Name: a precise pathogen delivery and recovery system for murine models of secondary bacterial pneumonia
Uploaded: 2019-09-21T13:00:00
Duration: 13 s
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Les auteurs remercient Nicole Meissner, M.D./Ph.D., Montana State University, pour son aide dans l'établissement de la méthode d'instillation intratrachéale. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health des États-Unis (Grants NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), ainsi que des fonds de la Montana University System Research Initiative (51040-MUSRI2015-03) et de l'Université d'État du Montana. Station d'expérimentation agricole.

Toutes les méthodes sont conformes aux lignes directrices des National Institutes of Health et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université d'État du Montana.
1. Instillation intratrachéale
<ol><li>Préparez un espace de travail contenant les fournitures suivantes : une plate-forme d'intubation, une seringue stérile de 1 ml, des forceps émoussés stériles, une aiguille émoussée stérile de 21 calibres et deux tubes coniques pour entreposer la seringue et les forceps. REMARQUE : Les plates-formes d'intubation peuvent être achetées commercialement ou construites à l'interne. La plate-forme d'intubation utilisée ici a été construite en utilisant 0,25 pouce de plexiglas. En bref, la chaleur a été appliquée sur le plexiglas et la planche est pliée à un angle intérieur approximatif de 65 degrés. Du côté extérieur de la plate-forme d'intubation, deux vis de machine ont été ensemiées à 3 pouces l'une de l'autre et une bande de caoutchouc a été suspendue entre les deux vis.</li>
	<li>Préparer l'inoculum pathogène en diluant en série l'échantillon de façon à ce que la concentration finale désirée soit obtenue dans un volume total de 50 L. Entreposez l'inoculum sur la glace.</li>
	<li>En portant des gants stériles, pliez une aiguille à pointe émoussée de 21 G à environ 35 degrés. REMARQUE : Une aiguille séparée est nécessaire pour chaque souris.</li>
	<li>Fixer l'aiguille pliée de 21 G à bout émoussé sur une seringue de 1 ml. Dessiner un coussin d'air de 100 l dans la seringue suivi de 50 l de l'agent infectieux. Placez l'aiguille et la seringue chargées dans un endroit facilement accessible par la main dominante.</li>
	<li>Anesthésiez profondément une souris à l'aide d'un mélange isoflurane/oxygène de 4 % ou d'une méthode d'anesthésie similaire approuvée par l'IACUC. La profondeur d'anesthésie appropriée est généralement obtenue lorsque les taux de respiration ralentissent à environ 1 inhalation par 5-8 s et peuvent être confirmées en pinçant un appendice et en n'observant aucune réaction de la souris. REMARQUE : Cette méthode d'anesthésie a fourni une durée d'anesthésiation suffisante d'environ 1,5 min. Cela était suffisant pour que les membres de notre laboratoire apprennent et exécutent cette procédure d'instillation; cependant, d'autres méthodes d'anesthésie approuvées par l'institution peuvent être employées11,12,13.</li>
	<li>Retirez la souris anesthésié de la chambre d'anesthésie et suspendez la souris sur la plate-forme d'intubation des inciseurs maxillaires.</li>
	<li>Pour ouvrir un passage clair dans la trachée, utilisez les forceps à pointe émoussée pour saisir doucement et étendre la langue à l'extérieur de la bouche. Transférer la langue des forceps dans le pouce et l'index de la main non dominante.</li>
	<li>Restez en tenant la langue dans la main non dominante et prenez la seringue préchargée. Pointez l'extrémité pliée de l'aiguille loin du corps et insérez l'aiguille dans la cavité buccale à la base de la langue.</li>
	<li>Avec l'aiguille à la base de la langue, inclinez doucement le poignet pour provoquer une légère poussée de l'aiguille loin du corps. Cette étape assure l'aiguille sera insérée dans la trachée et non dans l'œsophage.</li>
	<li>Guidez lentement l'aiguille vers le bas dans la trachée ; souvent une légère tique est ressentie lorsque l'aiguille passe à travers le pli vocal. Passer l'aiguille à travers la trachée jusqu'à ce qu'une légère résistance soit ressentie lorsque l'aiguille rencontre la carina.</li>
	<li>Soulevez légèrement l'aiguille dans la direction proximale pour suspendre l'aiguille au-dessus de la carina. Cela permet l'administration dans les deux bronches primaires. Déprimez complètement le piston de la seringue pour livrer la charge infectieuse. Retirer l'aiguille de la trachée en soulevant vers le haut et jeter.</li>
	<li>Retirez la souris de la plate-forme d'intubation en déprimant l'élastique, mais maintenez la souris en position verticale. Obstruer les voies respiratoires nasales en plaçant un doigt directement sur les nares. Maintenez cette position pendant environ 1 min ou jusqu'à ce que plusieurs respirations profondes soient observées. REMARQUE : Cette dernière étape garantit que le volume total d'inoculum est livré dans les voies respiratoires inférieures.</li>
	<li>Remettre la souris dans sa cage et observer un rétablissement complet de l'anesthésie.</li>
</ol>2. Excision des poumons infectés
