Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
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Agradecemos a Naoto Tanaka por ajudar na coleta de dados e desenvolver o protocolo. A coleta de amostras foi apoiada pelo JSPS KAKENHI Grant Número 17K15286.

1. Preparação de um envelope PTFE para captura quantitativa de NHgasoso 3
<ol><li>Coloque uma peça de 60 mm de fita politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de largura) em uma pequena folha de papel alumínio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamanho, limpa com etanol).</li>
	<li>Ash um filtro de fibra de vidro (10 mm de diâmetro com um tamanho de poros de 2,7 μm) a 450 °C por 4h em um forno de abafa. Coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita<strong clas...

A razão de concentração e isótopo de NH4+ para a análise DNRA foi quantificada utilizando vários métodos. As concentrações e as relações de isótopos de NH4+ são geralmente medidas separadamente. A concentração NH4+ é tipicamente medida usando métodos colorimétricos, incluindo um autoanalyzer4,10,15,16,</sup...

A síntese artificial do fertilizante nitrogênio e sua aplicação generalizada têm perturbado muito o ciclo global de nitrogênio. Estima-se que a transferência de nitrogênio reativo de sistemas terrestres para costeiros dobrou desde o pré-industrial1. Uma porção significativa de fertilizantes aplicados a um determinado campo é levada do solo para rios ou águas subterrâneas, principalmente como nº3− 2. Isso pode causar problemas ambientais, como a poluição da água potável, a eutrofização e a formação de hipóxia. NO3− em ambientes hídricos é removido ou retido no ecossistema através de assimilação biológica e vários processos dissimlatórios microbianos. A denitrificação e a anammox são conhecidas por serem os principais processos de remoção microbiana para o NO3−. A denitrificação é a redução microbiana de produtosN− N gasoso (NO, N2O e N2) juntamente com a oxidação de um doador de elétrons, como substâncias orgânicas, reduzindo assim o risco dos problemas acima mencionados. A Anammox também produz N2 a partir de NO2− e NH4+; portanto, remove n inorgânico de um ecossistema. Por outro lado, a DNRA trabalha para reter n em um ecossistema; é geralmente aceito que o DNRA é realizado principalmente por bactérias fermentativas ou quimiotoautotróficas e que reduzem o dissimlatório NO3– à NH 4+4+ biodisponente e menos móvel.
Estudos sobre DNRA têm sido realizados principalmente em ecossistemas marinhos ou estuarinos, como sedimentos oceânicos ou estuarinos e água, solo salgado ou salgado e solo de manguezal. Ecossistemas costeiros ou marinhos são importantes como reservatórios para a remoção do Nº3– dos ecossistemas terrestres, e em estudos anteriores o DNRA tem se mostrado contribuinte em uma gama muito ampla de NO3− remoção (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Além disso, a existência do DNRA tem sido demonstrada em uma ampla gama de ambientes, incluindo ambientes de água doce19,solos de arroz20e solosflorestais 21. Embora esses estudos tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente comparável à denitrificação para o NO3− remoção, os estudos que medem a atividade de DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação.
A taxa de DNRA foi avaliada utilizando-se 15técnicas de rotulagem N em conjunto com a análise de dados por meio de modelos analíticos ou numéricos. Uma solução analítica para calcular a taxa DNRA baseia-se no aumento do enriquecimento de 15N do pool NH4+ após a adição de 15NO3− como rastreador. 15 N-rotulado NO3− é adicionado a uma amostra e incubado, e a taxa de DNRA pode então ser calculada a partir da concentração e da razão isótopo alterações na NH4+ antes e depois de um determinado período de tempo. Neste artigo, um método para quantificar a concentração NH4+ e a razão isótopos, que são necessários para calcular a taxa de DNRA, é descrito em detalhes. Basicamente, o método aqui relatado é uma combinação de várias técnicas relatadas anteriormente22,23,24,25,26 com modificações adicionadas a alguns procedimentos. O método é composto por uma série de cinco procedimentos componentes: (1) incubação de uma amostra ambiental com a alteração de um rastreador de isótopos estáveis, 15NO3−, (2) extração e recuperação de NH4+ utilizando um "procedimento de difusão" com modificações, (3) oxidação persulfato de NH4+ na amostra, constituído por NH4+ e 15NH4+ derivados de 15NO3− via atividade DNRA, em NO3− e 15NO3−, (4) posterior transformação microbiana de NO3− e 1 5NO3− para N2O isotopomers através do método denitrifier modificado, e (5) quantificação dos isotopolímeros N2O usando cromatografia a gás espectrometria de massa (GC/MS). Na seção seguinte, primeiro, a preparação para procedimentos (2) e (4) é descrita e, posteriormente, todos os cinco procedimentos componentes são descritos detalhadamente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

