Name: measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o
Uploaded: 2020-10-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Vi tackar Naoto Tanaka för att ha hjälpt till att datainsamling och utveckla protokollet. Insamlingen av prover stöddes av JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

1. Beredning av ett PTFE-kuvert för kvantitativt fångande av gasformiga NH3
<ol><li>Placera en 60-mm bit polytetrafluoreten (PTFE) tejp (25 mm i bredd) på ett litet ark aluminiumfolie (cirka 300 mm x 450 mm i storlek, torkas av med etanol).</li>
	<li>Aska ett glasfiberfilter (10 mm i diameter med en porstorlek på 2,7 μm) vid 450 °C i 4 h i en muffleugn. Placera glasfiberfiltret lite ovanför mittpunkten på tejpens längre axel (Bild 1a).</li>
	<li>Spot 20 μL av 0,9-mol/L...

Koncentrationen och isotopförhållandet av NH4+ för DNRA-analysen kvantifierades med hjälp av flera metoder. Koncentrationerna och isotopkvoterna på NH4+ mäts i allmänhet separat. Koncentrationen NH4+ mäts typiskt med hjälp av koloromiska metoder inklusive en autoanalyzer4,10,15,16,17. I...

Den artificiella syntesen av kvävegödselmedel och dess utbredda tillämpning har kraftigt stört den globala kvävecykeln. Man uppskattar att överföringen av reaktivt kväve från land- till kustsystem har fördubblats sedan förindustriella tider1. En betydande del av gödselmedel som tillämpas på ett visst fält tvättas bort från jorden till floder eller grundvatten, främst som NO3− 2. Detta kan orsaka miljöproblem såsom dricksvattenföroreningar, övergödning, och bildandet av hypoxi. NO3− i vattenmiljöer avlägsnas från eller behålls i ekosystemet via biologisk assimilering och olika mikrobiella dissimilatoriska processer. Denitrification och anammox är kända för att vara stora mikrobiella borttagningsprocesser för NO3−. Denitrifikation är den mikrobiella reduktionen på NO3− till gasformiga N-produkter (NO, N2O, och N2) i kombination med oxidation av en elektrondonator, såsom organiska ämnen, och därigenom minska risken för de ovan nämnda problemen. Anammox producerar också N2 från NO2− och NH4+; därför tar den bort oorganiskt N från ett ekosystem. Omvänt arbetar DNRA för att behålla N i ett ekosystem; det är allmänt accepterat att DNRA utförs främst av fermentativa bakterier eller kemolithoautotrofa bakterier och att de minskar dissimilatoriska NO3− till biotillgängliga och mindre rörliga NH4+.
Studier på DNRA har främst utförts i marina eller flodmynningsekosystem, såsom oceaniska eller flodmynningssediment och vatten, salt eller bräckt kärr jord, och mangrove jord. Kust- eller havsekosystem är viktiga som reservoarer för att avlägsnaNO 3− från terrestra ekosystem, och i tidigare studier har DNRA visats bidra över ett mycket brett spektrum av NO3− borttagning (0–99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Vidare har förekomsten av DNRA visats i ett brett spektrum av miljöer inklusive sötvatten miljöer19, ris paddy jordar20, och skogsjordar21. Medan dessa studier har visat att DNRA är potentiellt jämförbart med denitrifikation för NO3− borttagning, är studier som mäter DNRA-aktiviteten fortfarande mycket begränsade jämfört med dem som mäter denitrifikation.
DNRA-frekvensen har utvärderats med hjälp av 15N-märkningstekniker i samband med dataanalys via analytiska eller numeriska modeller. En analytisk lösning för att beräkna DNRA-räntan baseras på ökningen av 15N-anrikningen av NH4+ poolen efter tillsats av 15NO3− som spårämne. 15 år N-märkt NO3− läggs till ett prov och inkuberas, och DNRA-satsen kan sedan beräknas utifrån koncentrations- och isotopkvotens förändringar i NH4+ före och efter en viss tidsperiod. I detta dokument beskrivs en metod för att kvantifiera NH4+ -koncentrationen och isotopförhållandet, som krävs för att beräkna DNRA-satsen, i detalj. I grund och botten, den metod som rapporteras här är en kombination av flera tidigare rapporteradetekniker 22,23,24,25,26 med ändringar läggas till vissa förfaranden. Metoden består av en serie av fem komponentförfaranden: (1) inkubering av ett miljöprov med ändring av en stabil isotopspårare, 15NO3−, (2) utvinning och återvinning av NH4+ med hjälp av ett "diffusionsförfarande" med ändringar, (3) persulfat oxidation av NH4+ i provet, bestående av inhemska NH4+och 15NH4+ som härrör från 15NO3− via DNRA-aktivitet, till NO3− och 15NO3−, (4) efterföljande mikrobiell omvandling av NO3− och 1 15NO3− till N2O isotopomerer via den modifierade denitrifiermetoden, och (5) kvantifiering av N2O-isotopomerna med hjälp av gaskromatografi–masspektrometri (GC/MS). I följande avsnitt beskrivs först förberedelserna för förfarandena (2) och (4) och därefter beskrivs därefter alla fem komponentförfarandena i detalj.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15N-KNO3</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-NH4Cl</td>
			<td>SHOKO SCIENCE</td>
			<td>N15-0034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL PP bottle</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>61-3210-18</td>
			<td>Wide-mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum cap</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1307-13</td>
			<td>No. 20, with hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>021-02195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>Himac CR21G II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxygenized Gas Pressure &#38; Replace Injector</td>
			<td>SANSIN INDUSTRIAL</td>
			<td>IP-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cellulose acetate membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>Pore size 0.22 &#181;m, 25 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-10SZ</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe</td>
			<td>Termo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (-)</td>
			<td>NISSUI PHARMACEUTICAL</td>
			<td>5913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe</td>
			<td>VICI Valco Instruments</td>
			<td>4075-15010</td>
			<td>Series A-2, 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC/MS</td>
			<td>shimadzu</td>
			<td>GCMS-QP2010ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF/D</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1823-010</td>
			<td>10 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>0501-06</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gray butyl rubber stopper</td>
			<td>Maruemu</td>
			<td>1306-03</td>
			<td>No.20-S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-04696</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2S2O8</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11891</td>
			<td>Nitrogen and Phosphorus analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04035</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-08625</td>
			<td>Nitrogen compounds analysis grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>017-02995</td>
			<td>Guaranteed Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tube</td>
			<td>ASONE</td>
			<td>1-3500-22</td>
			<td>50 mL, VIO-50BN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>ATCC 13985</td>
			<td>Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sealing tape</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z221880</td>
			<td>25 mm in width</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocating shaker</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000207-000</td>
			<td>NR-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0252</td>
			<td>11 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE-lined cap for test tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>84-0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Difco Laboratories</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of the potential rates of dissimilatory nitrate reduction to ammonium based on 14nh4+/15nh4+ analyses via sequential conversion to n2o