<ol><li>Travailler dans une hotte à débit laminaire pour maintenir la stérilité, préparer un espace de travail avec les éléments suivants: une balance et un bateau de pesée stérile, une plate-forme de dissection, un kit de dissection contenant des ciseaux et des forceps, stérile RNAse-free PBS, et gaze stérile.</li>
	<li>Euthanasiez une souris infectée avec le CO2 ou la méthode d'euthanasie approuvée par l'IACUC.</li>
	<li>Placez une souris infectée sur une plate-forme de dissection et fixez la souris à l'aide de broches à la fin de chaque appendice. Vaporiser la souris avec de l'éthanol pour aider à maintenir la stérilité des surfaces de travail.</li>
	<li>À partir de l'ombilic, utilisez une paire de forceps pour soulever la peau et faire une incision jusqu'à la base de la trachée. Saisir la peau de chaque côté de l'incision initiale, tirer la peau loin du corps et couper à travers les connexions tissulaires. REMARQUE: Il peut être utile de faire plusieurs coupes latérales à travers la peau pour révéler plus de la région thoracique.</li>
	<li>À partir de la base du processus xiphoïde, faire une petite incision avec l'intention de perforer le diaphragme. Il en résulte une augmentation de la pression dans la cavité thoracique qui provoque les poumons à se rétracter. Avec les poumons rétractés continuer l'incision pour libérer le diaphragme.</li>
	<li>Retirez les côtes en faisant une incision le long des deux côtés de la cage thoracique. Ceci exposera entièrement la cavité thoracique et les poumons.</li>
	<li>Pour exciser les poumons, saisissez la base du cœur avec les forceps et soulevez vers le haut. Placez les ciseaux derrière les poumons et commencer à faire de petites incisions à travers les connexions tissulaires tout en continuant à soulever le cœur vers le haut.</li>
	<li>Une fois que les poumons ont été excisés, placez-les sur la gaze stérile et enlevez le cœur. Le cœur peut être facilement enlevé en le soulevant loin des poumons avec les forceps et en coupant les connexions tissulaires restantes.</li>
	<li>Transférer les poumons sur un bateau à pesée pré-tared et enregistrer le poids.</li>
	<li>Une fois les poumons pesés, transférez-les dans des salins tamponnés par phosphate stérile (PBS) et entreposez-les temporairement sur la glace jusqu'à ce qu'ils aillent de l'avant aux étapes de récupération et d'analyse des agents pathogènes.</li>
</ol>3. Récupération et analyse des agents pathogènes
<ol><li>Poursuivant le travail au sein d'une hotte à débit laminaire, préparez un espace de travail avec les fournitures suivantes : un broyeur de tissus, un PBS stérile sans RNAse, un tampon RLT complété par du mercaptoéthanol (1:100) et des tubes microcentrifugeurs sans RNAse de 1,5 mL. ATTENTION : Le mercaptoéthanol peut être dangereux en cas de contact cutané, d'ingestion, de contact visuel ou d'inhalation. La dilution du mercaptoéthanol en tampon RLT doit être effectuée dans un capuchon à fumée.</li>
	<li>Commencez par ajouter 1 ml de PBS stérile sans RNAse au broyeur de tissu. Une fois rempli, entreposer le broyeur de tissu sur la glace.</li>
	<li>Préparer une série de tubes de dilution série stériles exempts de RNAse qui seront utilisés pour quantifier la charge bactérienne récupérée dans les poumons infectés. Ceci est plus facilement accompli en attelant 900 l d'eau stérile dans chaque tube de microcentrifuge, suivi d'une dilution en série de l'inoculum pathogène. REMARQUE : Le nombre de tubes de dilution nécessaires à l'énumération exacte des agents pathogènes variera en fonction de l'apport initial des agents pathogènes et de la durée de l'infection. Cela doit être déterminé empiriquement.</li>
	<li>À l'aide de forceps stériles, transférer les poumons dans le broyeur de tissus préparé et homogénéiser soigneusement le tissu en appuyant sur le piédestal en tournant.</li>
	<li>Ouvrez le broyeur de tissu et l'aliquot 100 l de l'échantillon homogénéisé dans le premier des tubes de dilution sériels préparés. Diluer en série les échantillons et énumérer les UFC en placage sur l'agar nutritif. Les UFC peuvent être enregistrés comme DesFC/mL ou CFU/mL/mg de tissu pulmonaire. REMARQUE : À cette étape, 200 oL supplémentaires de l'échantillon homogénéisé peuvent être prélevés pour la purification de l'ARN viral (voir tableau des matériaux)ou stockés à -80 oC pour une analyse future.</li>
	<li>Après que les aliquots ont été enlevés pour la détermination de CFU et/ou l'isolement viral d'ARN, remplacez le piédestal de broyage et granulent le tissu homogénéisé par centrifugation à 4.000 tr/min (3724 x g)pendant 10 min à 4 oC.</li>
	<li>À l'aide d'une pipette, retirer le supernatant de l'échantillon de granulés et le placer dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. REMARQUE : Le supernatant est exempt de bactéries et peut être stocké à -80 oC pour l'analyse des facteurs pathogènes solubles de l'hôte et sécrétés.</li>
	<li>Resuspendre la pastille de tissu homogénéisée par pipetting ou vortexing dans 700 'L de tampon RLT---mercaptoethanol et transférer l'échantillon à un tube stérile rnAse-free 1.5 mL microcentrifuge tube. REMARQUE : À ce stade, les échantillons peuvent être stockés à -80 oC pendant plusieurs mois.</li>
