Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
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田中直人氏のデータ収集とプロトコルの開発に感謝します。サンプルのコレクションは、JSPS KAKENHIグラント番号17K15286によってサポートされました。

1. 気体NH3を定量的に捕捉するためのPTFEエンベロープの調製
<ol><li>60mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)テープ(幅25mm)を小さなアルミニウム箔(約300mm x 450mmの大きさ、エタノールで拭く)に貼ります。</li>
	<li>450 °Cで450°Cで4時間、マフレ炉でガラス繊維フィルター(直径10mm、直径2.7μm)をアッシュします。ガラス繊維フィルターをテープの長軸の中間点の少し上に置きます(<strong class="xf...

DNRA分析のためのNH4++の濃度および同位体比は、いくつかの方法を用いて定量した。NH4++の濃度と同位体比は、一般に個別に測定される。NH4+濃度は、通常、オートアナライザ4、10、15、16、1710,15,16を含む色分け法を17使用して測定されます。<...

窒素肥料の人工合成とその広く普及した用途は、世界の窒素サイクルを大きく乱しています。陸上から沿岸システムへの反応性窒素の移動は、工業前の時代1から倍増していると推定される。特定の分野に適用される肥料のかなりの部分は、主にNO3- 2として、土壌から河川や地下水に洗い流されます。これは、飲料水汚染、富栄養化、低酸素症の形成などの環境問題を引き起こす可能性があります。NO3-水環境では、生物学的同化および様々な微生物の崩壊プロセスを介して生態系から除去または保持されます。脱窒とアナモックスはNO 3の主要な微生物除去プロセスであることが知られている3-.脱窒はNO3の微生物還元−ガスN製品(NO、N2O、N2)2と有機物などの電子2ドナーの酸化と相まって、上記の問題のリスクを低減する。アナモックスはまた、NO2からN2を生成する -とNH4+;したがって、生態系から無機Nを除去します。逆に、DNRAは生態系の中でNを保持するために働きます。DNRAは、主に発酵細菌またはケモリトオート栄養菌によって行われ、それらが不シミシ素性NO3を減少させることが一般的に受け入れられている- 生体利用可能で少ない移動式NH4+.
DNRAに関する研究は、海洋または河口堆積物や水、塩または汽水湿原土壌、マングローブ土壌などの海洋または河口生態系で主に行われてきた。沿岸生態系または海洋生態系は、陸上生態系からNO,12,,,3-除去のための貯水池として重要であり、以前の研究ではDNRAは、NO3-除去(0-99%)3、4、5、6、7、8、9、10、11、16、13、14、15、16、18の非常に広い範囲にわたって貢献することが示4,5,6,716,1715,13,14,,10,118,9されています。3,また、DNRAの存在は、淡水環境19、水田土20、林土21など幅広い環境で実証されている。これらの研究は、DNRAがNO3-−除去の脱窒に匹敵する可能性があることを示しているが、DNRA活性を測定する研究は、脱窒を測定するものに比べて依然として非常に限られている。
DNRAレートは、解析モデルまたは数値モデルを使用したデータ解析と組み合わせて、15のNラベル技術を使用して評価されています。DNRAレートを計算する1つの分析ソリューションは、トレーサーとして15NO3を追加した後のNH4++プールの15N濃縮の増加に基づいています。15NラベルNO3-サンプルに添加され、インキュベートされ、DNRA率は、一定期間の前後にNH4++の濃度および同位体比の変化から計算することができます。本論文では、DNRA率の計算に必要なNH4++濃度と同位体比を定量化する方法について詳しく説明する。基本的に、ここで報告される方法は、いくつかの手順に追加された修正を加えたいくつかの以前に報告されたテクニック22、23、24、25、2624,25,26の組み合わせです。22,23この方法は、一連の5つの成分手順で構成される:(1)安定同位体トレーサーの修正による環境試料のインキュベーション3、15NO3−、(2)NH4の4抽出と回収を改変した「拡散手順」を用いて、(3)試料中のNH4++過硫酸酸化、 先住民族のNH34+および15NH4++からなるDNRA活性を介して、NO3-および15NO3−、(4)その後の微生物変換NO33-−および15NO3-−修飾された樹木化法を介したN2Oアイソトポマー、および(5)ガスクロマトグラフィーを用いたN2Oイソトポマーの定量化(GC/MS/MS/GCrome)以降のセクションでは、まず、手順(2)と(4)の準備について説明し、次に、5つのコンポーネントの手順をすべて詳細に説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

