Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
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Agradecemos a Naoto Tanaka por ayudar a la recopilación de datos y el desarrollo del protocolo. La colección de muestras fue compatible con JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

1. Preparación de una envolvente de PTFE para capturar cuantitativamente los gases NH3
<ol><li>Coloque una pieza de 60 mm de cinta de politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de ancho) en una pequeña lámina de aluminio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamaño, limpiada con etanol).</li>
	<li>Ceniza de un filtro de fibra de vidrio (10 mm de diámetro con un tamaño de poro de 2,7 m) a 450 oC durante 4 h en un horno de mufla. Coloque el filtro de fibra de vidrio un poco por encima del punto medio del eje má...

La concentración y la relación de isótopos de NH4+ para el análisis DNRA se cuantificaron utilizando varios métodos. Las concentraciones y las relaciones de isótopos de NH4+ generalmente se miden por separado. La concentración de NH4+ se mide típicamente utilizando métodos colorimétricos incluyendo un autoanalyzer4,10,15,16</...

La síntesis artificial de fertilizantes nitrogenados y su aplicación generalizada han perturbado enormemente el ciclo global del nitrógeno. Se estima que la transferencia de nitrógeno reactivo de los sistemas terrestres a los costeros se ha duplicado desde tiempos preindustriales1. Una porción significativa de los fertilizantes aplicados a un campo determinado se lava lejos del suelo a los ríos o aguas subterráneas, principalmente como NO3a 2. Esto puede causar problemas ambientales como la contaminación del agua potable, la eutrofización y la formación de hipoxia. NO3en ambientes de agua se elimina o se retiene en el ecosistema a través de la asimilación biológica y varios procesos de disimilación microbiana. Se sabe que la desnitrificación y el anammox son los principales procesos de eliminación microbiana para NO3.− La desnitrificación es la reducción microbiana de NO3a los productos N gaseosos (NO, N2O y N2)junto con la oxidación de un donante de electrones, como las sustancias orgánicas, reduciendo así el riesgo de los problemas antes mencionados. Anammox también produce N2 a partir de NO2o− y NH4+; por lo tanto, elimina N inorgánico de un ecosistema. Por el contrario, DNRA trabaja para retener N en un ecosistema; generalmente se acepta que DNRA se realiza principalmente por bacterias fermentativas o bacterias quimiolitoautotróficas y que reducen el disimilario NO3a BIOdisponible y menos móvil NH4+.
Los estudios sobre DNRA se han realizado principalmente en ecosistemas marinos o estuarinas, como sedimentos oceánicos o estuarinas y agua, tierra de marisma sal o salobre, y suelo de manglar. Los ecosistemas costeros o marinos son importantes como reservorios para eliminar NO3de los ecosistemas terrestres, y en estudios anteriores se ha demostrado que DNRA contribuye en una gama muy amplia deeliminación de NO3(0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,,15,16,17,18.14 Además, la existencia de DNRA se ha demostrado en una amplia gama de ambientes, incluyendo ambientes de agua dulce19,suelos de arroz20,y suelos forestales21. Si bien estos estudios han demostrado que DNRA es potencialmente comparable a la desnitrificación para laeliminación de NO3,los estudios que miden la actividad de DNRA son todavía muy limitados en comparación con los que miden la desnitrificación.
La tasa DNRA se ha evaluado utilizando 15técnicas de etiquetado N junto con el análisis de datos a través de modelos analíticos o numéricos. Una solución analítica para calcular la tasa DNRA se basa en el aumento en el enriquecimiento de 15N de la piscina NH4+ después de la adición de 15NO3como trazador. 15 Se añade N-etiqueta no3− a una muestra e incubada, y la tasa de DNRA se puede calcular a partir de los cambios en la concentración y la relación de isótopos en NH4+ antes y después de un cierto período de tiempo. En este artículo, se describe en detalle un método para cuantificar la concentración NH4+ y la relación de isótopos, que se requieren para calcular la tasa DNRA. Básicamente, el método reportado aquí es una combinación de varias técnicas previamente reportadas22,23,24,25,26 con modificaciones añadidas a algunos procedimientos. El método se compone de una serie de cinco procedimientos componentes: (1) incubación de una muestra ambiental con la modificación de un trazador de isótopos estable, 15NO3o,−(2) extracción y recuperación de NH4+ utilizando un "procedimiento de difusión" con modificaciones, (3) oxidación de persulfato de NH4+ en la muestra, que consiste en los indígenas NH4+ y 15NH4+ derivados de 15NO3a través de la actividad DNRA, en NO3o− y 15NO3o,−(4) transformación microbiana posterior de NO3o− y 15isótopómeros NO3a N2O mediante el método desnitrificador modificado y (5) cuantificación de los isótopómeros N2O utilizando cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC/MS). En la siguiente sección, en primer lugar, se describe la preparación para los procedimientos (2) y (4) y, posteriormente, se describen detalladamente los cinco procedimientos de componentes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