	<li>Purifiez l'ARN en utilisant de légères modifications au protocole du fabricant d'un kit de purification (voir Tableau des matériaux); voir Voyich et al. 200814.<ol>
<li>Transférer la boue pulmonaire homogénéisée dans un tube microcentrifuge de 2 ml contenant des perles de silice de 0,1 mm et traité par l'intermédiaire d'un batteur de perles pour 20 s à 6 m/s.</li>
		<li>Centrifuger l'échantillon à 1 500 tr/min pendant 3 minutes. Après centrifugation, pipette le supernatant dans le nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 ml.</li>
		<li>Ajouter 350 l d'éthanol à 96 % à 100 % d'éthanol à l'échantillon et bien mélanger par pipetting ou inversion.</li>
		<li>Transférer 700 l'échantillon dans une colonne de purification placée dans un tube de collecte de 2 ml. Centrifuger l'échantillon à 8 000 x g pour 15 s et jeter le flux. Exécutez tout échantillon excédentaire à travers la même colonne que décrit ci-dessus.</li>
		<li>Laver la colonne avec 700 l d'échantillon tampon RW1 et centrifugeuse à 8 000 x g pour 15 s. Jetez le flux à travers et transférez la colonne de la membrane de silice dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.</li>
		<li>Appliquer 500 l de RPE tampon sur la colonne. Laver la colonne par centrifugation à 8 000 x g pour 15 s. Jetez le flux.</li>
		<li>Appliquer 500 L supplémentaires d'EPR tampon sur la colonne RNeasy et la centrifugeuse à 8 000 x g pendant 2 min. Jeter le flux à travers et centrifuger la colonne à 10 000 x g pendant 1 min.</li>
		<li>Pour élifier l'ARN purifié, commencez par transférer la colonne à un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 mL exempt de RNAse. Pipette 50 'L d'eau sans RNase directement sur la membrane silice-gel de la colonne et de la centrifugeuse à 8000 x g pendant 1 min. REMARQUE: L'ARN élucidé peut être exécuté sur la même colonne à nouveau pour augmenter le rendement de l'ARN.</li>
		<li>Ajouter 50 l'eau sans RNase à l'ARN purifié pour porter le volume total à 100 l. Aliquot 350 L RLT----mercaptoethanol suivi de 250 'L de 96%-100% d'éthanol à l'échantillon et mélanger soigneusement par pipetting ou inversion.</li>
		<li>Appliquer l'échantillon sur une colonne de purification placée dans un tube de collecte et une centrifugeuse à 8 000 x g pour 15 s. Jetez le flux et remplacez le tube de collecte.</li>
		<li>Laver la colonne en ajoutant 350 l de tampon RW1 suivi d'une centrifugation à 8000 x g pour 15 s.</li>
		<li>Préparer une solution DNase contenant environ 27 unités Kunitz en ajoutant 10 l de stock de DNase (750 unités Kunitz/mL) à 70 'L de RDD tampon. Ajouter 80 l de solution DNase directement sur la membrane silice-gel et incuber l'échantillon pendant 15 min à température ambiante.</li>
		<li>Laver la colonne avec 350 l de tampon RW1 et centrifugeuse à 8000 x g pour 15 s et jeter le flux à travers.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.9.6-3.9.8 pour purifier l'ARN. REMARQUE : Il est recommandé de répéter la procédure de nettoyage de l'ARN en suivant les étapes 3.9-3.9.10 et 3.9.6-3.9.8 (sauter les étapes de DNase 3.9.11-3.9.13). Ce nettoyage supplémentaire, il se traduit par un ARN de très haute qualité.</li>
	</ol></li>
	<li>Le rendement de l'ARN peut être quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre avec des lectures à 260 nM pour déterminer la concentration et 260:280 nM pour la pureté. Une fois le rendement de l'ARN obtenu, normaliser la concentration de chaque échantillon d'ARN à 50 ng/L. REMARQUE : Il est recommandé de faire plusieurs aliquots à une concentration de 50 ng/L pour éviter les cycles de gel/dégel qui peuvent mener à la dégradation de l'ARN.</li>
	<li>Entreposez l'ARN purifié à -80 oC ou utilisez-le immédiatement pour l'analyse de la transcription. REMARQUE : Dans les publications précédentes, l'ARN de 3 à 5 souris a été mis en commun pour l'analyse de transcription. Grâce à l'optimisation de la technique ci-dessus, l'ARN de 1 souris a été déterminé empiriquement comme suffisant pour l'analyse de transcription (80-120 ng/L).</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'utilisation de ce modèle fournit une méthode très efficace et reproductible pour étudier les infections bactériennes secondaires. La capacité de contrôler étroitement la livraison de l'inoculum pathogène permet des observations plus précises des effets individuels et combinatoires de chaque agent pathogène. Les inefficacités dans la voie d'instillation intranasale plus commune ont probablement contribué aux écarts dans les volumes de dose et les concentrations présentes dans la littérature. Il est raisonnable que l'absence d'un système murin précis pour étudier la pneumonie bactérienne secondaire a retardé les résultats identifiant les réponses bactériennes spécifiques qui contribuent à la sévérité des co-infections pulmonaires. L'élaboration d'un modèle reproductible pour étudier l'expression de la virulence lors d'infections bactériennes secondaires pourrait mener à l'identification de cibles vaccinales ou médicamenteuses pour améliorer ces infections.