Vikten av att förstå nitrats öde (NO3−), som är den dominerande N-arten som överförs från terrestra till akvatiska ekosystem, har ökat eftersom de globala kvävebelastningarna har ökat dramatiskt efter industrialiseringen. Dissimilerande nitratreduktion till ammonium (DNRA) och denitrifikation är båda mikrobiella processer som använder NO3− för respiration. Jämfört med denitrifikationen har kvantitativa bestämningar av DNRA-verksamheten endast genomförts i begränsad omfattning. Detta har lett till en otillräcklig förståelse för DNRA:s betydelse i NO3− transformationer och de reglerande faktorerna i denna process. Målet med detta dokument är att tillhandahålla ett detaljerat förfarande för mätning av den potentiella DNRA-satsen i miljöprover. I korthet kan den potentiella DNRA-takten beräknas från den 15N-märkta ammonium (15NH4+) ackumulationshastighet i 15NO3− tillsatt inkubation. Fastställandet av de 14NH4+ och 15NH4+ koncentrationer som beskrivs i detta dokument består av följande steg. Först extraheras NH4+ i provet och fastnar på ett surt glasfilter som ammoniumsalt. För det andra eluteras och oxideras den fångade ammonium till NO3− via persulfatoxidation. För det tredje omvandlas NO3− till N2O via en N2O-reduktas-bristfällig denitrifier. Slutligen analyseras den konverterade N2O med hjälp av en tidigare utvecklad quadrupole gaskromatografi–masspektrometri system. Vi tillämpade denna metod på saltkärrsediment och beräknade deras potentiella DNRA-satser, vilket visar att de föreslagna förfarandena möjliggör en enkel och snabbare bestämning jämfört med tidigare beskrivna metoder.

