Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Vi takker Naoto Tanaka for å ha hjulpet til med datainnsamling og utvikling av protokollen. Innsamlingen av prøver ble støttet av JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

1. Fremstilling av en PTFE-konvolutt for kvantitativt fangst av gassfattig NH3
<ol><li>Plasser et 60 mm stykke polytetrafluoretylentape (PTFE) (25 mm i bredden) på et lite ark aluminiumsfolie (ca. 300 mm x 450 mm i størrelse, tørket med etanol).</li>
	<li>Aske et glassfiberfilter (10 mm i diameter med en porestørrelse på 2,7 μm) ved 450 °C i 4 timer i en muffleovn. Plasser glassfiberfilteret litt over midtpunktet på den lengre aksen på båndet (figur 1a).</li>
	<li>Punk...

Konsentrasjons- og isotopforholdet mellom NH4+ for DNRA-analysen ble kvantifisert ved hjelp av flere metoder. Konsentrasjonene og isotopforholdene til NH4+ måles vanligvis separat. NH4+ konsentrasjon måles vanligvis ved hjelp av kolorimetriske metoder, inkludert en autoanalyzer4,,10,,15,,16,,17</sup...

Den kunstige syntesen av nitrogengjødsel og den utbredte applikasjonen har i stor grad gjennomsyret den globale nitrogensyklusen. Det er anslått at overføringen av reaktivt nitrogen fra terrestriske til kystsystemer har doblet seg siden førindustriell tid1. En betydelig del av gjødsel brukt på et gitt felt vaskes bort fra jord til elver eller grunnvann, først og fremst som NO3− 2. Dette kan føre til miljøproblemer som drikkevannforurensning, eutrofiering og dannelse av hypoksi. NO3− i vannmiljøer fjernes fra eller beholdes i økosystemet via biologisk assimilering og ulike mikrobielle dissimilatory prosesser. Denitrifisering og anammox er kjent for å være store mikrobielle fjerningsprosesser for NO3−. Denitrifisering er mikrobiell reduksjon av NO3− til gassprodukter (NO, N2O og N2) kombinert med oksidasjon av en elektrondonor, som organiske stoffer, og dermed redusere risikoen for de ovennevnte problemene. Anammox produserer også N2 fra NO2− og NH4+; Derfor fjerner det uorganisk N fra et økosystem. Derimot arbeider DNRA for å beholde N i et økosystem; det er allment akseptert at DNRA utføres hovedsakelig av fermentative bakterier eller chemolithoautotrohic bakterier og at de reduserer dissimilatory NO3− til biotilgjengelig og mindre mobil NH4+.
Studier på DNRA har primært blitt utført i marine eller elvemunning økosystemer, som oseanisk eller elvemunning sedimenter og vann, salt eller brakkmyr jord, og mangrove jord. Kyst- eller marine økosystemer er viktige som reservoarer for å fjerne NO3− fra terrestriske økosystemer, og i tidligere studier DNRA har vist seg å bidra over et svært bredt spekter av NO3− fjerning (0-99%)3,,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15,,16,,17,,18. Videre har eksistensen av DNRA blitt demonstrert i et bredt spekter av miljøer, inkludert ferskvannsmiljøer19,ris risjord20og skogsjord21. Selv om disse studiene har vist at DNRA potensielt kan sammenlignes med denitrifisering for NO3− fjerning, er studier som måler DNRA-aktiviteten fortsatt svært begrenset sammenlignet med de som måler denitrifisering.
DNRA-frekvensen er evaluert ved hjelp av 15N-merkingsteknikker i forbindelse med dataanalyse via analytiske eller numeriske modeller. En analytisk løsning for å beregne DNRA-satsen er basert på økningen i 15N-berikelsen av NH4+ bassenget etter tillegg av 15NO3− som tracer. 15.15 .15 N-merket NO3− legges til en prøve og inkuberes, og DNRA-satsen kan deretter beregnes ut fra konsentrasjons- og isotopforholdet endres i NH4+ før og etter en viss tidsperiode. I dette papiret er en metode for å kvantifisere NH4+ konsentrasjonen og isotopforholdet, som er nødvendig for å beregne DNRA-satsen, beskrevet i detalj. I utgangspunktet er metoden rapportert her en kombinasjon av flere tidligere rapporterteteknikker 22,23,24,25,26 med modifikasjoner lagt til noen prosedyrer. Metoden består av en rekke fem komponentprosedyrer: (1) inkubasjon av en miljøprøve med endring av en stabil isotopsporer, 15NO3−, (2) ekstraksjon og gjenoppretting av NH4+ ved hjelp av en "diffusjonsprosedyre" med modifikasjoner, (3) persulfatoksidasjon av NH4+ i prøven, bestående av innfødte NH4+ og 15NH4+ avledet fra 15NO3− via DNRA-aktivitet, til NO3− og 15NO3−, (4) påfølgende mikrobiell transformasjon av NO3− og 15NO3− til N2O isotopomers via den modifiserte denitrifiermetoden, og (5) kvantifisering av N2O isotopomers ved hjelp av gasskromatografi–massespektrometri (GC/MS). I den følgende delen beskrives først preparatet for prosedyrer (2) og (4), og deretter beskrives alle de fem komponentprosedyrene i detalj.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

