’élimination du NO3− , les études mesurant l’activité du DNRA sont encore très limitées par rapport à celles mesurant la dénitrification.
Le taux de DNRA a été évalué à l’aide de 15techniques d’étiquetage N en conjonction avec l’analyse des données au moyen de modèles analytiques ou numériques. Une solution analytique pour calculer le taux de DNRA est basée sur l’augmentation de l’enrichissement de 15N du pool NH4+ après l’ajout de 15NO3− comme traceur. 15 N-étiqueté NO3− est ajouté à un échantillon et incubé, et le taux de DNRA peut alors être calculé à partir des variations de concentration et de rapport isotopique dans NH4+ avant et après une certaine période de temps. Dans cet article, une méthode de quantification de la concentration de NH4+ et du rapport isotopique, qui sont nécessaires pour calculer le taux de DNRA, est décrite en détail. Fondamentalement, la méthode rapportée ici est une combinaison de plusieurs techniques précédemment rapportées22,23,24,25,26 avec des modifications ajoutées à certaines procédures. La méthode est composée d’une série de cinq procédures composantes : (1) incubation d’un échantillon environnemental avec modification d’un traceur d’isotopes stables, 15NO3−, (2) extraction et récupération de NH4+ à l’aide d’une « rocédeur de diffusion » avec modifications, (3) oxydation du persulfate de NH4+ dans l’échantillon, composé de NH indigènes4+ et 15NH4+ dérivés de 15NO3− via l’activité DNRA, en N°3− et 15NO3−, (4) transformation microbienne ultérieure de NO3− et 15NO3− à N2O isotopomères par la méthode de dénitrification modifiée, et (5) quantification des isotopomères N2O utilisant la chromatographie gazeuse–spectrométrie de masse (GC/MS). Dans la section suivante, d’abord, la préparation des procédures (2) et (4) est décrite, puis, par la suite, les cinq procédures des composantes sont décrites en détail.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

L’importance de comprendre le sort du nitrate (NO3−), qui est l’espèce dominante de N transférée des écosystèmes terrestres aux écosystèmes aquatiques, a augmenté parce que les charges mondiales d’azote ont considérablement augmenté à la suite de l’industrialisation. La réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium (DNRA) et la dénitrification sont deux processus microbiens qui utilisent no3− pour la respiration. Par rapport à la dénitrification, les déterminations quantitatives de l’activité de la DNRA n’ont été effectuées que dans une mesure limitée. Cela a conduit à une compréhension insuffisante de l’importance de la DNRA dans les transformations no3− et des facteurs régulateurs de ce processus. L’objectif du présent document est de fournir une procédure détaillée pour la mesure du taux potentiel de DNRA dans les échantillons environnementaux. En bref, le taux potentiel de DNRA peut être calculé à partir du taux d’accumulation d’ammonium étiqueté 15N (15NH4+) dans 15NO3− incubation ajoutée. La détermination des 14concentrations de NH4+ et 15NH4+ décrites dans le présent document comprend les étapes suivantes. Tout d’abord, le NH4+ dans l’échantillon est extrait et piégé sur un filtre en verre acidifié comme sel d’ammonium. Deuxièmement, l’ammonium piégé est éluturé et oxydé à NO3− par oxydation du persulfate. Troisièmement, le NO3− est converti en N2O via un dénitrificateur déficient en réductase N2O. Enfin, le N2O converti est analysé à l’aide d’un système quadripolaire de spectrométrie par spectrométrie de masse précédemment développé. Nous avons appliqué cette méthode aux sédiments des marais salés et calculé leurs taux potentiels de DNRA, démontrant que les procédures proposées permettent une détermination simple et plus rapide par rapport aux méthodes décrites précédemment.

Les résultats représentatifs présentés dans cet article ont été tirés de 15expériences de traçage de N sur les sédiments des marais salés. Le marais salé échantillonné a été récemment créé à la suite du tremblement de terre de 2011 dans la région de Moune de la ville de Kesen-numa dans la préfecture de Miyagi, au Japon. En septembre 2017, des sédiments de surface (0 à 3 cm) ont été collectés à deux sites dans les zones subtidales et intertidales. Tou...