L'étape d'instillation intratrachéale est essentielle pour établir avec succès une infection des voies respiratoires inférieures et toute analyse en aval des agents pathogènes. Lors de l'apprentissage de cette technique, il peut être utile de pratiquer l'utilisation d'un colorant (tel que décrit dans les méthodes) avant d'administrer du matériel infectieux. L'utilisation d'un colorant permet la visualisation directe de l'inoculum dans les voies respiratoires. Une erreur commune qui peut se produire est l'insertion de l'aiguille émoussée dans l'œsophage plutôt que la trachée. Cela se traduira par la livraison de l'inoculum dans l'estomac plutôt que les poumons. Pour corriger cette erreur, inclinez l'aiguille plus loin du corps et passez-la dans la trachée. Une fois maîtrisée, cette procédure est très efficace et peut être utilisée pour mener des expériences avec un grand nombre de souris. Travaillant par lots pour anesthésier les souris, l'instillation intratrachéale peut être complétée en environ 30 secondes par souris. En outre, l'excision des poumons peut être complétée en 2 à 3 minutes par souris.
Le rétablissement de l'ARN bactérien viable et pur des tissus infectés est critique pour l'analyse de transcription. Les NAD sont omniprésents et peuvent rapidement ruiner une expérience15. Certaines méthodes comprennent l'utilisation d'inhibiteurs de la NAd; cependant, nous avons constaté que le gel de l'échantillon à -80 oC dans le rLT-MD-mercaptoéthanol ou le traitement immédiat de l'échantillon pour l'isolement de l'ARN à l'aide de tous les tubes et réactifs libres de RNase sont efficaces pour réduire la contamination par la RNase. En outre, nous recommandons qu'un maximum de six échantillons soient purifiés en même temps. L'inclusion de plus de six échantillons peut entraîner des latences prolongées entre les étapes du protocole qui peuvent aboutir à la dégradation de l'ARN. Une fois purifié, il faut également prendre soin d'éviter tout cycle inutile de gel-dégel. Par conséquent, si plusieurs analyses sont effectuées sur un échantillon, il est recommandé d'aliquage de l'ARN purifié pour le stockage à -80 oC.
En plus des techniques examinées ci-dessus, cette méthode peut être complétée par l'exécution du lavage alvéolaire bronchique avant l'excision et l'homogénéisation des poumons16. Ceci peut être accompli par lavage de l'ensemble des voies respiratoires inférieures ou en utilisant le fil de suture pour restreindre un bras branchant de l'arbre bronchique suivi du lavage par la branche restante. Souvent, cela conduit à une réduction de la récupération de la charge pathogène, mais fournit un échantillon sur lequel des informations telles que l'activité de déshydrogénase de lactate, l'identité de la population cellulaire, et les profils de cytokine peuvent être obtenus16. Ensemble, ces données peuvent former une compréhension plus complète des interactions hôte-pathogène qui se produisent pendant la pneumonie bactérienne secondaire.
Tandis que les méthodes discutées ont été dans le contexte de la pneumonie bactérienne secondaire, elles sont appropriées pour être étendues à n'importe quel modèle murine de l'infection respiratoire inférieure ; en particulier, ceux qui bénéficieraient d'une livraison et d'une récupération étroitement contrôlées de l'inoculum installé. En outre, comme beaucoup d'autres voies d'infection, l'instillation intratrachéale peut être employée dans des applications non infectieuses, telles que l'administration des produits thérapeutiques et des composés environnementaux12.

La pneumonie bactérienne secondaire à la suite d'une infection grippale est l'une des principales causes de décès aux États-Unis et un domaine actif de recherche1,2. Malgré de nombreuses études utilisant des modèles murins de pneumonie bactérienne secondaire, les incohérences concernant l'instillation et l'interrogatoire des agents pathogènes restent3,4,5. En outre, alors que de nombreux efforts antérieurs se sont concentrés sur les effets immunomodulatoires de la grippe qui conduisent à une augmentation susceptiblement à l'infection bactérienne secondaire, des données plus récentes suggèrent que la régulation de la virulence de l'agent pathogène bactérien est égale contribuer à l'établissement de la maladie6,7,8,9. Ces nouvelles données nécessitent une méthode plus précise pour explorer la pneumonie bactérienne secondaire dans les modèles murins de co-infection qui facilitent l'investigation sur la réponse d'agent pathogène.
Unique aux modèles de co-infection grippale, les organismes hôtes sont intentionnellement immunodéprimés par une infection grippale primaire avant l'administration de l'agent bactérien secondaire. Afin de reproduire au mieux la pathogénie de la maladie observée chez les hôtes humains, il est impératif que la charge pathogène des agents primaires et secondaires soit contrôlée afin d'observer les effets individuels et combinatoires de chaque agent infectieux. Le plus souvent, les infections respiratoires chez les souris ont été établies par une administration intranasale3,4,5,6,10. Dans la mesure où cette voie est notée pour être techniquement simple et peut être appropriée dans certaines applications d'infection à agent unique, elle n'est pas adaptée aux modèles de co-infection, car les procédures d'instillation, les volumes de dose et l'efficacité sont très variables au sein littérature publiée3,4,5,6.