Betydningen av å forstå nitratets skjebne (NO3−), som er den dominerende N-arten som overføres fra terrestriske til akvatiske økosystemer, har økt fordi globale nitrogenbelastninger har økt dramatisk etter industrialiseringen. Dissimilatory nitratreduksjon til ammonium (DNRA) og denitrifisering er begge mikrobielle prosesser som bruker NO3− for respirasjon. Sammenlignet med denitrifisering er kvantitative bestemmelser av DNRA-aktiviteten kun utført i begrenset grad. Dette har ført til en utilstrekkelig forståelse av viktigheten av DNRA i NO3− transformasjoner og de regulerende faktorene i denne prosessen. Målet med dette papiret er å gi en detaljert prosedyre for måling av den potensielle DNRA-frekvensen i miljøprøver. Kort sagt kan den potensielle DNRA-satsen beregnes ut fra det 15N-merkede ammonium (15NH4+) akkumuleringshastighet i 15NO3− tilsatt inkubasjon. Fastsettelsen av de 14NH4+ og 15NH4+ konsentrasjonene som er beskrevet i dette papiret, består av følgende trinn. Først blir NH4+ i prøven ekstrahert og fanget på et surt glassfilter som ammoniumsalt. For det andre er det fanget ammonium eluted og oksidert til NO3− via persulfatoksidasjon. For det tredje konverteres NO3− til N2O via en N2O-reduktase mangelfull denitrifier. Til slutt analyseres det konverterte N2O ved hjelp av et tidligere utviklet quadrupole gasskromatografi–massespektrometrisystem. Vi brukte denne metoden til å saltmyrsedimenter og beregnet sine potensielle DNRA-priser, noe som viser at de foreslåtte prosedyrene tillater en enkel og raskere bestemmelse sammenlignet med tidligere beskrevne metoder.

De representative resultatene som presenteres i denne artikkelen ble avledet fra 15N-sporingseksperimenter av saltmyrsedimenter. Den samplede saltmyren ble nyopprettet i kjølvannet av jordskjelvet i Great East Japan i Moune-området i Kesen-numa i Miyagi-prefekturet i Japan i 2011. I september 2017 ble overflatesedimenter (0–3 cm) samlet inn på to steder i subtidal- og intertidalsonene. Først, umiddelbart etter innsamling, ble sedimentet siktet gjennom et 4 mm nett for å ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

En rekke metoder for å bestemme den potensielle DNRA-satsen basert på 14NH4+/15NH4+ analyser er gitt i detalj. NH4+ omdannes til N2O via flere trinn og analyseres ved hjelp av quadrupole gasskromatografi–massespektrometri.