La importancia de entender el destino del nitrato (NO3o),−que es la especie N dominante transferida de los ecosistemas terrestres a los acuáticos, ha ido aumentando porque las cargas mundiales de nitrógeno han aumentado drásticamente tras la industrialización. La reducción disimilizante de nitratos a amonio (DNRA) y la desnitrificación son procesos microbianos que utilizan NO3para la respiración. En comparación con la desnitrificación, las determinaciones cuantitativas de la actividad de la DNRA se han llevado a cabo sólo en una medida limitada. Esto ha llevado a una comprensión insuficiente de la importancia de DNRA enlas transformaciones NO3y los factores reguladores de este proceso. El objetivo de este documento es proporcionar un procedimiento detallado para la medición de la tasa potencial de DNRA en muestras ambientales. En resumen, la tasa potencial de DNRA se puede calcular a partir de la tasa de acumulación de amonio con etiqueta N de 15(15NH4+) en 15NO3- incubación añadida. La determinación de las 14concentraciones NH4+ y 15NH4+ descritas en este documento se compone de los siguientes pasos. En primer lugar, el NH4+ en la muestra se extrae y se atrapa en un filtro de vidrio acidificado como sal de amonio. En segundo lugar, el amonio atrapado se elue y se oxida a NO3a travésde la oxidación del persulfato. En tercer lugar, el NO3se convierte en N2O a través de un denitrificador de deficiencia de N2O reductasa. Finalmente, el N2O convertido se analiza utilizando un sistema de cromatografía de gases de cuadrúpedo-espectrometría de masas previamente desarrollado. Aplicamos este método a los sedimentos de marismas y calculamos sus tasas potenciales de DNRA, demostrando que los procedimientos propuestos permiten una determinación simple y más rápida en comparación con los métodos descritos anteriormente.

Los resultados representativos presentados en este documento se derivaron de 15experimentos de rastro de N de sedimentos de marismas. La marisma muestreada fue creada recientemente después del Gran Terremoto del Este de Japón de 2011 en el área de Moune de la ciudad de Kesen-numa en la prefectura de Miyagi, Japón. En septiembre de 2017, se recogieron sedimentos superficiales (0-3 cm) en dos emplazamientos en las zonas submareales e intermareales. Primero, inmediatamente des...

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Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Se proporciona en detalle una serie de métodos para determinar la tasa potencial de DNRA basada en 14análisis NH4+/15NH4+. NH4+ se convierte en N2O a través de varios pasos y se analiza utilizando cromatografía de gases cuadrúpedos-espectrometría de masas.