A importância de entender o destino do nitrato (NO3−), que é a espécie N dominante transferida de ecossistemas terrestres para aquáticos, tem aumentado porque as cargas globais de nitrogênio aumentaram drasticamente após a industrialização. A redução do nitrato dissimlatório para o amônio (DNRA) e a denitrificação são processos microbianos que usam o NO3– para respiração. Em comparação com a denitrificação, as determinações quantitativas da atividade DNRA têm sido realizadas apenas em uma medida limitada. Isso levou a uma compreensão insuficiente da importância do DNRA no Nº3– transformações e os fatores reguladores desse processo. O objetivo deste artigo é fornecer um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Em suma, a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir da taxa de acumulação de amônio com rótulo N 15NH (15NH4+) em 15NO3− incubação adicionada. A determinação das concentrações 14NH4+ e 15NH4+ descritas neste artigo é composta pelas etapas a seguir. Primeiro, o NH4+ na amostra é extraído e preso em um filtro de vidro acidificado como sal de amônio. Em segundo lugar, o amônio preso é elucido e oxidado para o Nº3- via oxidação persulfeto. Em terceiro lugar, o NO3− é convertido para N2O através de um N2O reductase denitrifier deficiente. Finalmente, o N2O convertido é analisado usando um sistema de espectrometria de gás quadrúpole previamente desenvolvido. Aplicamos este método aos sedimentos de pântanos salgados e calculamos suas potenciais taxas de DNRA, demonstrando que os procedimentos propostos permitem uma determinação simples e mais rápida em comparação com os métodos descritos anteriormente.

Os resultados representativos apresentados neste artigo foram derivados de 15experimentos de rastreamento n de sedimentos de pântanos salgados. O pântano de sal amostrado foi recentemente criado após o Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área de Moune da cidade de Kesen-numa, na província de Miyagi, japão. Em setembro de 2017, sedimentos superficiais (0-3 cm) foram coletados em dois locais nas zonas subtidal e intertidais. Primeiro, logo após a coleta, o sedim...

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Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Uma série de métodos para determinar a taxa potencial de DNRA com base em 14NH4+/15NH4+ análises é fornecida em detalhes. NH4+ é convertido em N2O através de várias etapas e analisado usando cromatografia de gás quadrupole-espectrometria de massa.

Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em 14NH4+/15NH4+ Análises via Conversão Sequencial para N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Os ecossistemas costeiros e marinhos são importantes como reservatórios, para a remoção de nitrato de ecossistemas terrestres. O nitrato no ambiente aquático pode ser consumido por vários processos simultaneamente. Como denitrificação, anammox e DNRA.Embora estudos anteriores tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente culpado pela denitrificação, estudos que medem a atividade do DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação. Em nosso protocolo, fornecemos um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Acreditamos que a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir do acúmulo de amônio rotulado N15 com adição de nitrato rotulado N15.A vantagem do nosso método em comparação com outros métodos, é que o amônio é finalmente convertido em óxido nitroso, que tem um baixo fundo atmosférico. Também não é sábio que medimos óxido nitroso através de espectrômetro de massa de gás quadrupole. O que é menos caro e fácil de gerenciar do que um espectrômetro de massa de razão de isótopos.Primeiro, coloque um pedaço de fita PTFE de 60 milímetros em uma pequena folha de papel alumínio. Ash um filtro de fibra de vidro a 450 graus Celsius por quatro horas em um forno de abafa. Em seguida, coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita.Em seguida, local 20 microliters de 0,9 mols por litro de ácido sulfúrico no centro do filtro de fibra de vidro, e imediatamente dobre a fita PTFE usando selo de final plano e pinças retas. Vire a fita PTFE sobre o filtro de fibra de vidro e, em seguida, sele ambos os lados da fita PTFE dobrando e, em seguida, pressionando firmemente a borda com a pinça. Usando a pinça, dobre a extremidade aberta da fita PTFE e pressione a borda.Sele a extremidade aberta da fita PTFE pressionando firmemente a borda com a pinça, tomando cuidado para não pressionar o filtro de fibra de vidro. Transfira 30 miligramas de óxido de magnésio cinzas para um frasco de vidro de 20 mililitros, e coloque o envelope PTFE no frasco. Transfira cinco mililitros de uma amostra ou padrão previamente preparado para o frasco contendo o óxido de magnésio e o envelope PTFE.E imediatamente feche o frasco com uma rolha de borracha de butyl cinza. Em seguida, sele o frasco com uma tampa de alumínio. Agite os frascos a 150 RPM por três horas a quatro graus Celsius em condições escuras.Na sequência, remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl de cada frasco. Remova o envelope PTFE de cada frasco usando pinças de ponta e enxágue completamente o envelope e a pinça com água trocada por íons. Em seguida, limpe o envelope e as pinças com papel limpo, e coloque o envelope em papel de limpeza fresco.Abra o envelope PTFE com pinças pontiagudas e pontas em ordem inversa das etapas dobráveis. Usando pinças de ponta plana, segure a área periférica do filtro de fibra de vidro, onde o ácido sulfúrico deve ser não absorvido. E transfira para um tubo de teste de tampa de parafuso de 11 milímetros.Enxágüe as pinças com íons trocadas de água e limpe-as com papel de limpeza. Adicione um mililitro de íon trocado água a cada tubo de ensaio. Feche os tubos de ensaio com tampas de parafuso forradas ptfe e deixe-os ficar em pé por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente, para iludir completamente a cáção de amônio do filtro de fibra de vidro.Na sequência, abra a tampa do parafuso, adicione dois mililitros de um reagente de solução oxidante persulfeto previamente preparado ao tubo de ensaio e feche o tubo firmemente com uma tampa de parafuso, para evitar qualquer perda ou contaminação durante as etapas seguintes. Coloque os tubos de ensaio em um rack, enrole-os em papel alumínio em camada dupla e autoclave-os em uma posição vertical por uma hora a 121 graus Celsius. Misture 100 mililitros de 40 mililitros por litro tampão fosfato, e 100 mililitros de 30 mililitros por litro de glicose asepticamente.Adicione um estoque de glicerol de P.chlororaphis a 200 mililitros da solução de glicose tamponada fosfato, em um frasco de 300 mililitros Erlenmeyer. E purgar com um fluxo de hélio ultra puro por uma hora. Em seguida, dispense dois mililitros de uma suspensão denitrifier previamente preparada em frascos de cinco mililitros.Tampe cada frasco com uma rolha de borracha de butyl cinza, e um fechamento de alumínio. Substitua o ar do Headspace por hélio ultra puro, aspirando por três minutos e carregando o hélio por um minuto. Coloque a pressão positiva do gás Headspace em 1,3 atmosferas, para evitar contaminação de ar não intencional.Injete um mililitro de uma amostra ou padrão através da rolha de borracha butil, usando uma seringa descartável de um mililitro. Em seguida, incubar os frascos durante a noite a 25 graus Celsius, em condições escuras. No dia seguinte, injete 0,3 mililitros de seis mols por litro de hidróxido de sódio para parar a denitrificação e absorver o dióxido de carbono do Headspace, que de outra forma perturbará a análise de óxido nitroso.Porque dióxido de carbono e óxido nitroso têm o mesmo peso molecular. Determine as quantidades de óxido nitroso com um peso molecular de 44, 45 e 46, no gás Headspace usando quadrupole GC/MS com uma porta de injeção modificada. Os resultados representativos foram derivados de 15 experimentos de rastreamento de nitrogênio de sedimentos de pântanos de sal criados a partir do Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área lunar da cidade de Kesennuma e da província de Miyagi, no Japão.Observou-se aumento da concentração de amônio rotulado ao longo do período de incubação para todos os sedimentos coletados nas zonas subtidal e intertidacidade. As taxas de DNRA estavam dentro da faixa de 24,8 a 177. E são comparáveis aos valores relatados em estudos anteriores, mas superiores aos valores derivados de ambientes semelhantes.A alta taxa de DNRA pode ser explicada pelo pântano de sal sendo usado como um campo de cultivo antes do terremoto. Consistente com a especulação, a taxa de DNRA na zona intertidal, que é rica e orgânica em comparação com a zona subtidal, foi maior. Nosso protocolo é amplamente aplicável à análise de vias metabólicas, que envolve formação de amônio e adições de traços N15.

Research

JoVE Journal

Environment

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Otimizar Configurações de gases de combustão para promover o crescimento de microalgas em fotobiorreatores via simulações de computador

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Ambiente

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

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Medindo-carbono com base Contaminant Mineralização Usando Combinada CO<sub&gt; 2</sub&gt; fluxo e de radiocarbono Análises

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Medindo Taxas de Herbicida Metabolismo em Dicot Weeds com um ensaio extirpado Folha

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

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Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Avaliando o efeito de substâncias químicas ambientais em Honey Bee Desenvolvimento do indivíduo para Colony Nível

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

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Self-standing eletroquímica set-up para enriquecer o ânodo-proliferação de bactérias no local

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