Pour mieux comprendre la pathogénie secondaire de la pneumonie bactérienne, il faut tenir compte des contributions de l'hôte et de l'agent pathogène. À cette fin, nous avons développé une approche simple et reproductible pour la récupération des bactéries viables et de l'ARN pathogène des poumons infectés. Cette méthode utilise une procédure d'instillation intratrachéale simplifiée et non invasive suivie d'un isolement ultérieur de l'ARN bactérien. La procédure d'instillation intratrachéale décrite ci-contre est similaire aux méthodes décrites précédemment et ne se limite pas à la livraison d'agents pathogènes11,12,13. L'utilisation de cette procédure particulière bénéficie d'être à faible coût et ne nécessite pas l'utilisation d'équipementspécialisé tels que des canules, des fils de guidage, ou un câble à fibres optiques; en outre, parce que cette procédure est non-invasive il assure l'effort minimal sur des sujets murins, minimise une réponse inflammatoire de la mécanique d'inoculation, et fournit une voie efficace d'accouchement pour l'infection des sujets multiples. En bref, les souris anesthésiées isoflurane sont suspendues des incisifs. Les forceps sont utilisés pour saisir doucement la langue suivie de l'insertion d'une aiguille pliée, à pointe émoussée et à pointe émoussée dans la trachée et de la livraison de la charge pathogène. La validation de cette procédure est démontrée par la confirmation visuelle du colorant également distribué dans le compartiment pulmonaire et la récupération de la charge bactérienne. Nous démontrons alors comment récupérer le Staphylococcus aureus viable (S. aureus) des poumons infectés et décrions une méthode reproductible pour isoler l'ARN pathogène de haute qualité.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix B</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>6911100</td>
			<td>Referred to in text as &#34;0.1 mm silica beads&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-gauge blunt needle</td>
			<td>SAI</td>
			<td>B21-150</td>
			<td>1.5&#34; is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>DNase used in the accompanying text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 Classic Instrument</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116004500</td>
			<td>FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as &#34;Bead Beater&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan AIV-Matrix Reagents</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4405543</td>
			<td>Influenza A M-segment qRT-PCR kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MES-01</td>
			<td>Referred to in text as &#34;intubation platform.&#34; Intubation platform used in the accompanying video was made in house.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td>Viral RNA purification kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Grinders</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-542-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (&#946;-Mercaptoethanol)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>UN2966</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a precise pathogen delivery and recovery system for murine models of secondary bacterial pneumonia

Les pneumonies bactériennes secondaires à la suite d'infections grippales se classent systématiquement parmi les dix principales causes de décès aux États-Unis. Jusqu'à présent, les modèles murins de co-infection ont été le principal outil développé pour explorer les pathologies des infections primaires et secondaires. Malgré la prévalence de ce modèle, des écarts considérables en ce qui concerne les procédures d'instillation, les volumes de doses et les efficacités sont répandus dans les études. En outre, ces efforts ont été largement incomplets dans la façon dont l'agent pathogène peut influencer directement la progression de la maladie après l'infection. Ici nous fournissons une méthode précise de livraison, de récupération, et d'analyse d'agent pathogène à utiliser dans les modèles murins de pneumonie bactérienne secondaire. Nous démontrons que l'instillation intratrachéale permet une livraison efficace et précise des volumes contrôlés directement et uniformément dans les voies respiratoires inférieures. Les poumons peuvent être excisés pour récupérer et quantifier le fardeau pathogène. Après l'excision des poumons infectés, nous décrivons une méthode pour extraire l'ARN pathogène de haute qualité pour l'analyse transcriptionnelle suivante. Cette procédure bénéficie d'être une méthode non chirurgicale de livraison sans l'utilisation d'équipement de laboratoire spécialisé et fournit une stratégie reproductible pour étudier les contributions d'agent pathogène à la pneumonie bactérienne secondaire.

La figure 1 utilise une solution bleue brillante Coomassie de 0,1 % pour démontrer qu'une instillation intratrachéale délivre l'inoculum directement et uniformément dans les voies respiratoires inférieures. La figure 2 montre que les bactéries (S. aureus) CFUs récupérées directement à partir de tissus pulmonaires homogénéisés. La figure 3 démontre l'utilisation de ce système pour la livraison et la récupération précises de l'inoculum dans les voies respiratoires inférieures en traçant l'entrée et la récupération des UFC à partir de souris individuelles. La figure 4 montre la courbe d'amplification qRT-PCR du gyrB du gène d'entretien ménager bactérien pour démontrer que l'ARN bactérien peut être extrait directement du tissu pulmonaire infecté avec une contamination minimale par l'ADN. La figure 5 montre la construction d'une courbe standard utilisant l'amplification qRT-PCR du segment M du virus de la grippe A pour démontrer que l'ARN viral peut être extrait directement des tissus pulmonaires infectés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig01.jpg"> Figure 1 : L'instillation