Måling av de potensielle frekvensene av dissimilatory nitratreduksjon til ammonium basert på 14NH4+/15NH4+ Analyser via sekvensiell konvertering til N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Kyst og de marine økosystemene er viktige som reservoarer, for å fjerne nitrat fra terrestriske økosystemer. Nitrat i vannmiljø kan konsumeres av flere prosesser samtidig. Som denitrifisering, anammox og DNRA.Mens tidligere studier har vist at DNRA er potensielt skyldig i denitrifisering, studier som måler DNRA aktivitet som fortsatt svært begrenset sammenlignet med de som måler denitrifisering. I vår protokoll gir vi en detaljert prosedyre for måling av den potensielle DNRA-frekvensen i miljøprøver. Vi tror at potensiell DNRA-rate kan beregnes fra N15 merket Ammonium akkumulering med N15 merket Nitrat tillegg.Fordelen med vår metode i forhold til andre metoder, er at Ammonium til slutt konverteres til lystgass, som har lav atmosfærisk bakgrunn. Det er heller ikke lurt at vi målte lystgass via quadrupole gasskromatografi massespektrometer. Som er billigere og lett å administrere enn en isotop-ratio massespektrometer.Først plasserer du et 60 millimeter stykke PTFE-tape på et lite ark aluminiumsfolie. Aske et glassfiberfilter ved 450 grader Celsius i fire timer i en muffle ovn. Plasser deretter glassfiberfilteret litt over midtpunktet på båndets lengre akse.Deretter oppdager du 20 mikroliter med 0,9 mol per liter svovelsyre på midten av glassfiberfilteret, og bretter umiddelbart PTFE-båndet ved hjelp av flatt endt stempel og rett endte pinsett. Snu PTFE-båndet over glassfiberfilteret, og forsegle deretter begge sider av PTFE-båndet ved å brette og deretter trykke på kanten tett med pinsettene. Bruk pinsettene til å brette den åpne enden av PTFE-båndet og trykk på kanten.Forsegle den åpne enden av PTFE-tapen ved å trykke på kanten tett med pinsettene, og vær forsiktig så du ikke trykker på glassfiberfilteret. Overfør 30 milligram aske magnesiumoksid, til et 20 milliliter hetteglass, og legg PTFE-konvolutten i hetteglasset. Overfør fem milliliter av en tidligere forberedt prøve eller standard til hetteglasset som inneholder magnesiumoksidet og PTFE-konvolutten.Og lukk umiddelbart hetteglasset med en grå butylgummipropp. Deretter forsegler du hetteglasset med en aluminiumshette. Rist hetteglassene ved 150 O/min i tre timer ved fire grader Celsius under mørke forhold.Etter dette fjerner du aluminiumshetten og butylgummiproppen fra hvert hetteglass. Fjern PTFE-konvolutten fra hvert hetteglass med punktendte pinsett, og skyll konvolutten og pinsettene grundig med ionutbyttet vann. Tørk deretter av konvolutten og pinsettene med tørkepapir, og legg konvolutten på nytt tørkepapir.Åpne PTFE-konvolutten med flate end og spisse endet pinsett i omvendt rekkefølge av foldetrinnene. Bruk flate end pinsett, hold det perifere området av glassfiberfilteret, hvor svovelsyren skal være uabsorbert. Og overfør den til en 11 millimeter skrue cap testrør.Skyll pinsettene med ionutbyttet vann og tørk dem med tørkepapir. Tilsett en milliliter ion utvekslet vann til hvert testrør. Lukk reagensrørene med PTFE foret skruehetter, og la dem stå i minst 30 minutter ved romtemperatur, for å fullstendig unnvike ammoniumkation fra glassfiberfilteret.Etter dette åpner du skrukorken, legger til to milliliter av en tidligere forberedt persulfatoksiderende løsningsreagens til reagensen, og lukk røret tett med en skrukork, for å forhindre tap eller kontaminering under følgende trinn. Stå reagensrørene på et stativ, pakk dem inn i dobbeltlags aluminiumsfolie, og autoklav dem i oppreist stilling i en time ved 121 grader