地球から水生生態系に移されたN種の主3−な窒素である硝酸塩の運命を理解することの重要性は、工業化後に世界的な窒素負荷が劇的に増加したため、増加しています。アンモニウム(DNRA)への不シミラトリー硝酸塩の減少および脱窒は、両方ともNO3を使用する微生物プロセスである - 呼吸のために。脱窒と比較して、DNRA活性の定量的決定は限られた範囲でのみ行われてきた。これはNO3変換におけるDNRAの重要性とこのプロセスの調節要因の理解を十分にするに至った。本稿の目的は、環境試料中の潜在的なDNRA率の測定に関する詳細な手順を提供することにある。簡単に言えば、潜在的なDNRA率は、15NO3の15N標識アンモニウム(15NH4+)蓄積率から計算することができる-インキュベーションを加えた。4本論文に記載した14NH4+及び4+15NH4+濃度の判定は、以下の工程から構成される。4 まず、試料中のNH4++を抽出し、アンモニウム塩として酸性化ガラスフィルターに捕閉する。第二に、閉じ込められたアンモニウムは溶出し、過硫酸酸化を介してNO3に酸化される。第三に、NO3−はN2 O還元性デミターゼ欠乏樹を介してN2Oに変換される。2最後に、変換されたN2Oを、以前に開発した四極性ガスクロマトグラフィー質量分析システムを用いて分析する。この方法を塩沼堆積物に適用し、その潜在的なDNRA率を計算し、提案された手順が前述の方法と比較して簡単かつ迅速な決定を可能にすることを実証した。

本論文で発表された代表的な結果は、塩沼堆積物の 15のN-トレーシング実験から導出された。サンプリングされた塩沼は、2011年の東日本大震災の後、宮城県気仙沼市のMoune地区で新たに作られました。2017年9月、亜潮帯と潮間帯の2つの場所で、表面堆積物(0~3cm)が採取されました。まず、採取直後に、堆積物を4mmメッシュでふるいに入れ、植物の根、貝殻の破?...

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Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

144NH4+/15 1415NH4++分析に基づいて潜在的なDNRA率を決定する一連の方法が詳細に提供される。+NH4++は、数ステップでN2Oに変換され、四重極ガスクロマトグラフィー-質量分析を用いて分析されます。