intratrachéale permet une distribution uniforme dans les voies respiratoires inférieures. (A, B) Les poumons non infectés ont été excisés d'une souris saine suivant l'instillation intratracheal du PBS stérile et photographiés des perspectives ventrales de (A) et (B) ). (C, D) 50 'L d'une solution bleue brillante de 0.1% de Coomassie ont été administrées à une souris anesthésié par l'intermédiaire de l'administration intratrachéale. (C) Dorsal. (D) Ventral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig02.jpg"> Figure 2 : Récupération représentative des UFC bactériennes à partir de l'homogénéisation pulmonaire infectée. Les poumons ont été excisés un jour après le défi avec S. aureus. Après homogénéisation, 100 ll de boue pulmonaire ont été dilués en série à 10-6. Pour énumérer les UFC récupérés, 10 gouttes de L ont été plaquées à partir des dilutions de 10-5 et 10-6 sur l'agar de soja tryptique (TSA) et incubées à 37 oC avec 5 % C02 pendant la nuit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig03.jpg"> Figure 3 : Livraison et récupération précises de l'inoculum pathogène après administration intratrachéale. Les souris ont été divisées en deux groupes contenant trois souris par groupe. Les souris ont été soumises à l'instillation intratracheal de S. aureus à 1 x 108 (bas) et 2 x 108 (haut) CFU/mL. Une heure après l'infection, les souris ont été euthanasiées et les poumons ont été excisés pour démontrer la précision de l'instillation et de la récupération. L'inoculum bactérien et les bactéries récupérées de l'homogénéisme pulmonaire ont été plaqués sur TSA (agar de soja tryptique). Aucune différence significative n'a été rapportée entre l'entrée bactérienne et la récupération. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig04.jpg"> Figure 4 : Récupération et pureté de l'ARN bactérien représentatif. Six heures suivant l'instillation intratracheal avec 1 x 108 CFU/50 de S. aureus,les souris ont été euthanasiées. Les poumons ont été excisés et homogénéisés, suivis d'une suspension de la boue pulmonaire dans le tampon RLT-MD-mercaptoéthanol. L'ARN a été purifié comme décrit à l'étape 3.914. qRT-PCR a été employé pour détecter des transcriptions du gyrB bactérien de gène d'entretien ménager. Un contrôle ne contenant aucune transcriptase inversée (NRT) a été inclus pour démontrer la pureté de l'ARN récupéré. À un seuil de 0,1, les transcriptions gyrB ont été détectées à un cycle moyen de 21,1, 20,3 et 20,5. les contrôles de TRN n'ont pas été détectés jusqu'à ce que le cycle soit en moyenne de 35,9, 35,5 et 35,0. n 3 répliques biologiques, contenant 3 répliques techniques/réplique biologique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig05.jpg"> Figure 5 : Récupération virale représentative de l'ARN. Six jours après l'instillation intratrachéale avec 100 PFU/50 l de grippe A/PR/8/1934 (H1N1), les souris ont été euthanasiées. Les poumons ont été excisés et homogénéisés, et 200 L de la boue homogénéisée ont été collectées et passées par une passoire cellulaire de 70 m avant la purification virale de l'ARN. L'ARN purifié a été dilué en série (10-1-10-4) suivi de l'amplification du segment M de la grippe A. (A) Parcelle d'amplification de l'ARN de la grippe A récupérée d'un poumon infecté et diluée 10-1-10-4. (B) Courbe standard de la grippe A M-segment. Seuil de 0,2, R2 à 0,994, pente -3,46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Ici, nous présentons des méthodes pour améliorer les études secondaires de pneumonie bactérienne en fournissant une voie non-invasive de l'instillation dans les voies respiratoires inférieures suivies du rétablissement d'agent pathogène et de l'analyse de transcription. Ces procédures sont reproductibles et peuvent être effectuées sans équipement spécialisé tel que des canules, des fils de guidage, ou des câbles de fibre optique.

Un système précis de livraison et de récupération d'agents pathogènes pour les modèles murines de pneumonie bactérienne secondaire

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer les études secondaires sur la pneumonie bactérienne en fournissant une voie simple et non invasive de l’inoculation bactérienne dans les voies respiratoires inférieures suivie de la récupération bactérienne et la purification de l’ARN pour l’analyse des transcriptions. Ceci sera accompli en anesthésiant d’abord profondément une souris et en insérant une aiguille pliée émoussée préchargée dans la trachée d’une souris qui a été verticalement suspendue des incisives maxillaires. Deuxièmement, à la suite d’une infection réussie, les unités bactériennes formant des colonies sont récupérées par excision et homogénéisation des poumons.L’homogénéisation pulmonaire qui en résulte est diluée en série et plaquée sur une agar nutritive pour énumérer les unités formant des colonies. Enfin, l’ARN est purifié à partir de l’homogénéisation pulmonaire. Les avantages de cette procédure est qu’elle permet une livraison contrôlée directement dans les voies respiratoires inférieures.Cela nous permet d’examiner à la fois les contributions combinatoires et individuelles de l’agent pathogène vers l’issue de la maladie. Les progrès récents dans ce domaine ont démontré que la régulation des gènes bactériens peut avoir un rôle important dans la détermination des résultats de l’infection. Cette technique bénéficie de la capacité de récupérer à la fois les FC bactériennes, puis l’ARN.Une fois que l’ARN est isolé, nous pouvons alors évaluer les contributions de gènes de virulence spécifiques vers l’infection. En outre, cette technique bénéficie d’être non chirurgicale. Cela permet de mettre un minimum de stress sur tous les animaux utilisés dans le cadre de cette procédure et leur permet d’avoir un rétablissement immédiat.Cette procédure bénéficie de l’utilisation d’équipements de laboratoire communs sans