De representativa resultat som presenteras i detta dokument härstammar från 15N-tracing experiment av salt kärr sediment. Den provade saltkärret var nyskapat i efterdyningarna av 2011 Great East Japan Jordbävning i Moune området Kesen-numa stad i Miyagi prefektur, Japan. I september 2017 samlades ytsediment (0–3 cm) upp på två platser i deltidal- och intertidalzonerna. Först, omedelbart efter insamlingen, var sedimentet siktas genom en 4-mm maska för att ta bort vä...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O at JoVE.com

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

En serie metoder för att fastställa den potentiella DNRA-frekvensen baserat på 14NH4+/15NH4+ analyser tillhandahålls i detalj. NH4+ omvandlas till N2O via flera steg och analyseras med hjälp av quadrupole gaskromatografi–masspektrometri.

Mätning av de Dissimilatory Nitratminskningens potentiella frekvenser till ammonium Baserat på 14NH4+/15NH4+ Analyser via Sekventiell omvandling till N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Kustnära och de marina ekosystemen är viktiga som reservoarer, för att avlägsna nitrat från terrestra ekosystem. Nitrat i vattenmiljö kan konsumeras av flera processer samtidigt. Såsom denitrifikation, anammox och DNRA.Medan tidigare studier har visat att DNRA är potentiellt skyldig till denitrifikation, studier som mäter DNRA verksamhet som fortfarande mycket begränsad jämfört med dem som mäter denitrifikation. I vårt protokoll tillhandahåller vi ett detaljerat förfarande för mätning av den potentiella DNRA-takten i miljöprover. Vi tror att potentiella DNRA ränta kan beräknas från N15 märkt Ammonium ackumulering med N15 märkt Nitrat tillägg.Fördelen med vår metod jämfört med andra metoder, är att Ammonium slutligen omvandlas till Lustgas, som har en låg atmosfärisk bakgrund. Det är inte heller klokt att vi mätte Lustgas via quadrupole gaskromatografi masspektrometer. Vilket är billigare och lätt att hantera än en isotop-ratio masspektrometer.Först, placera en 60 millimeter bit PTFE tejp på ett litet ark aluminiumfolie. Aska ett glasfiberfilter på 450 grader Celsius i fyra timmar i en muffleugn. Placera sedan glasfiberfiltret lite ovanför mittpunkten på tejpens längre axel.Därefter plats 20 mikroliter av 0,9 mol per liter svavelsyra på mitten av glasfiberfilter, och omedelbart vika PTFE-tejp med hjälp av platt slutade stämpel och raka slutade pincett. Vänd PTFE-tejpen över glasfiberfiltret, sedan försegla båda sidor av PTFE-tejpen genom att vika och sedan tätt trycka på kanten med pincett. Använd pincetten, vik ptfe-bandets öppna ände och tryck på kanten.Täta PTFE-tejpens öppna ände genom att tätt trycka på kanten med pincetten, var noga med att inte trycka på glasfiberfiltret. Överför 30 milligram askad Magnesiumoxid, till en 20 milliliter glasflaska, och placera PTFE kuvertet i injektionsflaskan. Överför fem milliliter av ett tidigare berett prov eller standard i injektionsflaskan som innehåller Magnesiumoxiden och PTFE-kuvertet.Och stäng omedelbart injektionsflaskan med en grå butylgummipropp. Sedan, försegla injektionsflaskan med en aluminiumlock. Skaka injektionsflaskan vid 150 RPM i tre timmar vid fyra grader Celsius under mörka förhållanden.Efter detta, ta bort aluminiumlocket och butylgummiproppen från varje injektionsflaska. Ta ut PTFE-kuvertet från varje injektionsflaska med hjälp av punktsluten pincett, och skölj kuvertet och pincetten med jonbyts vatten. Torka sedan av kuvertet och pincetten med att torka av papper och placera kuvertet på färskt torka papper.Öppna PTFE kuvertet med platta slutade och spetsiga slutade pincett i omvänd ordning på den fällbara stegen. Använda platta slutade pincett, håll det perifera området av glasfiberfiltret, där svavelsyran är tänkt att vara unabsorbed. Och överför den till ett 11 millimeters skruvlock provrör.Skölj pincetten med jonbyts vatten och torka dem med torka papper. Tillsätt en milliliter jonbyts vatten till varje provrör. Stäng provrören med PTFE-fodrade skruvlock, och låt dem stå i minst 30 minuter vid rumstemperatur, för att helt undkomma ammoniumjonkenan från glasfiberfiltret.Efter detta, öppna skruvlocket, tillsätt två milliliter av en tidigare beredd persullfat oxiderande lösning reagens till provröret, och stäng röret tätt med ett skruvlock, för att förhindra förlust eller kontaminering under följande steg. Stå provrören på ett rack, linda in dem i dubbel lager aluminiumfolie, och autoklav dem i upprätt läge i en timme vid 121 grader Celsius. Blanda 100 milliliter sterila 40 millimol per liters fosfatbuffert, och 100 milliliter sterila 30 millimol per liter glukos aseptiskt.Tillsätt ett glycerollager av P.chlororaphis till 200 milliliter av fosfatbuffrad glukoslösning, i en 300 milliliter Erlenmeyerkolv. Och rensa med en ultra ren heliumström i en timme. Därefter dispensera två milliliter av en tidigare beredd denitrifier suspension i fem milliliter injektionsflaska.Cap varje injektionsflaska med en grå butylgummi propp, och en aluminium stängning. Byt ut Headspace-luften mot ultra pure helium, genom att dammsuga i tre minuter och ladda heliumet i en minut. Ställ in Headspace gas positivt tryck till 1,3 atmosfärer, för att undvika oavsiktlig luftförorening.Injicera en milliliter av ett prov eller standard genom butylgummiproppen, med en engångsspruta på en milliliter. Sedan, ruva injektionsflaskan över natten vid 25 grader Celsius, under mörka förhållanden. På följande dag injicerar du 0,3 milliliter av sex mol per liter natriumhydroxid för att stoppa denitrifikationen och absorbera Headspace koldioxid, som annars kommer att störa lustgasanalysen.Eftersom koldioxid och lustgas har samma molekylvikt. Bestäm mängder lustgas med en molekylvikt på 44, 45 och 46, i Headspace-gasen med hjälp av quadrupole GC/MS med en modifierad injektionsport. De representativa resultaten härleddes från 15 kvävespårningsexperiment av saltkärrsediment som skapades från 2011 Års stora östliga Japan jordbävning i månområdet i Kesennuma stad och Miyagi prefektur, Japan.En ökning av den märkta ammoniumkoncentrationen under hela inkubationstiden observerades för alla sediment som samlats i de subtidala och tidvattenszonerna. DNRA-räntorna låg inom intervallet 24,8 till 177. Och är jämförbara med värden som rapporterats i tidigare studier, men högre än värden som härrör från liknande miljöer.Den höga DNRA-hastigheten, kan förklaras av att saltkärret används som odlingsfält före jordbävningen. I enlighet med spekulationerna var DNRA-frekvensen i tidvattenzonen, som är rik och organiska föreningar jämfört med subtidalzonen, högre. Vårt protokoll är allmänt tillämpligt på analys av metaboliska vägar, vilket innebär ammoniumbildning och N15 spår tillägg.

