Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Мы благодарим Наото Танака за помощь в сборе данных и разработке протокола. Сбор образцов был поддержан JSPS KAKENHI Грант номер 17K15286.

1. Подготовка конверта PTFE для количественного захвата газичный NH3
<ol><li>Поместите 60-мм кусок полиэтилена (PTFE) ленты (25 мм в ширину) на небольшой лист алюминиевой фольги (примерно 300 мм х 450 мм в размерах, протертый этанолом).</li>
	<li>Пепел фильтр стеклянного волокна (10 мм в диаметре с поры ...

Соотношение концентрации и изотопов NH4 дляанализа DNRA было количественно оценено с помощью нескольких методов. Коэффициенты концентраций и изотопов NH4,как правило, измеряются отдельно. Концентрация NH4 ,как правило, измеряется с помощью колоритных мет?...

Искусственный синтез азотных удобрений и их широкое применение сильно повлияли на глобальный азотный цикл. Подсчитано, что передача реактивного азота из наземных в прибрежные системы удвоилась с доиндустриальных времен1. Значительная часть удобрений, применяемых к данному полю, смывается из почвы в реки или грунтовые воды, в первую очередь в качестве No3и 2. Это может вызвать экологические проблемы, такие как загрязнение питьевой воды, эвтрофикация, и образование гипоксии. NO3- в водной среде удаляется из экосистемы или сохраняется в ней с помощью биологической ассимиляции и различных микробных диссимилятных процессов. Денитрификация и анаммокс, как известно, основные микробные процессы удаления no3. Денитрификация – это микробное сокращение NO3 до− газоистых продуктов N (NO, N2O и N2)в сочетании с окислением донора электронов, таких как органические вещества, тем самым снижая риск вышеупомянутых проблем. Anammox также производит N2 из NO2и NH4+; таким образом, он удаляет неорганические N из экосистемы. И наоборот, DNRA работает над сохранением N в экосистеме; общепризнано, что DNRA выполняется в первую очередь ферментативными бактериями или хемолитоавтотрофными бактериями и что они уменьшают диссимилятивные NO3- до биодоступных и менее мобильных NH4.
Исследования по DNRA в основном проводились в морских или лиманных экосистемах, таких как океанические или лиманные отложения и вода, соляная или солоноватая болотистая почва и мангровые почвы. Прибрежные или морские экосистемы имеют важное значение вкачестве водохранилищ для удаления− NO 3 - из наземных экосистем, и в предыдущих исследованиях DNRA было показано, что вклад в течение очень широкого диапазона No3− - удаление (0-99%)3,4,5,6,,7,,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 , 18.18 Кроме того, существование DNRA было продемонстрировано в широком диапазоне сред, включаяпресноводные среды 19,рисовыерисовые почвы 20,и лесныепочвы 21. Хотя эти исследования показали, что DNRA потенциально сопоставима с денитрификацией для удаления No3,− исследования, измеряя активность DNRA, по-прежнему очень ограничены по сравнению с теми, которые измеряют денитрификацию.
Скорость DNRA была оценена с использованием 15 методовN-маркировки в сочетании с анализом данных с помощью аналитических или численных моделей. Одно аналитическое решение для расчета ставки DNRA основано на увеличении 15N обогащения NH4 и+ пула после добавления 15NO3в качестве трассировщика. 15 Лет N-маркировка No3 добавляется− в образец и инкубируется, и скорость DNRA может быть рассчитана на основе изменений соотношенияконцентрации и изотопов+ в NH 4 до и после определенного периода времени. В настоящем документе подробно описан методколичественной оценки концентрации+ NH 4 и коэффициента изотопов, которые необходимы для расчета скорости DNRA. В основном, метод сообщил здесь представляет собой сочетание нескольких ранеесообщалось методы 22,23,24,25,26 с изменениями, добавленных к некоторым процедурам. Метод состоит из серии из пяти компонентных процедур: (1) инкубация образца окружающей среды с поправкой на стабильный изотопный трассировщик, 15NO3,(2) извлечение и восстановление NH4 -сиспользованием "процедуры диффузии" с модификациями, (3) окислениецинульфата+ NH 4 в образце, состоящий из коренных NH− − − + 4+ и 15NH4, полученных из 15NO3- через деятельность DNRA, в No3 и 15NO3, (4) последующей микробной трансформации No3 и 1 No3- до N2O изотопомеры с помощью модифицированного метода денитрификатора и (5) количественной оценкиизотопомеровN 2 O с использованием газовой хроматографии-масс-спектрометрии (GC/MS). В следующем разделе, во-первых, описана подготовка к процедурам (2) и (4), а затем, впоследствии, подробно описаны все пять компонентных процедур.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