l’utilisation de tout type de cannulas, fils de guidage ou câbles à fibre optique. Les personnes nouvelles à cette technique peuvent lutter dans un premier temps avec l’installation réelle à travers la trachée. Une fois cette technique conceptualisée, elle devient une procédure simple et efficace pour interroger la pneumonie bactérienne secondaire au sein d’un hôte murin.Avant de commencer la procédure, préparez l’espace de travail avec les fournitures suivantes : une plate-forme d’intubation, une seringue stérile d’un mL, des forceps stériles à pointe émoussée, une aiguille stérile à pointe émoussée de calibre 21 et deux tubes coniques pour ranger la seringue et les forceps. Commencez la procédure en préparant les inoculums pathogènes de sorte que la concentration finale désirée soit obtenue dans un volume de 50 microlitres. Ensuite, à l’aide de gants stériles préparer une aiguille de 1 à 1,5 pouce de 21 jauges à pointe émoussée en la pliant à un angle d’environ 35 degrés.Après avoir fixé l’aiguille à la seringue, dessiner un coussin d’air de 100 microlitres, suivi de 50 microlitres de l’agent infectieux. Le coussin d’air de 100 microlitres assure la pleine livraison de la charge pathogène une fois que la seringue est déprimée. Placez l’aiguille et la seringue chargées dans un endroit facilement accessible par la main dominante.Retirer et anesthésier la souris de la chambre d’anesthésie et suspendre la souris sur la plate-forme d’intubation des incisives maxillaires. À l’aide des forceps à pointe émoussée, saisir délicatement et étendre la langue. Transférer la langue des forceps dans le pouce et l’index de la main non dominante.Maintenez la langue dans la main non dominante et prenez la seringue préchargée. Pointez l’extrémité pliée de l’aiguille loin du corps. Insérer l’aiguille dans la cavité buccale.À la base de la langue, inclinez doucement le poignet pour provoquer une légère poussée de l’aiguille loin du corps. Cette action garantit que l’aiguille sera insérée dans la trachée et non dans l’œsophage. Guidez lentement l’aiguille vers le bas dans la trachée.Souvent, une légère tique se fait sentir lorsque l’aiguille traverse le pli vocal. Passer l’aiguille à travers la trachée jusqu’à ce qu’une légère résistance se fait sentir lorsque l’aiguille rencontre la carina. Soulevez légèrement l’aiguille dans la direction ascendante pour suspendre l’aiguille au-dessus de la carina.Cela permet la livraison dans les bronches primaires. Déprimez complètement le piston de seringue pour livrer la charge infectieuse. Retirer l’aiguille de la trachée et jeter.Retirez la souris de la plate-forme d’intubation en déprimant l’élastique, mais maintenez la souris en position verticale. Obstruer les voies respiratoires nasales en plaçant un doigt directement au-dessus des nares. Maintenez cette position pendant environ une minute ou jusqu’à ce que plusieurs respirations profondes soient observées.Cette dernière étape garantit que le volume total d’inoculum est livré dans les voies respiratoires inférieures. Retournez l’animal dans sa cage et assurez-vous qu’il y a un rétablissement rapide de l’anesthésie. À certains moments, après l’infection, les poumons infectés peuvent être excisés pour quantifier et évaluer les contributions bactériennes à l’augmentation des morbidités associées à la pneumonie bactérienne secondaire.Préparez un espace de travail avec les éléments suivants : balance et bateau de pesage stérile, plate-forme de dissection, kit de dissection contenant ciseaux et forceps, et gaze stérile. Pour les besoins de cette démonstration, l’excision des poumons sera effectuée sur un banc. Cependant, afin de maintenir la stérilité tout au long de cette procédure, il est recommandé que l’excision pulmonaire soit effectuée dans un capot d’écoulement laminaire.Euthanasier une souris infectée avec du CO2 ou une méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC similaire. Placez et fixez la souris infectée sur la plate-forme de dissection. Vaporiser la souris d’éthanol pour maintenir la stérilité sur les surfaces de travail.À partir de l’ombilicus, utilisez une paire de forceps pour soulever la peau et faire une incision vers le larynx. Saisir la peau de chaque côté de l’incision initiale, tirer la peau loin du corps et couper à travers les connexions tissulaires. Il peut être utile de faire des coupes latérales à travers la peau pour révéler plus de la région thoracique.À partir de la base du processus xiphoïde, faire une petite incision avec l’intention de percer le diaphragme. Il en résulte une augmentation de la pression dans la cavité thoracique provoquant la rétractation des poumons. Avec les poumons rétractés, continuer l’incision pour libérer le diaphragme.Retirer les côtes en faisant une incision de chaque côté. Cela exposera la cavité thoracique et les poumons. Pour exciser les poumons saisir la base du cœur avec les forceps et soulever vers le haut.Placez les ciseaux derrière les poumons et commencer à faire de petites incisions à travers les connexions tissulaires tout en continuant à soulever le cœur vers le haut. Une fois que les poumons ont été excisés, placez-les sur une gaze stérile et retirez le cœur en le soulevant des poumons et en coupant les connexions tissulaires restantes. Transférez les poumons sur le bateau de peser pré-goudronné et enregistrez la masse.Une fois que les poumons ont été pesés, transférez les poumons dans une solution saline stérile tamponnée de phosphate et rangez-les temporairement sur la glace. Maintenant que les poumons ont été excisés et pesés, les bactéries peuvent être récupérées pour déterminer leur rôle vers la pathogénie. En préparation de la récupération bactérienne, les fournitures suivantes seront nécessaires : un broyeur de tissus, un PBS stérile sans RNase, un RLT tampon complété par du bêta-mercaptoéthanol