Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
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Ringraziamo Naoto Tanaka per aver aiutato la raccolta dei dati e lo sviluppo del protocollo. La raccolta di campioni è stata supportata da JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

1. Preparazione di una busta PTFE per la cattura quantitativa di NH3 gassosa
<ol><li>Posizionare un pezzo di nastro di politetrafluoroetilene (PTFE) (25 mm di larghezza) su un piccolo foglio di lamina di alluminio (circa 300 mm x 450 mm di dimensione, pulito con etanolo).</li>
	<li>Applicare un filtro in fibra di vetro (10 mm di diametro con una dimensione di poro di 2,7 m) a 450 gradi centigradi per 4 h in un forno a muffolo. Posizionare il filtro in fibra di vetro un po 'sopra il punto medio dell'asse più...

Il rapporto di concentrazione e isotopo di NH4per l'analisi DNRA è stato quantificato utilizzando diversi metodi. Le concentrazioni e i rapporti isotopi di NH4sono generalmente misurati separatamente. La concentrazione NH4è in genere misurata utilizzando metodi colorimetrici tra cui un autoanalyzer4,10,15,16,<sup cla...

La sintesi artificiale del fertilizzante azotato e la sua applicazione diffusa hanno notevolmente perturbato il ciclo globale dell'azoto. Si stima che il trasferimento di azoto reattivo dai sistemi terrestri ai sistemi costieri sia raddoppiato dai tempi preindustriali1. Una porzione significativa di fertilizzanti applicati a un determinato campo viene lavata via dal suolo ai fiumi o alle acque sotterranee, principalmente come NO3- 2. Ciò può causare problemi ambientali come l'inquinamento dell'acqua potabile, l'eutrofazione e la formazione di ipossia. NO3- in ambienti idrici viene rimosso o mantenuto nell'ecosistema tramite assimilazione biologica e vari processi dissimilivi microbici. Denitrificazione e anammox sono noti per essere i principali processi di rimozione microbica per NO3. La denitrificazione è la riduzione microbica di NO3- a prodotti gassosi N (NO, N2O e N2) accoppiata con l'ossidazione di un donatore di elettroni, come le sostanze organiche, riducendo così il rischio dei problemi di cui sopra. Anammox produce anche N2 da NO2e NH4; pertanto, rimuove n inorganico da un ecosistema. Al contrario, DNRA lavora per mantenere N in un ecosistema; è generalmente accettato che il DNRA sia eseguito principalmente da batteri fermentanti o chemiolithoautotrofici e che riducano la dissimiltoria NO3- a NH4biodisponibile e meno mobile .+
Studi sul DNRA sono stati condotti principalmente in ecosistemi marini o estuari, come sedimenti oceanici o estuari e acqua, sale o terreno paludoso sal brasato e suolo di mangrovie. Gli ecosistemi costieri o marini sono importanti in quanto i serbatoi per la rimozionedel NO3dagli ecosistemi terrestri, e in studi precedenti DNRA ha dimostrato di contribuire su una gamma molto ampia di NO3-rimozione (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Inoltre, l'esistenza di DNRA è stata dimostrata in una vasta gamma di ambienti tra cui ambientid'acqua dolce 19, risaie20e terreniforestali 21. Mentre questi studi hanno dimostrato che il DNRA è potenzialmente paragonabile alla denitrificazione per la rimozione di NO3,− gli studi che misurano l'attività del DNRA sono ancora molto limitati rispetto a quelli che misurano la denitrificazione.
Il tasso DNRA è stato valutato utilizzando 15tecniche di etichettatura N in combinazione con l'analisi dei dati tramite modelli analitici o numerici. Una soluzione analitica per calcolare il tasso di DNRA si basa sull'aumento dell'arricchimento 15N del pool NH4dopo l'aggiunta di 15NO3- come tracciante. 15 anni Il N-labeled NO3- viene aggiunto a un campione e incubato, e il tasso DNRA può quindi essere calcolato in base alle variazioni del rapporto di concentrazione e isotopo in NH4- prima e dopo un certo periodo di tempo. In questo documento, viene descritto in dettaglio un metodo per quantificarela concentrazione NH 4+ e il rapporto isotopi, necessari per calcolare il tasso DNRA. Fondamentalmente, il metodo riportato qui è una combinazione di diverse tecniche precedentemente riportate22,23,24,25,26 con modifiche aggiunte ad alcune procedure. Il metodo è costituito da una serie di cinque procedure componenti: (1) l'incubazione di un campione ambientale con la modifica di un tracciante isotopo stabile, 15NO3,(2) l'estrazione e il recupero di NH4+ , utilizzando una "procedura di diffusione" con modifiche, (3) persulfare l'ossidazione di NH4- nel campione, costituito da indigeni NH4e 15NH4- derivati da 15NO3- tramite attività DNRA, in NO3- e 15NO3,(4) successiva trasformazione microbica di NO3− e 3 15NO3- a N2O isotopomers tramite il metodo denitrifier modificato, e (5) la quantificazione degli isotopomi N2O utilizzando la cromatografia gassosa-spettrometria di massa (GC/MS).+ Nella sezione seguente, in primo luogo, viene descritta la preparazione per le procedure (2) e (4) e successivamente, tutte e cinque le procedure dei componenti sono descritte in dettaglio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