Важность понимания судьбы нитратов (NO3),которыеявляются доминирующими видами N, перешел из наземных в водные экосистемы, возрастает, поскольку глобальные нагрузки азота резко возросли после индустриализации. Диссимиляция снижения нитратов до аммония (DNRA) и денитрификации являются микробными процессами, которые используют NO3для дыхания. По сравнению с денитрификацией количественные определения деятельности ДНР были проведены лишь в ограниченных масштабах. Это привело к недостаточному пониманию важности DNRA в No3- преобразования и регулирующие факторы этого процесса. Цель настоящего документа заключается в предоставлении подробной процедуры измерения потенциальной скорости DNRA в экологических пробах. Короче говоря, потенциальная ставка DNRA может быть рассчитана из 15N-маркированы аммония (15NH4)скорость накопления в 15No3- добавил инкубации. Определение концентраций 14NH4 и+ 15NH4, описанных в настоящем документе, состоит из следующих шагов. Во-первых, NH4в образце извлекается и в ловушке на подкисленные стеклянный фильтр, как соль аммония. Во-вторых, захваченный аммоний элализован и окисляется до NO3- через окисление персульфата. В-третьих, NO3преобразуется в N2O с помощью N2O редуктазы недостаточного денитрификации. Наконец, преобразованный N2O анализируется с помощью ранее разработанной четырехугольной газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Мы применили этот метод к соляным болотным отложениям и вычислили их потенциальные показатели DNRA, продемонстрировав, что предлагаемые процедуры позволяют просто и быстрее определить по сравнению с ранее описанными методами.

Репрезентативные результаты, представленные в настоящем документе, были получены в результате 15экспериментов по отслеживанию отложений соленого болота. Пробое соляного болота было недавно создано после Великого восточно-японского землетрясения 2011 года в рай?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Подробно представлен ряд методов определения потенциальной скорости DNRA+ на основе анализа 14NH4+и15NH4. NH4 преобразуется+ в N2O через несколько этапов и анализируется с помощью четырехугольной газовой хроматографии-масс-спектрометрии.