et des tubes de microcentrifugeuse sans RNase de 1,5 mL.Commencez par ajouter d’abord un mL de PBS stérile sans RNase au broyeur de tissu. Une fois rempli, conserver le broyeur de tissu sur la glace. Ensuite, préparez une série de tubes stériles de dilution en série sans RNase pour quantifier la charge bactérienne récupérée des poumons infectés.Transférer les poumons dans le broyeur de tissu préparé et bien homogénéiser le tissu en appuyant sur le piédestal tout en tournant. Ouvrez le broyeur de tissu et aliquot 100 microlitres de l’échantillon homogénéisé dans le premier des tubes de dilution en série préparés. Diluer en série les échantillons et les plaques sur l’agar nutritif pour énumérer les unités formant la colonie.Les FC peuvent être enregistrés sous forme d’FC par mL ou cfus par mL, par milligramme de tissu pulmonaire. Après l’enlever l’aliquot de 100 microlitres, remplacez le piédestal broyeur et centrifugez l’échantillon à 4000 rpm pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Lorsque la centrifugation est terminée, retirer le supernatant de l’échantillon granulé.Le surnatant peut être enregistré et stocké à moins 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie à une date ultérieure. Suspendre à nouveau la pastille tissulaire homogénéisée dans 700 microlitres de bêta-mercaptoéthanol RLT et transférer l’échantillon dans un tube stérile de centrifugeuse de 1,5 mL sans RNase. À ce stade, l’échantillon peut être stocké à moins 80 degrés.L’ARN peut être purifié à partir du lisier homogénéisé pulmonaire RLT en chargeant l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse de deux mL contenant des perles de silice de 1 millimètre et traité par un batteur de perles pendant 20 secondes à six mètres par seconde. L’ARN est alors immédiatement purifié à l’aide d’une adaptation de la méthode RNeasy telle que rapportée dans Voyich, et autres. Methods in Molecular Biology"2008, et décrit dans le manuscrit accompagnant cette vidéo.Après purification, le rendement en ARN peut être quantifié à l’aide d’un spectrophotomètre. Une fois quantifié, il est bénéfique de diluer l’ARN résultant en plusieurs aliquots de 50 nanogrammes par microlitre. Cela permet à l’ARN de l’échantillon d’être utilisé pour de multiples analyses sans être soumis à plusieurs cycles de gel-dégel.L’utilisation de cette technique permet l’installation d’une charge agent pathogène contrôlée directement dans les voies respiratoires inférieures. L’efficacité de ce système de livraison peut être démontrée par l’installation d’une solution bleue brillante coomassie à 1%. La rangée supérieure affiche une paire de poumons non infectés pour servir de contrôle, tandis que la rangée inférieure affiche une paire de poumons qui ont reçu 50 microlitres de la teinture bleue brillante Coomassie 1% grâce à une installation intratracheal.L’utilisation de ce colorant montre comment l’installation intratracheal fournit une distribution uniforme de la charge pathogène dans et dans les poumons gauche et droit. Une fois infectée, la charge pathogène peut être récupérée et analysée à divers moments après l’installation intratrachéale par excision et homogénéisation du tissu pulmonaire. Pour démontrer l’efficacité de cette technique de rétablissement, deux groupes contenant trois souris chacune ont été infectés par une dose faible et élevée de Staphylococcus aureus.L’entrée bactérienne a été plaquée sur l’agar nutritif pour énumérer les FC. Une heure après l’installation intratrachéale, les souris ont été euthanasiées, les poumons excisés et homogénéisés dans un broyeur de tissu. Le tissu homogénéisé a été dilué en série et plaqué sur une agar nutritive pour énumérer les FC.L’ARN isolé du tissu pulmonaire homogénéisé peut être examiné par transcriptase inverse PCR et utilisé pour quantifier l’abondance relative de transcription des gènes cibles. Pour assurer une contamination minimale de l’ADN de fond, il est recommandé qu’une réaction PCR, sans ajout de transcriptase inverse, soit exécuté à côté de toute réaction qRT-PCR. En plus des charges bactériennes, cette technique peut être étendue à l’installation et à l’isolement des charges virales.Après l’homogénéisation du tissu pulmonaire, l’ARN viral peut être isolé et utilisé pour mesurer l’abondance de transcription des gènes viraux ou construire une courbe standard pour la quantification virale. L’utilisation de ce système fournit un système hautement efficace et reproductible pour étudier la pneumonie bactérienne secondaire. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être utilisée dans des expériences à grande échelle.Travaillant en lots pour euthanasier les souris, l’installation intratracheal peut se produire dans les 30 secondes par souris. Une fois cela terminé, passant à l’excision des poumons, cela peut être complété en environ deux à trois minutes par souris. Bien que les méthodes discutées ici aient été dans le contexte d’une infection bactérienne secondaire, elles peuvent être étendues à n’importe quelle procédure où une livraison contrôlée et la récupération d’un inoculum sont nécessaires.En plus des méthodes décrites ici, cette procédure peut être complétée par l’ajout d’un lavage bronchoalveolar avant l’excision des poumons. Bien que cela entraîne souvent une diminution de la récupération de la charge pathogène, il bénéficie de l’obtention de données, telles que l’analyse de cytokine, l’activité de déshydrogénase lactate, et l’identification de différentes populations cellulaires. Pour mieux comprendre la pathogénie de la maladie, il devient important d’interroger les contributions de l’hôte et des pathogènes à la maladie.Le but de cette vidéo était de fournir une méthode simple et efficace pour explorer la pneumonie bactérienne secondaire dans un hôte murin.

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