L'importanza di comprendere il destino del nitrato (NO3-), che è la specie dominante N trasferita dagli ecosistemi terrestri a quello acquatico, è aumentata perché i carichi globali di azoto sono aumentati drammaticamente dopo l'industrializzazione. La riduzione del nitrato dissimile all'ammonio (DNRA) e la denitrificazione sono entrambi processi microbici che utilizzano NO3per la respirazione. Rispetto alla denitrificazione, le determinazioni quantitative dell'attività dell'ANRA sono state effettuate solo in misura limitata. Ciò ha portato a una comprensione insufficiente dell'importanza del DNRA nelle trasformazioni NO3− e dei fattori di regolazione di questo processo. L'obiettivo di questo documento è quello di fornire una procedura dettagliata per la misurazione del potenziale tasso di DNRA nei campioni ambientali. In breve, il tasso potenziale di DNRA può essere calcolato a partire dal tasso di accumulo di ammonio 15N -15NH4-in 15NO3- incubazione aggiunta. La determinazione delle concentrazioni 14NH4e 15NH4 , descritte in questo documento, comprende le seguenti fasi. In primo luogo,l'NH 4nel campione viene estratto e intrappolato su un filtro di vetro acidificato come sale di ammonio. In secondo luogo, l'ammonio intrappolato viene elizzato e ossidato a NO3- tramite ossidazione persulfata. In terzo luogo, il NO3- viene convertito in N2O tramite un denitrifier N2O. Infine, il N2O convertito viene analizzato utilizzando un sistema di spettrometria di gas quadrupolo-massa precedentemente sviluppato. Abbiamo applicato questo metodo ai sedimenti delle paludi salate e calcolato i loro potenziali tassi di DNRA, dimostrando che le procedure proposte consentono una determinazione semplice e più rapida rispetto ai metodi descritti in precedenza.

I risultati rappresentativi presentati in questo documento sono stati ricavati da 15 esperimentidi N-tracing di sedimenti di paludi salate. La palude salata campiova è stata appena creata all'indomani del terremoto del 2011 nel Grande Giappone orientale nella zona di Moune della città di Kesen-numa nella prefettura di Miyagi, in Giappone. Nel settembre 2017, i sedimenti superficiali (0-3 cm) sono stati raccolti in due siti nelle zone subtidale e intertidale. In primo luogo, s...

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Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Viene fornita in dettaglio una serie di metodi per determinare il tasso potenziale di DNRA basato+ su 14NH4/15NH4. L'NH 4viene convertito in N2O attraverso diversi passaggi e analizzato utilizzando la cromatografia a gas quadrupole- spettrometria di massa.