Research

JoVE Journal

Environment

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimera Rökgas inställningar för att främja Mikroalger Tillväxten i Photobioreactors via datorsimuleringar

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Hög kapacitet Fluorometrisk Mätning av Potential Soil Extracellulär Enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Metoder för att underlätta mikrobiell tillväxt på Pulp Mill avfallsflödena och karakterisering av Bionedbrytning Potential för Odlade Mikrober

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Measuring Carbon-based Contaminant Mineralization Using Combined CO2 Flux and Radiocarbon Analyses

Mätning kolbaserade miljögifts Mineralisering använder kombinerade CO<sub&gt; 2</sub&gt; Flux och Radiocarbon Analyser

A method is described which uses the absence of radiocarbon in industrial chemicals and fuels made from petroleum feedstocks which frequently contaminate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Mätning priser av herbicid Metabolism i Dicot Ogräs med en utskuren Leaf analys

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

Bedömning av labila organiskt kol i jorden med Sekventiell Bränning inkubation procedurer

Management practices and environmental changes can alter soil nutrient and carbon cycling. Soil labile organic carbon, a readily decomposable C pool, is ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Utvärdera effekten av kemikalier i miljön på Honey Bee utveckling från individen till Colony nivå

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Fristående elektrokemiska uppställning att berika anod-respiring bakterier på plats

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Estimating Sediment Denitrification Rates Using Cores and N2O Microsensors

Uppskatta Sediment denitrifikation priser med kärnor och N2O mikrosensorer

Denitrification is the primary biogeochemical process removing reactive nitrogen from the biosphere. The quantitative evaluation of this process has ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Sammansättning och Distribution analys av bioaerosoler Under olika miljöförhållanden

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...