Celsius. Bland 100 milliliter sterile 40 millimol per liter fosfatbuffer, og 100 milliliter sterile 30 millimol per liter glukose aseptisk.Tilsett en glyserolbestand av P.chlororaphis til 200 milliliter av fosfatbufret glukoseoppløsning, i en 300 milliliter Erlenmeyer kolbe. Og utrenskning med en ultra ren heliumstrøm i en time. Deretter dispenserer du to milliliter av en tidligere forberedt denitrifiersuspensjon i fem milliliter hetteglass.Cap hvert hetteglass med en grå butylgummipropp, og en aluminiumslukking. Bytt headspace luften med ultra ren helium, ved å støvsuge i tre minutter og lade helium i ett minutt. Sett headspace gass positivt trykk til 1,3 atmosfærer, for å unngå utilsiktet luftforurensning.Injiser en milliliter av en prøve eller standard gjennom butylgummiproppen, ved hjelp av en engangssprøyte på én milliliter. Deretter inkubere hetteglassene over natten ved 25 grader Celsius, under mørke forhold. På følgende dag injiserer du 0,3 milliliter med seks mol per liter natriumhydroksid for å stoppe denitrifiseringen og absorbere Headspace karbondioksid, som ellers vil forstyrre lystgassanalysen.Fordi karbondioksid og lystgass har samme molekylvekt. Bestem mengden lystgass med en molekylvekt på 44, 45 og 46, i Headspace-gassen ved hjelp av quadrupole GC/MS med en modifisert injeksjonsport. De representative resultatene ble avledet fra 15 nitrogen sporing eksperimenter av salt myr sedimenter opprettet fra 2011 Great East Japan Jordskjelvet i månen området Kesennuma byen og Miyagi prefektur, Japan.En økning i den merkede ammoniumkonsentrasjonen gjennom inkubasjonsperioden ble observert for alle sedimenter samlet i subtidal- og intertidalsonene. DNRA-ratene var innenfor området 24,8 til 177. Og kan sammenlignes med verdier rapportert i tidligere studier, men høyere enn verdier avledet fra lignende miljøer.Den høye DNRA-raten kan forklares med at saltmyren brukes som dyrkingsfelt før jordskjelvet. I samsvar med spekulasjonene var DNRA-frekvensen i den intertidale sonen, som er rike og organiske forbindelser sammenlignet med subtidalsonen, høyere. Vår protokoll er allment anvendelig for analyse av metabolske veier, som innebærer ammoniumdannelse og N15 sportillegg.

Research

JoVE Journal

Environment

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimalisere Røykgass Innstillinger for å fremme Mikroalger Vekst i fotobioreaktorer via datasimulering

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Høy gjennomstrømming Fluorometrisk Måling av mulig Jord Ekstracellulære enzymaktivitet

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Måling Carbon-baserte Forurensing Minera Bruke Kombinert CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux og radiokarbon Analyser

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Måling Utbredelsen av ugressmiddel Metabolism i dicot Weeds med et utskåret Leaf analysen

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

Vurdering av labile organisk karbon i jord Bruke Sekvensiell utgassing Inkubasjon Prosedyrer

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Evaluere effekten av miljø Kjemikalier på Honey Bee utvikling fra den enkelte til Colony nivå

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Frittstående elektrokjemiske satt opp til å berike Anode-respiring bakterier på stedet

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Estimering Sediment Denitrification priser bruker kjerner og N2O Microsensors

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammensetning og distribusjon analyse av Bioaerosols Under ulike miljøforhold

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...