N2Oへの逐次変換による14NH4+/154+ 1415NH4++分析に基づくアンモニウムへの非シミラトリー硝酸還元の電位率の測定

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

沿岸および海洋生態系は、陸上生態系から硝酸塩を除去するために、貯水池として重要です。水生環境での硝酸塩は、同時に複数のプロセスで消費することができます。脱窒、アナモックス、DNRAなど。以前の研究では、DNRAが脱窒可能である可能性が示されていますが、脱窒を測定するものと比較してDNRA活性を測定する研究は依然として非常に限られています。当社のプロトコルでは、環境サンプル中の潜在的なDNRA率の測定のための詳細な手順を提供します。我々は、潜在的なDNRA率は、N15ラベルのN15ラベルの硝酸塩添加とのアンモニウム蓄積から計算することができると考えています。我々の方法の利点は、他の方法と比較して、アンモニウムは、低大気の背景を有する亜酸化窒素に最終的に変換されるということです。また、四重極ガスクロマトグラフィー質量分析装置を介して亜酸化窒素を測定することは賢明ではありません。これは、同位体比質量分析計よりも安価で管理が容易です。まず、60ミリメートルのPTFEテープを小さなアルミニウム箔の上に置きます。マフル炉で450°Cでガラス繊維フィルターを4時間アッシュします。次に、ガラス繊維フィルターをテープの長い軸の中間点の少し上に置きます。次に、ガラス繊維フィルターの中央に硫酸1リットル当たり0.9モルの20マイクロリットルを見つけ、フラットエンドスタンプとストレートエンドピンセットを使用してPTFEテープを直ちに折りたたみます。PTFEテープをガラス繊維フィルターの上にひっくり返し、折り畳んでPTFEテープの両側を密封し、ピンセットで端をしっかりと押します。ピンセットを使用して、PTFEテープの開いた端を折り、端を押します。ピンセットで端をしっかりと押し、ガラス繊維フィルターを押さないでPTFEテープの開いた端を密封します。30ミリグラムの酸化マグネシウムを20ミリリットルガラスバイアルに移し、PTFEエンベロープをバイアルに入れます。前に調製したサンプルまたは標準の5ミリリットルを、酸化マグネシウムおよびPTFEエンベロープを含むバイアルに移します。そしてすぐに灰色のブチルゴムストッパーでバイアルを閉じます。次に、アルミキャップでバイアルを密封します。暗い状態で摂氏4度で3時間150 RPMでバイアルを振ります。これに続いて、各バイアルからアルミキャップとブチルゴムストッパーを取り外します。ポイントエンドピンセットを使用して各バイアルからPTFEエンベロープを取り出し、イオン交換水で封筒とピンセットを徹底的に洗い流します。その後、封筒とピンセットを拭き取り紙で拭き取り、封筒を新鮮な拭き取り紙の上に置きます。平らな終わりでPTFEの封筒を開き、折り畳みステップの逆の順序で尖ったピンセットを終えた。平らな終わりのピンセットを使用して、硫酸が吸収されないはずのガラス繊維フィルターの周辺領域を保持する。そして11ミリメートルのスクリューキャップ試験管にそれを移す。イオン交換水でピンセットをすすいで拭き取り、拭き取り紙で拭きます。各試験管に1ミリリットルのイオン交換水を加えます。PTFEが並んだスクリューキャップ付きの試験管を閉じ、室温で少なくとも30分間放置して、ガラス繊維フィルターからアンモニウムカチオンを完全に排除します。これに続いて、スクリューキャップを開き、試験管に以前に調製した過硫酸酸化溶液試薬の2ミリリットルを加え、スクリューキャップでチューブをしっかりと閉じて、以下のステップで損失または汚染を防ぎます。試験管をラックに置き、二重層アルミニウム箔で包み、摂氏121度で1時間直立した位置にオートクレーブします。1リットルのリン酸バッファーあたり滅菌40ミリモルの100ミリリットル、無菌グルコース1リットル当たり30ミリモルの100ミリリットルを混ぜます。P.クロロラフィスのグリセロールストックをリン酸緩衝グルコース溶液の200ミリリットルに300ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコに加える。そして、1時間の超純粋なヘリウムストリームでパージします。次に、前に調製した歯硝化懸濁液の2ミリリットルを5ミリリットルバイアルに分配する。グレーのブチルゴムストッパーとアルミニウムクロージャーで各バイアルをキャップします。ヘッドスペースの空気を超純粋なヘリウムに交換し、3分間真空にしてヘリウムを1分間充電します。意図しない空気汚染を避けるために、ヘッドスペースガスの正圧を1.3気圧に設定します。1ミリリットルの使い捨て注射器を使用して、ブチルゴムストッパーを通してサンプルまたは標準の1ミリリットルを注入する。その後、暗い条件下で、摂氏25度で一晩バイアルをインキュベートします。翌日、1リットル当たり6モルの水酸化ナトリウムを0.3ミリリットル注入して脱窒を止め、ヘッドスペース二酸化炭素を吸収し、それ以外の場合は亜酸化窒素分析を妨害します。二酸化炭素と亜酸化窒素は同じ分子量を有するため。4極小極GC/MSを改変して、ヘッドスペースガス内の分子量44、45、46の亜酸化窒素の量を決定します。本代表は、2011年の東日本大震災で発生した、気仙沼市と宮城県の月面で発生した塩沼堆積物の窒素トレース実験15件に由来した。潜伏期間を通して標識アンモニウム濃度の増加は、サブ潮帯および潮間帯に集められたすべての堆積物に対して観察された。DNRAレートは24.8から177の範囲内でした。また、以前の研究で報告された値に匹敵するが、類似した環境から導き出された値よりも高い。高いDNRA率は、地震前に栽培場として使用されている塩沼によって説明することができる。推測と一致して、サブ潮帯と比較して豊富で有機化合物である潮間帯におけるDNRA率は高かった。当社のプロトコルは、アンモニウム形成およびN15トレース付加を含む代謝経路の分析に広く適用可能である。

Research

JoVE Journal

Environment

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

計算機シミュレーションを通してフォトバイオリアクターで藻類の成長を促進するために排煙設定を最適化

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

潜在的な土壌菌体外酵素の活動のハイスループット蛍光測定

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

複合COを用いたカーボンベースの汚染鉱化作用を測定します<sub&gt; 2</sub&gt;フラックスと放射性炭素分析

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

シーケンシャル燻蒸インキュベーション・プロシージャを使用した土壌中の不安定な有機炭素の評価

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

敷地内に陽極 respiring 細菌を豊かに自立の電気化学的セットアップ

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

コアと N2O マイクロ センサーを使用して土砂脱窒率を推定

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布解析

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...