Medición de las tasas potenciales de reducción de nitrato disimilado a amonio basada en 14NH4+/15NH4+ Análisis a través de la conversión secuencial a N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Los ecosistemas costeros y marinos son importantes como reservorios, para eliminar el nitrato de los ecosistemas terrestres. El nitrato en el medio acuático puede ser consumido por varios procesos simultáneamente. Como la desnitrificación, anammox y DNRA.Mientras que estudios anteriores han demostrado que DNRA es potencialmente culpable de la desnitrificación, estudios que miden la actividad de DNRA como todavía muy limitado en comparación con los que miden la desnitrificación. En nuestro protocolo, proporcionamos un procedimiento detallado para la medición de la tasa potencial de DNRA en muestras ambientales. Creemos que la tasa potencial de DNRA se puede calcular a partir de la acumulación de amonio etiquetada N15 con N15 etiquetado adición de nitrato.La ventaja de nuestro método en comparación con otros métodos, es que el amonio se convierte en última instancia en óxido nitroso, que tiene un bajo fondo atmosférico. Tampoco es prudente que medimos el óxido nitroso a través del espectrómetro de masas de cromatografía de gases cuadrúpedo. Que es menos costoso y fácil de manejar que un espectrómetro de masas de relación isótopo.En primer lugar, coloque una pieza de 60 milímetros de cinta de PTFE en una pequeña hoja de papel de aluminio. Ceniza un filtro de fibra de vidrio a 450 grados Celsius durante cuatro horas en un horno de mufla. A continuación, coloque el filtro de fibra de vidrio un poco por encima del punto medio del eje más largo de la cinta.A continuación, detecte 20 microlitros de 0,9 moles por litro de ácido sulfúrico en el centro del filtro de fibra de vidrio, y doble inmediatamente la cinta de PTFE utilizando sello plano y pinzas rectas. Voltee la cinta de PTFE sobre el filtro de fibra de vidrio, luego selle ambos lados de la cinta de PTFE doblando y luego presionando firmemente el borde con las pinzas. Con las pinzas, doble el extremo abierto de la cinta de PTFE y presione el borde.Selle el extremo abierto de la cinta de PTFE presionando firmemente el borde con las pinzas, teniendo cuidado de no presionar el filtro de fibra de vidrio. Transfiera 30 miligramos de óxido de magnesio cenizado a un vial de vidrio de 20 mililitros y coloque el sobre de PTFE en el vial. Transfiera cinco mililitros de una muestra o estándar previamente preparado al vial que contiene el óxido de magnesio y la envolvente de PTFE.Y cierre inmediatamente el vial con un tapón de goma de butilo gris. A continuación, selle el vial con una tapa de aluminio. Agitar los viales a 150 RPM durante tres horas a cuatro grados centígrados en condiciones oscuras.Después de esto, retire la tapa de aluminio y el tapón de goma de butilo de cada vial. Retire el sobre de PTFE de cada vial con pinzas de punto terminado, y enjuague bien el sobre y las pinzas con agua intercambiada por iones. Luego, limpie el sobre y las pinzas con papel de limpieza, y coloque el sobre en papel de limpieza fresco.Abra el sobre de PTFE con pinzas planas y puntiagudas en orden inverso de los escalones de plegado. Usando pinzas planas, sostenga el área periférica del filtro de fibra de vidrio, donde se supone que el ácido sulfúrico no se absorbe. Y transfiéralo a un tubo de prueba de tapa de tornillo de 11 milímetros.Enjuague las pinzas con agua intercambiada de iones y límpielas con papel de limpieza. Agregue un mililitro de agua intercambiada por iones a cada tubo de ensayo. Cierre los tubos de ensayo con tapones de tornillo forrados con PTFE y déjales reposar durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente, para eludir completamente el catión de amonio del filtro de fibra de vidrio.Después de esto, abra la tapa del tornillo, agregue dos mililitros de un reactivo de solución oxidante de persulfato previamente preparado al tubo de ensayo, y cierre el tubo firmemente con una tapa de tornillo, para evitar cualquier pérdida o contaminación durante los siguientes pasos. Coloque los tubos de ensayo en un bastidor, envuélvalos en papel de aluminio de doble capa y autoclavelos en posición vertical durante una hora a 121 grados centígrados. Mezclar 100 mililitros de 40 milimolemols estériles por litro de tampón de fosfato, y 100 mililitros de glucosa estéril de 30 milimolemols por litro de glucosa asépticamente.Añadir un stock de glicerol de P.chlororaphis a 200 mililitros de la solución de glucosa tamponada de fosfato, en un matraz Erlenmeyer de 300 mililitros. Y purga con un flujo de helio ultra puro durante una hora. A continuación, dispensar dos mililitros de una suspensión de desnitrificador previamente preparada en viales de cinco mililitros.Tapa cada vial con un tapón de goma de butilo gris, y un cierre de aluminio. Sustituya el aire Headspace por helio ultra puro, aspirando durante tres minutos y cargando el helio durante un minuto. Ajuste la presión positiva del gas Headspace a 1,3 atmósferas, para evitar la contaminación involuntaria del aire.Inyecte un mililitro de una muestra o estándar a través del tapón de goma de butilo, utilizando una jeringa desechable de un mililitro. Luego, incubar los viales durante la noche a 25 grados centígrados, en condiciones oscuras. Al día siguiente, inyectar 0,3 mililitros de seis moles por litro de hidróxido de sodio para detener la desnitrificación y absorber el dióxido de carbono Headspace, que de lo contrario perturbará el análisis de óxido nitroso.Porque el dióxido de carbono y el óxido nitroso tienen el mismo peso molecular. Determinar las cantidades de óxido nitroso con un peso molecular de 44, 45 y 46, en el gas Headspace utilizando cuadrúpedo GC/MS con un puerto de inyección modificado. Los resultados representativos se derivaron de 15 experimentos de rastreo de nitrógeno de sedimentos de marismas de sal creados a partir del Gran Terremoto del Este de Japón de 2011 en el área lunar de la ciudad de Kesennuma y la prefectura de Miyagi, Japón.Se observó un aumento de la concentración de amonio etiquetado durante todo el período de incubación de todos los sedimentos recogidos en las zonas submareales e intermareales. Las tasas de DNRA estaban dentro del rango de 24,8 a 177. Y son comparables a los valores reportados en estudios anteriores, pero más altos que los valores derivados de entornos similares.La alta tasa de DNRA, puede explicarse por la marisma que se utiliza como campo de cultivo antes del terremoto. De acuerdo con la especulación, la tasa de DNRA en la zona intermareal, que es rica y compuestos orgánicos en comparación con la zona submareal, fue mayor. Nuestro protocolo es ampliamente aplicable al análisis de vías metabólicas, que implica la formación de amonio y adiciones de trazas N15.

Research

JoVE Journal

Environment

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimizar la combustión Gas Ciudad para promover el crecimiento de microalgas en fotobiorreactores a través de Simulaciones computacionales

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Investigación

Medio ambiente

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

De Alto Rendimiento Fluorometric Medición de Potencial del Suelo extracelulares enzimáticos Actividades

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

La medición de contaminantes mineralización de base de carbono utilizando combinada CO<sub&gt; 2</sub&gt; flujo y análisis de radiocarbono

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

Evaluación de la lábil de carbono orgánico en el suelo Uso de procedimientos de incubación secuencial Fumigación

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

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The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

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Preparación electroquímica autónomo para enriquecer bacterias respirando de ánodo en el sitio

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Estimación de las tasas de desnitrificación sedimento usando corazones y N2O microsensores

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