Misurazione dei tassi potenziali di riduzione del nitrato dissimiliva all'ammonio sulla base di 14NH4/15NH4- Analisi tramite conversione sequenziale in N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Gli ecosistemi costieri e marini sono importanti come bacini idrici, per rimuovere i nitrati dagli ecosistemi terrestri. Il nitrato nell'ambiente acquatico può essere consumato contemporaneamente da diversi processi. Come denitrificazione, anammox e DNRA.Mentre studi precedenti hanno dimostrato che la DNRA è potenzialmente colpevole di denitrificazione, studi che misurano l'attività della DNRA sono ancora molto limitati rispetto a quelli che misurano la denitrificazione. Nel nostro protocollo, forniamo una procedura dettagliata per la misurazione del potenziale tasso DNRA nei campioni ambientali. Crediamo che il potenziale tasso DNRA possa essere calcolato dall'accumulo di ammonio etichettato N15 con aggiunta di nitrato etichettata N15.Il vantaggio del nostro metodo rispetto ad altri metodi, è che l'ammonio viene infine convertito in protossido di azoto, che ha un basso background atmosferico. Inoltre non è saggio che abbiamo misurato l'ossido di azoto tramite spettrometro di massa a gascromatografia quadrupolo. Che è meno costoso e facile da gestire rispetto a uno spettrometro di massa con rapporto isotopico.Per prima cosa, posiziona un pezzo di nastro PTFE da 60 millimetri su un piccolo foglio di foglio di alluminio. Intasare un filtro in fibra di vetro a 450 gradi Celsius per quattro ore in un forno a marmitta. Quindi posizionare il filtro in fibra di vetro un po 'sopra il punto centrale dell'asse più lungo del nastro.Successivamente, individuare 20 microlitri di 0,9 moli per litro di acido solforico al centro del filtro in fibra di vetro e piegare immediatamente il nastro PTFE utilizzando timbro a terminazione piatta e pinzette dritte. Capovolgere il nastro PTFE sul filtro in fibra di vetro, quindi sigillare entrambi i lati del nastro PTFE piegando e quindi premendo saldamente il bordo con le pinzette. Utilizzando le pinzette, piegare l'estremità aperta del nastro PTFE e premere il bordo.Sigillare l'estremità aperta del nastro PTFE premendo saldamente il bordo con le pinzette, facendo attenzione a non premere il filtro in fibra di vetro. Trasferire 30 milligrammi di ossido di magnesio ashed, in una fiala di vetro da 20 millilitri, e posizionare l'involucro PTFE nel flaconcino. Trasferire cinque millilitri di un campione o di uno standard precedentemente preparato nel flaconcino contenente l'ossido di magnesio e l'involucro PTFE.E chiudere immediatamente la fiala con un tappo di gomma butile grigia. Quindi, sigillare il flaconcino con un cappuccio in alluminio. Agitare le fiale a 150 giri/min per tre ore a quattro gradi Celsius in condizioni di buio.In seguito, rimuovere il cappuccio in alluminio e il tappo in gomma butile da ogni flaconcino. Rimuovere la busta PTFE da ogni flaconcino utilizzando una pinzetta a punta e sciacquare accuratamente la busta e le pinzette con acqua scambiata di ioni. Quindi, pulire la busta e le pinzette con carta da pulire e posizionare la busta su carta da pulire fresca.Aprire la busta PTFE con pinzette a punta piatta e appuntita in ordine inverso dei gradini pieghevoli. Usando una pinzetta piatta, tenere l'area periferica del filtro in fibra di vetro, dove si suppone che l'acido solforico non venga assorbito. E trasferirlo in una provetta a vite da 11 millimetri.Risciacquare le pinzette con acqua scambiata di ioni e pulirle con carta da pulire. Aggiungere un millilitro di ione scambiato d'acqua a ogni provetta. Chiudere le provette con tappi a vite rivestiti in PTFE e lasciare riposare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente, per eluire completamente il catione di ammonio dal filtro in fibra di vetro.In seguito, aprire il tappo a vite, aggiungere due millilitri di un reagente di soluzione ossidante persolfuro precedentemente preparato alla provetta e chiudere saldamente il tubo con un tappo a vite, per evitare qualsiasi perdita o contaminazione durante i seguenti passaggi. Metti le provette su un rack, avvolgile in un foglio di alluminio a doppio strato e autoclavali in posizione verticale per un'ora a 121 gradi Celsius. Mescolare 100 millilitri di sterile 40 millimoli per litro tampone fosfato, e 100 millilitri di sterile 30 millimoli per litro glucosio asettico.Aggiungere uno stock di glicerolo di P.clorooraphis a 200 millilitri della soluzione di glucosio tamponato al fosfato, in un pallone Erlenmeyer da 300 millilitri. E epurare con un flusso di elio ultra puro per un'ora. Successivamente, erogare due millilitri di una sospensione denitrificatore precedentemente preparata in cinque flaconcini millilitri.Tappare ogni fiala con un tappo in gomma butile grigia e una chiusura in alluminio. Sostituire l'aria Headspace con elio ultra puro, aspirando per tre minuti e caricando l'elio per un minuto. Impostare la pressione positiva del gas Headspace su 1,3 atmosfere, per evitare contaminazioni involontarie dell'aria.Iniettare un millilitro di un campione o standard attraverso il tappo di gomma butile, utilizzando una siringa monouso da un millilitro. Quindi, incubare le fiale durante la notte a 25 gradi Celsius, in condizioni di buio. Il giorno seguente, iniettare 0,3 millilitri di sei talpe per litro idrossido di sodio per fermare la denitrificazione e assorbire l'anidride carbonica Headspace, che altrimenti disturberà l'analisi dell'ossido di azoto.Perché l'anidride carbonica e il protossido di azoto hanno lo stesso peso molecolare. Determinare le quantità di protossido di azoto con un peso molecolare di 44, 45 e 46, nel gas Headspace utilizzando quadrupolo GC/MS con una porta di iniezione modificata. I risultati rappresentativi sono stati derivati da 15 esperimenti di tracciamento dell'azoto di sedimenti di saline creati dal terremoto del Grande Giappone orientale del 2011 nell'area lunare della città di Kesennuma e della prefettura di Miyagi, in Giappone.Un aumento della concentrazione di ammonio etichettata durante tutto il periodo di incubazione è stato osservato per tutti i sedimenti raccolti nelle zone subtidali e intertidali. I tassi DNRA erano tra 24,8 e 177. E sono paragonabili ai valori riportati negli studi precedenti, ma superiori ai valori derivati da ambienti simili.L'alto tasso di DNRA, può essere spiegato dal fatto che la palude salata viene utilizzata come campo di coltivazione prima del terremoto. Coerentemente con la speculazione, il tasso di DNRA nella zona intertidale, che è composto ricco e organico rispetto alla zona subtidale, era più alto. Il nostro protocollo è ampiamente applicabile all'analisi delle vie metaboliche, che comporta la formazione di ammonio e aggiunte di tracce N15.

Research

JoVE Journal

Environment

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Ricerca

Ambiente

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