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Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Une série de méthodes pour déterminer le taux potentiel de DNRA sur la base de 14NH4+/15NH4+ analyses est fournie en détail. NH4+ est converti en N2O par plusieurs étapes et analysé à l’aide de la chromatographie au gaz quadrupole– spectrométrie de masse.

Mesure des taux potentiels de réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium sur la base de 14NH4+/15NH4+ Analyses via conversion séquentielle en N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Les écosystèmes côtiers et marins sont importants en tant que réservoirs, pour éliminer les nitrates des écosystèmes terrestres. Le nitrate dans le milieu aquatique peut être consommé par plusieurs processus simultanément. Comme la dénitrification, l’anammox et la DNRA.Alors que des études antérieures ont montré que la DNRA est potentiellement coupable de dénitrification, les études mesurant l’activité de la DNRA sont encore très limitées par rapport à celles mesurant la dénitrification. Dans notre protocole, nous fournissons une procédure détaillée pour la mesure du taux potentiel de DNRA dans les échantillons environnementaux. Nous croyons que le taux potentiel de DNRA peut être calculé à partir de l’accumulation d’Ammonium étiquetéE N15 avec ajout de nitrate étiqueté N15.L’avantage de notre méthode par rapport à d’autres méthodes, c’est que l’ammonium est finalement converti en oxyde nitreux, qui a un faible fond atmosphérique. En outre, il n’est pas sage que nous avons mesuré l’oxyde nitreux par spectromètre de masse de chromatographie de gaz quadrupole. Ce qui est moins coûteux et facile à gérer qu’un spectromètre de masse à ratio isotopique.Tout d’abord, placez un morceau de ruban PTFE de 60 millimètres sur une petite feuille de papier d’aluminium. Cendres d’un filtre en fibre de verre à 450 degrés Celsius pendant quatre heures dans un four à silencieux. Placez ensuite le filtre en fibre de verre un peu au-dessus du point médian de l’axe plus long de la bande.Ensuite, placez 20 microlitres de 0,9 grains de beauté par litre d’acide sulfurique au centre du filtre en fibre de verre, et pliez immédiatement le ruban PTFE à l’aide d’un timbre plat et d’une pince à épiler droite. Retournez le ruban PTFE sur le filtre en fibre de verre, puis scellez les deux côtés du ruban PTFE en pliant, puis en appuyant hermétiquement sur le bord avec les pinces à épiler. À l’aide de la pince à épiler, pliez l’extrémité ouverte de la bande PTFE et appuyez sur le bord.Sceller l’extrémité ouverte du ruban PTFE en appuyant hermétiquement sur le bord avec les pinces, en prenant soin de ne pas appuyer sur le filtre en fibre de verre. Transférer 30 milligrammes d’oxyde de magnésium ashed, à un flacon de verre de 20 millilitres, et placer l’enveloppe PTFE dans le flacon. Transférer cinq millilitres d’un échantillon ou d’une norme préalablement préparé dans le flacon contenant l’oxyde de magnésium et l’enveloppe PTFE.Et fermez immédiatement le flacon avec un bouchon en caoutchouc gris butyl. Ensuite, sceller le flacon avec un bouchon d’aluminium. Secouez les flacons à 150 rPM pendant trois heures à quatre degrés Celsius dans des conditions sombres.Par la suite, retirez le bouchon d’aluminium et le bouchon en caoutchouc butyl de chaque flacon. Retirez l’enveloppe PTFE de chaque flacon à l’aide d’une pince à épiler pointée et rincez soigneusement l’enveloppe et les pinces à épiler avec de l’eau échangée par ion. Ensuite, essuyez l’enveloppe et la pince à épiler avec du papier essuyant, et placez l’enveloppe sur du papier essuyant frais.Ouvrez l’enveloppe PTFE avec des pinces à épiler plates et pointues dans l’ordre inverse des marches pliante. À l’aide de pinces à épiler plates, maintenez la zone périphérique du filtre à fibres de verre, où l’acide sulfurique est censé ne pas être tamponné. Et transférez-le dans un tube à essai de bouchon à vis de 11 millimètres.Rincer les pinces à épiler avec de l’eau échangée par ion et essuyer avec du papier essuyant. Ajouter un