Измерение потенциальных показателей сокращения диссимиляций нитратов до аммония на основе 14NH4и/15NH4- Анализы с помощью последовательного преобразования в N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Прибрежные и морские экосистемы имеют важное значение в качестве водохранилищ для удаления нитратов из наземных экосистем. Нитрат в водной среде может потребляться несколькими процессами одновременно. Такие как денитрификация, анаммокс и ДНР.Хотя предыдущие исследования показали, что DNRA потенциально виновны в денитрификации, исследования измерения активности DNRA, как еще очень ограничено по сравнению с теми, измерения denitrification. В нашем протоколе мы предоставляем подробную процедуру измерения потенциальной скорости DNRA в экологических пробах. Мы считаем, что потенциальная ставка DNRA может быть рассчитана из N15 помечены накопление аммония с N15 помечены Нитрат дополнение.Преимущество нашего метода по сравнению с другими методами, заключается в том, что аммоний в конечном счете преобразуется в закись азота, которая имеет низкий атмосферный фон. Также неразумно измерять закись азота с помощью четырехугольного газового хроматографа. Что дешевле и легче в управлении, чем изотоп-коэффициент масс-спектрометра.Во-первых, поместите 60-миллиметровый кусок ленты PTFE на небольшой лист алюминиевой фольги. Пепел фильтр стеклянного волокна при 450 градусов по Цельсию в течение четырех часов в муфл печи. Затем поместите фильтр стеклянного волокна немного выше средней точки более длинной оси ленты.Далее, пятно 20 микролитров 0,9 молей на литр серной кислоты в центре фильтра стекловолокна, и сразу же сложить ленту PTFE с помощью плоской закончился штамп и прямой закончился пинцетом. Переверните ленту PTFE над фильтром из стекловолокна, затем запечатайте обе стороны ленты PTFE, сложив, а затем плотно прижимая край пинцетом. Используя пинцет, сложите открытый конец ленты PTFE и нажмите на край.Печать открытый конец ленты PTFE, плотно нажав на край с пинцетом, заботясь, чтобы не нажать фильтр стекловолокна. Перенесите 30 миллиграммов оксида магния в 20 миллилитров стеклянного флакона и поместите конверт PTFE во флакон. Перенесите пять миллилитров ранее подготовленного образца или стандарта во флакон, содержащий оксид магния и конверт PTFE.И немедленно закройте флакон серой бутиловой резиновой пробкой. Затем запечатай флакон алюминиевой крышкой. Встряхните флаконы при 150 об/мин в течение трех часов при четырех градусах цельсия в темных условиях.После этого снимите алюминиевую крышку и бутиловую резиновую пробку с каждого флакона. Удалите конверт PTFE с каждого флакона с помощью тока закончился пинцетом, и тщательно промыть конверт и пинцет с ионом обменялись водой. Затем протрите конверт и пинцет с вытирая бумагу, и поместите конверт на свежей вытирая бумагу.Откройте конверт PTFE с плоским закончился и указал закончился пинцетом в обратном порядке складывающихся шагов. Используя плоский конец пинцета, удерживайте периферическую область фильтра стекловолокна, где серная кислота должна быть неабсорбирована. И перенесите его в 11-миллиметровую пробирку.Промыть пинцетом с ионой обменянные воды и протрите их вытирая бумагу. Добавьте один миллилитр ионные воды в каждую пробирку. Закройте пробирки с PTFE выстроились винт шапки, и позволяют им стоять, по крайней мере 30 минут при комнатной температуре, чтобы полностью ускользнуть от аммония катиона из фильтра стекловолокна.После этого откройте крышку винта, добавьте два миллилитров ранее подготовленного персульфата окислительного раствора реагента в пробирку, и плотно закройте трубку винтовой крышкой, чтобы предотвратить любые потери или загрязнения во время следующих шагов. Стенд пробирки на стойке, оберните их в двухслойной алюминиевой фольги, и автоклав их в вертикальном положении в течение одного часа при 121 градусов по Цельсию. Смешайте 100 миллилитров стерильных 40 миллимолей на литр фосфатного буфера и 100 миллилитров стерильных 30 миллимолей на литр глюкозы асептически.Добавьте запас глицерола P.chlororaphis в 200 миллилитров фосфатного буферного раствора глюкозы в колбе 300 миллилитров Erlenmeyer. И очистить с ультра чистый поток гелия в течение одного часа. Затем раздай два миллилитров предварительно подготовленной подвески денитрификатора на пять миллилитровых флаконов.Крышка каждого флакона с серой бутиловой резиновой пробкой и алюминиевым замыканием. Замените воздух Headspace ультра чистым гелием, пылесосив в течение трех минут и заряжая гелий в течение одной минуты. Установите положительное давление газа Headspace до 1,3 атмосферы, чтобы избежать непреднамеренного загрязнения воздуха.Ввимите один миллилитр образца или стандарта через пробку бутиловой резины, используя одноразовый шприц с одним миллилитром. Затем инкубировать флаконы на ночь при 25 градусах по Цельсию, в темных условиях. На следующий день ввините 0,3 миллилитров шести родинок на литр гидроксида натрия, чтобы остановить денитрификацию и поглотить углекислый газ Headspace, который в противном случае будет нарушать анализ закиси азота.Потому что углекислый газ и закись азота имеют одинаковый молекулярный вес. Определите количество закиси азота с молекулярным весом 44, 45 и 46 в Газе Headspace с помощью четырехугольного GC/MS с модифицированным портом впрыска. Репрезентативные результаты были получены в результате 15 экспериментов по отслеживанию азота соляных болотных отложений, созданных в результате Великого восточно-японского землетрясения 2011 года в районе Луны города Кесеннума и префектуры Мияги, Япония.Увеличение концентрации аммония на протяжении инкубационного периода наблюдалось во всех отложениях, собранных в подтидальных и межтидальных зонах. Тарифы DNRA находились в пределах от 24,8 до 177. И сопоставимы с значениями, зарегистрированными в предыдущих исследованиях, но выше значений, полученных из аналогичных сред.Высокий уровень DNRA, может быть объяснено солончак используется в качестве поля выращивания до землетрясения. В соответствии с спекуляциями, скорость DNRA в межтидальной зоне, которая является богатым и органических соединений по сравнению с субтидальной зоны, был выше. Наш протокол широко применим к анализу метаболических путей, который включает в себя образование аммония и N15 следов дополнений.

Research

JoVE Journal

Environment

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Оптимизация дымовых Настройки Газовые поощрять микроводорослей рост в фотобиореакторы через компьютерных вычислений

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Высокая пропускная Флуорометрический Измерение Потенциал почвы внеклеточных активности ферментов

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Измерение углерода на основе Загрязняющие Минерализация Использование Совмещенный CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux и Радиоуглеродный анализ

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Измерение Курсы гербицида обмена веществ в двудольных сорняков с Пробирной вырезали Leaf

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

Оценка лабильного органического углерода в почве Использование процедур последовательного Фумигация инкубационного

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Оценка Влияние окружающей среды химических веществ на Honey Bee развития от личности до уровня колонии

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Самостоятельный электрохимических Set-up обогатить анод дышащие бактерий на месте

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Интенсивности осадков денитрификация с использованием ядер и N2O микросенсоры

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Состав и распределение анализ биоаэрозоли в различных экологических условиях

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...