millilitre d’eau échangée par ion à chaque tube à essai. Fermez les tubes à essai avec des bouchons à vis doublés PTFE, et laissez-les reposer pendant au moins 30 minutes à température ambiante, pour échapper complètement à la cation d’ammonium du filtre à fibre de verre.Par la suite, ouvrez le bouchon de vis, ajoutez deux millilitres d’un réaccente de solution oxydante de persulfate préalablement préparée au tube à essai, et fermez le tube étroitement avec un bouchon de vis, pour éviter toute perte ou contamination pendant les étapes suivantes. Tenez les tubes à essai sur une grille, enveloppez-les dans du papier d’aluminium à double couche et autoclavez-les en position verticale pendant une heure à 121 degrés Celsius. Mélanger 100 millilitres de tampon stérile de 40 millimoles par litre de phosphate tampon, et 100 millilitres de stériles 30 millimoles par litre de glucose aseptique.Ajouter un stock de glycérol de P.chlororaphis à 200 millilitres de la solution de glucose tamponné phosphate, dans un flacon Erlenmeyer de 300 millilitres. Et purger avec un flux d’hélium ultra pur pendant une heure. Ensuite, distribuez deux millilitres d’une suspension de dénigrement préparée précédemment en flacons de cinq millilitres.Capuchon chaque flacon avec un bouchon en caoutchouc gris butyl, et une fermeture en aluminium. Remplacer l’air headspace par de l’hélium ultra pur, en aspirant pendant trois minutes et en chargeant l’hélium pendant une minute. Réglez la pression positive du gaz Headspace à 1,3 atmosphère, afin d’éviter la contamination involontaire de l’air.Injecter un millilitre d’échantillon ou de série à travers le bouchon en caoutchouc butyl, à l’aide d’une seringue jetable d’un millilitre. Puis, incuber les flacons pendant la nuit à 25 degrés Celsius, dans des conditions sombres. Le lendemain, injectez 0,3 millilitres de six grains de beauté par litre d’hydroxyde de sodium pour arrêter la dénitrification et absorber le dioxyde de carbone Headspace, ce qui perturbera autrement l’analyse de l’oxyde nitreux.Parce que le dioxyde de carbone et l’oxyde nitreux ont le même poids moléculaire. Déterminer les quantités d’oxyde nitreux avec un poids moléculaire de 44, 45 et 46, dans le gaz Headspace à l’aide d’un quadrupole GC/MS avec un port d’injection modifié. Les résultats représentatifs ont été obtenus à partir de 15 expériences de traçage de l’azote des sédiments des marais salants créés à partir du grand tremblement de terre de l’est du Japon en 2011 dans la zone lunaire de la ville de Kesennuma et de la préfecture de Miyagi, au Japon.Une augmentation de la concentration d’ammonium étiqueté tout au long de la période d’incubation a été observée pour tous les sédiments recueillis dans les zones subtidales et intertidales. Les taux de la DNRA se trouvaient entre 24,8 et 177. Et sont comparables aux valeurs rapportées dans les études précédentes, mais plus élevées que les valeurs dérivées d’environnements similaires.Le taux élevé de DNRA, peut s’expliquer par le marais salé utilisé comme champ de culture avant le tremblement de terre. Conformément à la spéculation, le taux de DNRA dans la zone intertidale, qui est riche et organique composés par rapport à la zone subtidale, était plus élevé. Notre protocole est largement applicable à l’analyse des voies métaboliques, qui implique la formation d’ammonium et les ajouts de traces N15.

Research

JoVE Journal

Environment

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Optimiser les réglages des gaz de combustion pour la promotion de la croissance des microalgues en photobioréacteurs via des simulations informatiques

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Recherche

Environnement

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Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

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Contaminant Minéralisation de mesure à base de carbone Utilisation combinée CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux et radiocarbone Analyses

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